一種建立dse與玉米共生體系的液體培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種建立DSE與玉米共生體系的液體培養(yǎng)方法，屬于微生物學(xué)、植物營養(yǎng)學(xué)和生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]深色有隔內(nèi)生真菌(Dark Septate Endophytes, DSE)具有多樣的宿主植物和廣泛的生態(tài)分布，是植物根系的一個重要組成部分，在植物體中發(fā)揮著重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，對于DSE的研究逐漸深入，人們不再局限于了解DSE對植物生長及抗逆的影響，更進一步認識DSE的侵染機制以及DSE與植物的共生機理等成為研究的熱點和難點。然而，現(xiàn)有DSE與植物共生培養(yǎng)的方法主要是在開放或半開放的條件下進行無菌苗的盆栽接種，不僅易被其它雜菌污染，而且采用的培養(yǎng)基質(zhì)多為腐殖土、泥炭土、河沙或麥麩等，營養(yǎng)成分較為復(fù)雜，不利于DSE的生物學(xué)特性及共生體系的系統(tǒng)性研究，特別是在研究外源物質(zhì)與共生體系的關(guān)系時，無法確保培養(yǎng)基質(zhì)中外源物質(zhì)的均一性和有效性。此外，上述固體培養(yǎng)方法只有部分植物根系與DSE充分接觸，導(dǎo)致DSE在植物根部定殖率較低且均一性較差。因此，建立一個穩(wěn)定高效的、培養(yǎng)基質(zhì)成分明確均一的無污染共生體系迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術(shù)的不足而提供一種穩(wěn)定高效、培養(yǎng)基質(zhì)成分明確均一、培養(yǎng)體系無雜菌干擾的DSE與玉米共生體系的液體培養(yǎng)方法。
[0004]本發(fā)明建立的DSE與玉米共生體的液體培養(yǎng)方法，利用表面消毒的玉米種子培養(yǎng)無菌苗，利用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)DSE菌絲體，將玉米無菌苗與DSE菌絲體在無菌的液體培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)，建立無雜菌干擾的植物-真菌共生體系，主要包括下列步驟:
(1)玉米無菌苗的培養(yǎng):挑選大小一致的玉米種子，放置于體積比為75%的乙醇溶液中，浸泡5 min，取出種子，無菌水清洗3次；然后將種子放置于體積比為10%的次氯酸鈉溶液中，浸泡10 min，取出種子，無菌水清洗3次；表面消毒后的種子放置于無菌的濕潤濾紙上，每瓶2顆，于22°C下黑暗培養(yǎng)3天，萌發(fā)后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中，光照強度1800 Lux,光照時間和培養(yǎng)溫度分別為16/8 h，25/22 °C，空氣相對濕度70%，培養(yǎng)7天后，挑選生長一致的無菌苗備用；
(2)DSE接種劑的準(zhǔn)備:活化DSE菌株后，接種到PDA培養(yǎng)基的平皿中，28 0C下黑暗倒置培養(yǎng)15天；用打孔器沿菌落邊緣打成Φ6 mm菌塊作為接種劑備用；
(3)DSE與玉米共生體的建立:將上述步驟得到的菌塊和玉米無菌苗同時轉(zhuǎn)移到用于二者共培養(yǎng)的無菌三角瓶中，每個三角瓶放入一株無菌苗，5塊直徑為6 mm的接種劑，添加無菌液體培養(yǎng)基使其剛好浸沒幼苗根部，最后用無菌的PVA膜或PTFE膜封口，放置光照培養(yǎng)箱中，光照強度1800 Lux，光照時間和培養(yǎng)溫度分別為16/8 h，25/22 °C，空氣相對濕度70% ；三天后，用無菌剪刀給封口膜十字開口，使玉米的葉片剛好能伸出瓶外；培養(yǎng)過程中，每隔2天添加無菌液體培養(yǎng)基20 mL，每次使玉米根部恰好浸沒在培養(yǎng)基質(zhì)中； (4 )共生培養(yǎng)體系的檢測:共培養(yǎng)20天后，從三角瓶中取出玉米，用無菌水清洗玉米根部，取玉米側(cè)根放入試管中，加入質(zhì)量比為10%的KOH使根樣完全浸沒，放入水浴鍋中90 0C解離至根樣透明；經(jīng)乳酸中和、酸性品紅染色、乳酸甘油脫色后制片，于0LYPUS-BX51顯微鏡下觀察DSE的定殖情況并計算其定殖率；同時，表面消毒清洗干凈的玉米側(cè)根，用無菌剪刀將根樣剪成0.5 cm的片段，隨機選取20個貼到PDA培養(yǎng)基上，每個平皿5個片段，所有平皿在28 °^下黑暗正置培養(yǎng)25天；在顯微鏡下觀察制備的玻片，發(fā)現(xiàn)玉米根內(nèi)有大量菌絲定殖并形成DSE的典型結(jié)構(gòu)特征-微菌核；同時，從根樣中只分離得到與接種劑形態(tài)特征相同的DSE菌株，進一步表明DSE與玉米的共生體系成功建立。
[0005]上述步驟(3)中的共培養(yǎng)培養(yǎng)基質(zhì)為改良的1/2 MS液體培養(yǎng)基=NH4NO3 825 mg/L，KNO3 950 mg/L, CaCl2.2H20 220 mg/L，MgCl2.7H20 185 mg/L，KH2PO4 85 mg/L，KI 0.83mg/L，H2BO3 6.20 mg/L, MnSO4 4H20 22.30 mg/L, ZnSO4 7H20 8.60 mg/L, Na2MoO4 2H20 0.25mg/L，CuSO4 5H20 0.025 mg/L，CoCl2.6H20 0.025 mg/L，F(xiàn)eSO4 7H20 27.8 mg/L, Na2EDTA^H2O37.3 mg/L，去離子水，pH 5.8。
[0006]上述步驟(4)中玉米側(cè)根的表面消毒方法為:體積比70%的乙醇浸泡I min，無菌水清洗3次，體積比10%次氯酸鈉浸泡2 min,無菌水清洗3次，置于無菌濾紙上吸干水分。分離DSE的培養(yǎng)基為:PDA添加100 mg/L硫酸鏈霉素和氨芐青霉素。分離DSE的空白對照為:最后一次清洗根樣的無菌水涂到添加100 mg/L硫酸鏈霉素和氨芐青霉素PDA培養(yǎng)基上，28 °^黑暗正置培養(yǎng)，25天后不生長任何菌落。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:成功建立了 DSE與玉米無菌共培養(yǎng)液體體系，方法穩(wěn)定高效、基質(zhì)成分明確均一，為進一步研究DSE的侵染機制以及DSE與植物的共生機理等提供理想模型，同時為其它真菌與共生植物的研究提供方法借鑒。
【具體實施方式】
[0008]實施例1:
本實施例建立的DSE與玉米共生體的液體培養(yǎng)方法，利用表面消毒的玉米種子培養(yǎng)無菌苗，利用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)DSE菌絲體，將玉米無菌苗與DSE菌絲體在無菌的液體培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)，建立無雜菌干擾的植物-真菌共生體系，主要包括下列步驟:
1、將玉米種子B73 (公知全基因組數(shù)據(jù)庫)放置于體積比為75%的乙醇溶液中，浸泡5min，取出種子，無菌水清洗3次；將種子放置于體積比為10%的次氯酸鈉溶液中，浸泡10min，取出種子，無菌水清洗3次。表面消毒后的種子放置于無菌的濕潤濾紙上，在規(guī)格為Φ56 mmX Φ56 mmX91 mm (口徑X胸徑X高)的組培瓶中培養(yǎng)，每瓶2顆，于22 °C下黑暗培養(yǎng)3天，萌發(fā)后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中，光照強度1800 Lux，光照時間和培養(yǎng)溫度分別為16/8 h, 25/22 °C，空氣相對濕度70%，培養(yǎng)7天后，挑選生長一致的無菌苗備用。
[0009]2、取冷藏的試管斜面菌株H93 (嗜魚外瓶霉jOiscijOAiJa)活化，接種到PDA培養(yǎng)基的平皿中，28 °(:下黑暗倒置培養(yǎng)15天。用打孔器沿菌落邊緣打成Φ6 mm菌塊作為接種劑備用。此外，將部分菌塊轉(zhuǎn)移到干凈的平皿中，每個平皿5塊，121 0C高溫高壓間歇滅菌3次，每次2 h，作為空白對照。
[0010]3、配置改良的 1/2 MS 液體培養(yǎng)基(NH4NO3 825 mg/L，KNO3 950 mg/L，CaCl2'2H20220 mg/L，MgCl2.7H20 185 mg/L，KH2PO4 85 mg/L，KI 0.83 mg/L，H2BO3 6.20 mg/L,MnSO4 4H20 22.30 mg/L, ZnSO4 7H20 8.60 mg/L, Na2MoO4 2H20 0