專利名稱：一種用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物檢測(cè)的培養(yǎng)基，尤其涉及一種用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的
顯色培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
志賀氏菌屬(Shigella)屬于腸桿菌科,有四個(gè)種,分別為痢疾志賀氏菌gelladysenteriae)、福氏志賀氏菌{Shigellaflexneri)、鮑氏志賀氏菌{Shigellaboydii)、宋內(nèi)志賀氏菌i^higellasomwr)。志賀氏菌屬的四個(gè)種均能在人體中產(chǎn)生細(xì)菌性痢疾的潰瘍性結(jié)腸感染，且是細(xì)菌性痢疾中最重要的病原菌。該病原菌一般通過(guò)排泄物污染的食物或 水傳播的。每年世界各地均有大量因志賀氏菌感染而導(dǎo)致疾病的報(bào)道，我國(guó)受該菌的威脅也越來(lái)越大。因此，如何快速、準(zhǔn)確、特異地從含有大量其它細(xì)菌的食品等樣品中分離且鑒別出志賀氏菌具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前對(duì)志賀氏菌的檢測(cè)以選擇性培養(yǎng)基為主，其原理是利用志賀氏菌不利用乳糖、蔗糖等糖類物質(zhì)產(chǎn)酸的特性而與其它腸桿菌相區(qū)別。但是由于志賀氏菌的生物學(xué)特性與腸桿菌科其它細(xì)菌如大腸桿菌、沙門氏菌等非常相似，從而導(dǎo)致用于檢測(cè)志賀氏菌的傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)基出現(xiàn)大量假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。有的檢測(cè)方法曾經(jīng)建議同時(shí)使用三種不同的選擇性培養(yǎng)基來(lái)檢測(cè)單個(gè)樣品，以增加培養(yǎng)基的準(zhǔn)確性，這使得分離過(guò)程昂貴并且繁瑣。雖然近年來(lái)已有一些基于分子生物學(xué)和免疫學(xué)的快速檢測(cè)方法出現(xiàn)，但一方面，這些方法不能直接用于目標(biāo)菌的檢測(cè)，另一方面，這些方法需要專業(yè)的技術(shù)人員或者昂貴的儀器，使其應(yīng)用受到了很大的限制。相比較，利用酶活性檢測(cè)鑒別細(xì)菌是一種有效的方法，這種技術(shù)可以定量并初步鑒定目標(biāo)菌，且操作簡(jiǎn)便，大幅度提高了工作效率。然而目前暫未發(fā)現(xiàn)志賀氏菌表達(dá)的特異性酶，使得志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)受到了限制。因此目前志賀氏菌顯色培養(yǎng)基大多利用特異性酶使其它細(xì)菌顯色，從而與不顯色的志賀氏菌相區(qū)分。美國(guó)專利(Pat. No. 5，871，944)描述了一種從一個(gè)混合細(xì)菌樣品中鑒別沙門氏菌和志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基利用志賀氏菌不產(chǎn)P -半乳糖苷酶的特性，在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的底物。然而，一方面，這種培養(yǎng)基不能區(qū)分沙門氏菌和志賀氏菌；另一方面，其它不產(chǎn)生￠-半乳糖苷酶的細(xì)菌將不能與志賀氏菌相區(qū)分，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。雖然目前已有利用沙門氏菌產(chǎn)生硫化氫在培養(yǎng)基上顯示黑心來(lái)區(qū)分沙門氏菌的志賀氏菌顯色培養(yǎng)基，但是不產(chǎn)硫化氫的沙門氏菌仍然不能與志賀氏菌區(qū)分開(kāi)，并且有些產(chǎn)硫化氫的沙門氏菌在培養(yǎng)基中產(chǎn)生黑心不明顯，也會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果。綜上所述，目前用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的培養(yǎng)基的技術(shù)瓶頸在于一方面，一種培養(yǎng)基很難同時(shí)檢測(cè)志賀氏菌的四個(gè)種，造成漏檢現(xiàn)象；另一方面，志賀氏菌與沙門氏菌等腸桿菌科細(xì)菌很難區(qū)分，造成假陽(yáng)性結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基。
本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為
一種用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 mL培養(yǎng)基含有酵母粉2 10 g、胰蛋白胨2 7 g、大豆蛋白胨2 10 g、氯化鈉4 7 g、乳糖3 15g、鹿糖3 15 g、2-脫氧-D-核糖3 15 g、瓊脂粉12 20 g、P -葡萄糖苷酶顯色底物0. 05 0. 5 g、3 -卩比喃巖藻糖苷酶顯色底物0. 05 0. 5 g、^ -半乳糖苷酶顯色底物0. 05 0. 5 g、pH指示劑0. 03 0. 09 g、膽鹽2 9 g、新生霉素鈉I 5 mg、頭孢磺啶I 10 mg、頭孢克月虧0.01 0. I mg，余量為水。優(yōu)選的，P -葡萄糖苷酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷。優(yōu)選的，P -吡喃巖藻糖苷酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-P -吡喃巖藻糖苷。優(yōu)選的，P -半乳糖苷酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-P -半乳糖 苷。優(yōu)選的，膽鹽為去氧膽酸鈉、豬膽鹽、混合膽鹽、牛膽鹽和三號(hào)膽鹽中的至少一種。優(yōu)選的，膽鹽為三號(hào)膽鹽。優(yōu)選的，pH指示劑為酚紅。優(yōu)選的,每1000 mL培養(yǎng)基中包含酵母粉4 g、胰蛋白胨3 g、大豆蛋白胨6 g、氯化鈉5 g、乳糖5 g、蔗糖5 g、2-脫氧-D-核糖5 g、瓊脂粉15 g、5_溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷0.4 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-吡喃巖藻糖苷0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-￠-半乳糖苷0.4 g、酹紅0.08 g、三號(hào)膽鹽6 g、新生霉素鈉4 mg、頭孢磺唳9 mg、頭孢克肟0.03 mg，余量為水。本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了志賀氏菌不利用的碳水化合物以及指示劑酚紅。志賀氏菌不利用的碳水化合物包括山梨醇、側(cè)金盞花醇、2-脫氧-D-核糖、肌醇、木糖、纖維二糖、乳糖、衛(wèi)矛醇、蔗糖、棉子糖、水楊素，能利用這些碳水化合物中的一種或幾種產(chǎn)酸的細(xì)菌，在PH指示劑作用下顯示的顏色，能將該細(xì)菌與志賀氏菌區(qū)分開(kāi)來(lái)，本發(fā)明在優(yōu)選pH指示劑酚紅作用下使發(fā)酵糖類產(chǎn)酸的細(xì)菌顯示出黃色菌落，從而與志賀氏菌區(qū)分。本發(fā)明優(yōu)選乳糖、蔗糖和2-脫氧-D-核糖。本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了 ￠-葡萄糖苷酶、￠-吡喃巖藻糖苷酶和￠-半乳糖苷酶的顯色底物，能表達(dá)產(chǎn)生這三種酶中的至少一種的細(xì)菌在酶的作用下分解底物，游離出發(fā)色基團(tuán)，使菌落呈現(xiàn)出發(fā)色基團(tuán)的色澤，從而與志賀氏菌相區(qū)分。本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了膽鹽，可抑制樣品中大部分的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。本發(fā)明的培養(yǎng)基還添加了抗生素?？股啬芤种颇承┚L(zhǎng)，如亞碲酸鹽可用來(lái)延緩大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)，新生霉素鈉和頭孢克肟可以抑制變形桿菌的生長(zhǎng)，頭孢磺啶可以抑制假單胞菌屬一類的細(xì)菌。本發(fā)明優(yōu)選新生霉素鈉、頭孢磺啶和頭孢克肟。細(xì)菌在本發(fā)明培養(yǎng)基中呈現(xiàn)的特征有
1)不利用乳糖、蔗糖和2-脫氧-D-核糖產(chǎn)酸并且不產(chǎn)P-葡萄糖苷酶、P -吡喃巖藻糖苷酶和3 -半乳糖苷酶的微生物會(huì)形成第一種顏色菌落(白色)，志賀氏菌呈現(xiàn)第一種顏色菌落；
2)能利用乳糖、蔗糖和2-脫氧-D-核糖中的至少一種物質(zhì)產(chǎn)酸的微生物，在pH指示劑酚紅作用下形成第二種顏色菌落(黃色);3)能產(chǎn)￠-葡萄糖苷酶、￠-吡喃巖藻糖苷酶和￠-半乳糖苷酶中至少一種的微生物，形成第三種顏色菌落(綠色);
4)能利用乳糖、蔗糖和2-脫氧-D-核糖中的至少一種物質(zhì)產(chǎn)酸且產(chǎn)3-葡萄糖苷酶、^ -吡喃巖藻糖苷酶和3 -半乳糖苷酶中至少一種的微生物，則形成第二種和第三種顏色的混合顏色，從而形成第四種顏色的菌落(藍(lán)綠色或墨綠色)；以上四種顏色容易區(qū)分。本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的方法，包括如下步驟
1)顯色平板的制備將上述顯色培養(yǎng)基除新生霉素鈉、頭孢磺啶、頭孢克肟、2-脫氧-D-核糖外的各組分，加入到去離子水中，攪拌，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至
6.8±0. 2，待冷卻至45 55°C，加入過(guò)濾除菌的新生霉素鈉、頭孢磺啶、頭孢克肟、2-脫氧_D_核糖,混勻,倒平板，備用；
2)樣品處理依據(jù)各領(lǐng)域規(guī)范規(guī)定的樣本處理方法處理；
3)接種培養(yǎng)將樣品或含樣品的增菌液劃線或涂布接種到顯色平板上，37°C培養(yǎng)20 24 h ;
4)結(jié)果分析若顯色平板上培養(yǎng)基變紅，出現(xiàn)清晰白色或無(wú)色半透明、直徑為I 3_，沒(méi)有色素沉著的菌落，則說(shuō)明此菌落為可疑志賀氏菌菌落，可將該菌落挑出進(jìn)一步做生化鑒定，其它細(xì)菌或被抑制或呈現(xiàn)黃色、綠色、藍(lán)綠色、墨綠色。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基可用于志賀氏菌屬的四個(gè)種的分離和檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于操作、結(jié)果判斷簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適合于各種樣本的檢測(cè)，有廣泛的應(yīng)用前景。顯色培養(yǎng)基檢測(cè)效果可達(dá)到進(jìn)口 R&F公司同類產(chǎn)品水平，優(yōu)于國(guó)內(nèi)已有的同類產(chǎn)品。本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基大大降低了假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，有很廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基適用于包含大量其它腸桿菌科的樣品中志賀氏菌的分離和檢測(cè)，特別地，本發(fā)明的培養(yǎng)基能很好地區(qū)分沙門氏菌和志賀氏菌。本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基比以往的培養(yǎng)基菌落顏色更少，更容易可靠地檢測(cè)志賀氏菌，志賀氏菌在本發(fā)明培養(yǎng)基中呈現(xiàn)白色，可清晰地與其它細(xì)菌呈現(xiàn)的鮮艷黃色或綠色等顏色區(qū)分。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限如此。實(shí)施例I
一種用于檢測(cè)和分離志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 mL培養(yǎng)基含有酵母粉4 g、胰蛋白胨3 g、大豆蛋白胨6 g、氯化鈉5 g、乳糖5 g、鹿糖5 g、2-脫氧-D-核糖5 g、瓊脂粉15g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷0. 4 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -吡喃巖藻糖苷0. 2g、5-溴-4-氯-3-卩引哚-N-乙酰-0 -半乳糖苷0. 4 g、酹紅0.08 g、三號(hào)膽鹽6 g、新生霉素鈉4 mg、頭孢磺啶9 mg、頭孢克肟0.03 mg，余量為去離子水，pH為6. 8±0. 2。實(shí)施例2
一種用于檢測(cè)和分離志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 mL培養(yǎng)基含有酵母粉6 g、胰蛋白胨3 g、大豆蛋白胨7 g、氯化鈉5 g、乳糖3 g、鹿糖8 g、2-脫氧-D-核糖7 g、瓊脂粉18g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷0. 2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -吡喃巖藻糖苷0. Ig、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-￠-半乳糖苷0. 2 g、酚紅0.06 g、三號(hào)膽鹽5 g、新生霉素鈉3 mg、頭孢磺啶3 mg、頭孢克肟0.05 mg，余量為去離子水，pH為6. 8±0. 2。實(shí)施例3
一種用于檢測(cè)和分離志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 mL培養(yǎng)基含有酵母粉8 g、胰蛋白胨2 g、大豆蛋白胨6 g、氯化鈉5 g、乳糖5 g、鹿糖5 g、2-脫氧-D-核糖10 g、瓊脂粉15 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-葡萄糖苷0. I g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-吡喃巖藻糖苷0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-￠-半乳糖苷0.4 g、酚紅0.04 g、三號(hào)膽鹽7 g、新生霉素鈉2 mg、頭孢磺啶8 mg、頭孢克肟0. 07 mg，余量為去離子水，pH為6. 8±0. 2。實(shí)施例4
一種用于檢測(cè)和分離志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 mL培養(yǎng)基含有酵母粉7 g、胰蛋白胨6 g、大豆蛋白胨3 g、氯化鈉5 g、乳糖8 g、鹿糖3 g、2-脫氧-D-核糖12 g、瓊脂粉15 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-葡萄糖苷0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-吡喃巖藻糖苷0.4 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-￠-半乳糖苷0. 3 g、酚紅0.08 g、三號(hào)膽鹽5 g、新生霉素鈉3 mg、頭孢磺啶7 mg、頭孢克肟0.015 mg，余量為去離子水，pH為6. 8±0. 2。實(shí)施例5
一種用于檢測(cè)和分離志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 mL培養(yǎng)基含有酵母粉2 g、胰蛋白胨5 g、大豆蛋白胨4 g、氯化鈉4 g、乳糖3 g、鹿糖9 g、2-脫氧-D-核糖15 g、瓊脂粉17 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-葡萄糖苷0.3 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-吡喃巖藻糖苷0. 5 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-￠-半乳糖苷0.05 g、酚紅0. 09 g、三號(hào)膽鹽9 g、新生霉素鈉I mg、頭孢磺唳6 mg、頭孢克月虧0.1 mg,余量為去離子水，pH為6. 8±0. 2。實(shí)施例6
一種用于檢測(cè)和分離志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 mL培養(yǎng)基含有酵母粉5 g、胰蛋白胨4 g、大豆蛋白胨10 g、氯化鈉6 g、乳糖10 g、鹿糖15 g、2-脫氧-D-核糖8 g、瓊脂粉12 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-葡萄糖苷0.5 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-吡喃巖藻糖苷0.05 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-P-半乳糖苷0. I g、酚紅0.03 g、三號(hào)膽鹽4g、新生霉素鈉5 mg、頭孢磺唳10 mg、頭孢克月虧0.01 mg,余量為去離子水,pH為6. 8±0. 2。實(shí)施例7
一種用于檢測(cè)和分離志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 mL培養(yǎng)基含有酵母粉10 g、胰蛋白胨7 g、大豆蛋白胨2 g、氯化鈉7 g、乳糖15 g、鹿糖3 g、2-脫氧-D-核糖3 g、瓊脂粉20 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷0. 05 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -吡喃巖藻糖苷0. 3 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-P -半乳糖苷0. 5 g、酚紅0. 05 g、三號(hào)膽鹽2g、新生霉素鈉3 mg、頭孢磺唳I mg、頭孢克月虧0.05 mg,余量為去離子水，pH為6. 8±0. 2。特異性實(shí)驗(yàn)
將表I中所述22株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別制成IO8 IO9 CFU/mL的菌懸液，分別取一環(huán)劃線接種于實(shí)施案例I中所描述培養(yǎng)基制成的平板(簡(jiǎn)稱HKM)上，37°C培養(yǎng)24 h，觀察各菌的生長(zhǎng)情況及菌落特征，結(jié)果見(jiàn)表2。注表2中菌落生長(zhǎng)情況用生長(zhǎng)幾區(qū)來(lái)表示，4區(qū)表示生長(zhǎng)良好，菌落大小正常，I 3區(qū)表示生長(zhǎng)受抑制，菌落偏小或生長(zhǎng)少于4區(qū)。
權(quán)利要求
1.一種用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，每1000 mL培養(yǎng)基含有酵母粉2 10g、胰蛋白胨2 7 g、大豆蛋白胨2 10 g、氯化鈉4 7 g、乳糖3 15 g、鹿糖3 15g、2_脫氧-D-核糖3 15 g、瓊脂粉12 20 g、β -葡萄糖苷酶顯色底物O. 05 O. 5 g、β -卩比喃巖藻糖苷酶顯色底物O. 05 O. 5 g、β -半乳糖苷酶顯色底物O. 05 O. 5 g、pH指示劑O. 03 O. 09 g、膽鹽2 9 g、新生霉素鈉I 5 mg、頭孢磺啶I 10 mg、頭孢克月虧O. 01 O. I mg，余量為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于β_葡 萄糖苷酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于β_吡喃巖藻糖苷酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -吡喃巖藻糖苷。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于β_半乳糖苷酶顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β -半乳糖苷。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于膽鹽為去氧膽酸鈉、豬膽鹽、混合膽鹽、牛膽鹽和三號(hào)膽鹽中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于膽鹽為三號(hào)膽鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，其特征在于ρΗ指示劑為酚紅。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于分離和檢測(cè)志賀氏菌的顯色培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、乳糖、蔗糖、2-脫氧-D-核糖、瓊脂粉、β-葡萄糖苷酶顯色底物、β-吡喃巖藻糖苷酶顯色底物、β-半乳糖苷酶顯色底物、酚紅、三號(hào)膽鹽、新生霉素鈉、頭孢磺啶、頭孢克肟，余量為水。本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基可用于志賀氏菌屬的四個(gè)種的分離和檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于操作、結(jié)果判斷簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適合于各種樣本的檢測(cè)，有廣泛的應(yīng)用前景。顯色培養(yǎng)基檢測(cè)效果可達(dá)到進(jìn)口R&F公司同類產(chǎn)品水平，優(yōu)于國(guó)內(nèi)已有的同類產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102703565SQ20121015809
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者盧勉飛, 吳清平, 田亮, 蔡芷荷, 邱國(guó)建, 黃嶺芳 申請(qǐng)人:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司