一種用于大腸桿菌定量檢測(cè)的選擇性培養(yǎng)基及大腸桿菌定量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物的定量檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種快速、低成本、高靈敏度的用于大腸桿菌定量檢測(cè)的選擇性培養(yǎng)基及大腸桿菌定量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌是水體污染程度的重要指示菌，是腸道中最普遍、數(shù)量最多的一類細(xì)菌，近年來，由于大腸桿菌引發(fā)的食品安全事件層出不窮，每年由大腸桿菌引發(fā)的病例多達(dá)6.4億，在我國(guó)，大腸桿菌是引起我國(guó)居民腹瀉的首要病源，環(huán)境中的大腸桿菌己經(jīng)成為人類病原存在的一個(gè)重要指標(biāo)，成為環(huán)境保護(hù)、食品衛(wèi)生、飲水衛(wèi)生和流行性病學(xué)領(lǐng)域中最重要的研究對(duì)象之一。飲用水或食物中的大腸桿菌可引發(fā)霍亂、傷寒、痢疾等腸道疾病。因此快速準(zhǔn)確的檢測(cè)大腸桿菌的數(shù)量在環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測(cè)與食品安全中有著重大的意義。
[0003]目前大腸桿菌檢測(cè)的技術(shù)包括:平板計(jì)數(shù)法、PCR、基因芯片、生物傳感器、紫外可見分光光度檢測(cè)法、膠體金免疫側(cè)吸檢測(cè)試紙條、脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析、乳膠凝集試驗(yàn)等，以上的檢測(cè)方法各有利弊，常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)法耗時(shí)且工作量大，新興的檢測(cè)技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備操作等要求較高，并且一些檢測(cè)靈敏度受到限制，分子生物學(xué)方法，如PCR存在不能區(qū)分死菌或者活菌的缺陷，使檢測(cè)結(jié)果具有假陰性。因此急需一種快速、簡(jiǎn)單、高靈敏的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種用于大腸桿菌定量檢測(cè)的選擇性培養(yǎng)基及大腸桿菌定量檢測(cè)方法。本發(fā)明方法用于大腸桿菌的定量檢測(cè)，快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0006]—種用于大腸桿菌定量檢測(cè)的選擇性培養(yǎng)基，其特征在于，所述的選擇性培養(yǎng)基的組成為:乳糖:10?26g/L，蛋白胨:15?25g/L，牛膽鹽:1?7g/L，羧甲基纖維素鈉:0.01 ?0.90g/L，氯化鈉:2 ?7g/L，磷酸氫二鉀:2.5 ?7.5g/L。
[0007]根據(jù)以上方案，所述的選擇性培養(yǎng)基組成優(yōu)選為:乳糖:25g/L，蛋白胨:15g/L，牛膽鹽:2g/L，羧甲基纖維素鈉:0.15g/L，氯化鈉:2.5g/L，磷酸氫二鉀:4g/L。
[0008]提供一種上述選擇性培養(yǎng)基的制備方法，步驟如下:
[0009](I)按照配方將乳糖、蛋白胨、牛膽鹽、羧甲基纖維素鈉，氯化鈉和磷酸氫二鉀加熱溶解后定容；
[0010](2)混勻，高壓滅菌而得。
[0011]根據(jù)上述方案，所述的高壓滅菌100°C _150°C，滅菌時(shí)間10-25min。
[0012]利用上述用于大腸桿菌定量檢測(cè)的選擇性培養(yǎng)基定量檢測(cè)大腸桿菌的方法，步驟如下:將待檢測(cè)細(xì)菌樣品接種到上述用于大腸桿菌定量檢測(cè)的選擇性培養(yǎng)基中，于無氧條件下，25-44°C，150-280rpm,培養(yǎng)7_15h后檢測(cè)菌液pH值，根據(jù)菌液pH值和大腸桿菌初始濃度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中大腸桿菌的數(shù)量。
[0013]根據(jù)上述方案，所述接種的方法為將用于大腸桿菌定量檢測(cè)的選擇性培養(yǎng)基分裝于試管，每只試管5-15ml，接種5-10 μ I待檢測(cè)細(xì)菌樣品到選擇性培養(yǎng)液中。
[0014]根據(jù)上述方案，培養(yǎng)條件優(yōu)選為:30-39°C，200-250rpm。
[0015]根據(jù)上述方案，接種培養(yǎng)10_14h后檢測(cè)菌液pH值。
[0016]按上述方案，所述菌液pH值和大腸桿菌初始濃度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得方法如下:
[0017]a.配制一系列濃度的大腸桿菌溶液；
[0018]b.將待檢測(cè)細(xì)菌樣品接種到選擇性培養(yǎng)基中，25-44°C，150-280rpm，培養(yǎng)7_15h后檢測(cè)菌液pH值:
[0019]c.擬合得到菌液pH值和大腸桿菌初始濃度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線c(x，y)—一x大腸桿菌初始濃度，I為菌液PH值。
[0020]按上述方案，所述菌液pH值和大腸桿菌初始濃度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線中一系列細(xì)菌樣品的濃度范圍是:l-10000cfu/ml。
[0021]按上述方案，所述步驟c擬合時(shí)，對(duì)大濃度段進(jìn)行單獨(dú)擬合得到大濃度時(shí)菌液pH
值和大腸桿菌初始濃度的對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系曲線C2(x2，y2)--X2大腸桿菌初始濃度的對(duì)數(shù)值，y2為菌液pH值；所述的大濃度是:大腸桿菌的濃度位于lO-lOOOOcfu/ml ;
[0022]相應(yīng)地，在求算待測(cè)樣品中大腸桿菌初始濃度時(shí)根據(jù)菌液pH值，選用大濃度時(shí)菌液PH值和大腸桿菌初始濃度的關(guān)系曲線的關(guān)系曲線C2(x2，y2)，結(jié)合培養(yǎng)該待測(cè)樣品后的菌液的PH值計(jì)算待測(cè)樣品中大腸桿菌初始濃度。
[0023]大腸桿菌在沒有葡萄糖做碳源、無氧條件下，能夠把乳糖分解成乳酸等酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基的PH下降。據(jù)此我們特別設(shè)計(jì)了一種大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基，具體地，本發(fā)明的培養(yǎng)基中選用了乳糖作碳源，可起到抑制除大腸桿菌以外其他細(xì)菌的生長(zhǎng)；此外，通過添加抑菌劑牛膽鹽，可利用牛膽鹽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有良好的抑制作用，使培養(yǎng)基的大腸桿菌選擇性更好；另通過添加羧甲基纖維素鈉，可以增加液體培養(yǎng)的黏度，使細(xì)菌能夠均勻的在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)等。經(jīng)我們研究發(fā)現(xiàn)；這種選擇性培養(yǎng)基可促進(jìn)大腸桿菌的培養(yǎng)，進(jìn)而對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)一定時(shí)間后的這種培養(yǎng)基的PH進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn):一定范圍內(nèi)不同濃度的大腸桿菌接種到該選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)一定的時(shí)間后，pH與大腸桿菌初始濃度呈現(xiàn)一定的指數(shù)關(guān)系。據(jù)此，我們提供了一種利用上述用于大腸桿菌定量檢測(cè)的選擇性培養(yǎng)基定量檢測(cè)大腸桿菌的方法。該方法用于大腸桿菌的定量檢測(cè)，快速、準(zhǔn)確、靈敏度高(可以檢測(cè)到的數(shù)量級(jí)是:lcfu/ml) ο
[0024]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0025](I)使用pH計(jì)檢測(cè)培養(yǎng)后菌液pH，利用pH與大腸桿菌初始濃度關(guān)系，進(jìn)行大腸桿菌的定量檢測(cè)，快速、準(zhǔn)確、靈敏度高(可以檢測(cè)到的數(shù)量級(jí)是:lcfu/ml);
[0026](2)更加方便快捷，降低成本；
[0027](3)本發(fā)明提供的大腸桿菌培養(yǎng)基是一種選擇性液體培養(yǎng)基，環(huán)境和食品中常見致病菌如金黃色葡萄球菌，沙門氏菌，無乳鏈球菌，單增李斯特氏菌等都無法在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，能夠?qū)Ｒ恍缘膽?yīng)用到食品和環(huán)境中大腸桿菌的檢測(cè)。
【附圖說明】
[0028]圖1是不同初始濃度的細(xì)菌在發(fā)明的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)13h后的體系pH值；
[0029]圖2是大腸桿菌初始濃度的對(duì)數(shù)值與pH之間的關(guān)系圖；
[0030]圖1 中 R2= 0.99939，關(guān)系式是 y = A fexp (-χ/t!)+A2*exp (_x/t2)+y。其中 A !的值是0.94394，h的值是78.40394，A 2的值是0.99396，12的值是627.35178，y。的值是5.05955，y = 0.94394*e( χ/78.40394)+0.99396*e( χ/627.35178)+5.05955，χ 大腸桿菌初始濃度，y 為菌液pH值；
[0031]圖2為大濃度時(shí)菌液pH值和大腸桿菌初始濃度的對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系式是 y = a+bx，其中 R2= 0.99252。其中 a 的值是 7.89257，b 的值是-0.87011，y =7.89257-0.8701 lx，χ大腸桿菌初始濃度對(duì)數(shù)值，y為菌液pH值。
【具體實(shí)施方式】
[0032]為更好理解本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表示的范圍。
[0033]實(shí)施例1:
[0034]用于大腸桿菌定量檢測(cè)的選擇性培養(yǎng)基的制備:
[0035]取乳糖12.5g，蛋白