在大腸桿菌的細胞質(zhì)和/或培養(yǎng)基中表達真人類表皮生長因子和/或堿性成纖維細胞生長 ...的制作方法
【專利說明】在大腸桿菌的細胞質(zhì)和/或培養(yǎng)基中表達真人類表皮生長 因子和/或堿性成纖維細胞生長因子的手段和方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年4月3日提交的美國專利申請No. 61/808,062的優(yōu)先權(quán)，將其 公開的內(nèi)容整體合并于本申請中。
[0003] 序列表
[0004] 如上即時申請包括序列表，通過整體引用的方式合并于此。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本申請涉及在大腸桿菌（Escherichiacoli)的細胞質(zhì)和/或培養(yǎng)基中表達真 (authentic)人類表皮生長因子和/或堿性成纖維細胞生長因子的手段和方法。
【背景技術(shù)】
[0006] 雖然大腸桿菌不能進行翻譯后修飾，但大腸桿菌仍然是用來生產(chǎn)重組人類治療性 蛋白最常用的宿主系統(tǒng)。在這些蛋白中，包括表皮生長因子（EGF)和堿性成纖維細胞生長 因子（bFGF)在內(nèi)的皮膚蛋白不需要翻譯后修飾，例如維持生物活性和穩(wěn)定性的糖基化修 飾，這些皮膚蛋白已經(jīng)使用多種策略在大腸桿菌中得到了表達。
[0007] 可能是由于尺寸小，EGF已經(jīng)在大腸桿菌中得到了高效表達、分泌甚至外排 (excrete)到培養(yǎng)基中。外排的EGF不僅被證實是有生物活性的，更重要的是，其還顯示出 具有正確的初級（真）結(jié)構(gòu)。此外，由于通過外排生產(chǎn)EGF不需要破壞細胞，所以外排生產(chǎn) 的EGF可以免于內(nèi)毒素的污染。另外，培養(yǎng)基中低水平的細胞質(zhì)蛋白極大促進了EGF的純 化以達到高同質(zhì)性。重要的是，這個過程高度可重復(fù)并易于擴展。
[0008] 對于bFGF，盡管它具有分泌性，但是它并沒有通過分泌或外排在大腸桿菌中獲得 成功表達。傳統(tǒng)地，bFGF在大腸桿菌中的表達通過使用融合的方式已被局限于細胞質(zhì)，在 這種方式中，bFGF的回收依靠細胞的裂解、融合中間體的蛋白水解消化和通常通過親和層 析進行的后續(xù)純化。bFGF的細胞內(nèi)表達會導(dǎo)致高的生產(chǎn)成本，因為它要么需要昂貴的蛋白 酶以切割融合產(chǎn)物，要么在內(nèi)含物聚合體（inclusionaggregates)形成時需要勞動密集型 的方案來再生bFGF。盡管有這些操作，但是bFGF在大腸桿菌中的表達仍沒有圓滿完成，因 為生產(chǎn)的產(chǎn)物被證實未被正確加工或者沒有生物活性。
[0009] 之前已經(jīng)嘗試使用其它的重組系統(tǒng)來生產(chǎn)bFGF。其中一種嘗試是關(guān)于枯草芽孢桿 菌（Bacillussubtilis)工程來促進bFGF的分泌生產(chǎn)。通過使用能夠精準(zhǔn)的對融合前體 進行肽酶加工的解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens)蛋白酶基因的NPR信號肽，并結(jié) 合一種溫和的破壞細胞壁穩(wěn)定性的方案，具備真正結(jié)構(gòu)和完全的生物活性的bFGF被證實 分泌到了枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基中。
[0010] 本發(fā)明提供了一種可替代的和/或改進的方法和系統(tǒng)，以用于可靠且高效地生產(chǎn) bFGF和/或其它有用的多肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 根據(jù)本申請的第一方面，提供了一種DNA構(gòu)建體，以用于在大腸桿菌中生產(chǎn)至少 第一多肽，其中，所述第一多肽是真堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)，其中，所述DNA構(gòu)建 體中包括插入片段，所述插入片段按順序包括表達盒、內(nèi)含肽序列和編碼堿性成纖維細胞 生長因子（bFGF)的DNA，其中，所述DNA構(gòu)建體被配置成能夠使宿主分泌堿性成纖維細胞生 長因子（bFGF)在宿主的細胞質(zhì)中和/或外排到培養(yǎng)宿主的細胞培養(yǎng)基中。
[0012] 優(yōu)選地，所述DNA可以包含編碼第二多肽的DNA，其中，編碼第二多肽的DNA可以 被安排在表達盒和內(nèi)含肽序列之間。編碼第二多肽的DNA以可以編碼真人類表皮生長因子 (EGF)。所述DNA構(gòu)建體可以被配置成能夠使宿主以非融合多肽的形式分泌第一和/或第 二多肽。
[0013] 在一種實施方式中，所述內(nèi)含肽序列可以是SeeVMA內(nèi)含肽序列。
[0014] 在一個實施方式中，所述表達盒可以包括啟動子序列，操縱子序列，用于共有核糖 體（consensusribsome)結(jié)合位點的序列和前導(dǎo)序列。在具體的實施方式中，所述表達盒 可以按順序包括啟動子序列、操縱子序列，用于共有核糖體（consensusribsome)結(jié)合位點 的序列和如導(dǎo)序列。在另一種具體的實施方式中，所述啟動子序列可以是lacUV5啟動子 (lacUV5)，操縱子序列可以是lac操縱子（lacO)，前導(dǎo)序列可以是ompA前導(dǎo)序列（ompA)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種用來至少生產(chǎn)堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)的生物工程系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)為大腸桿菌宿主，并且其中，所述系統(tǒng)適用于通 過分泌到細胞質(zhì)中和/或培養(yǎng)所述系統(tǒng)的培養(yǎng)基中的方式生產(chǎn)堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF) 〇
[0016] 優(yōu)選地，所述系統(tǒng)可以包括以上描述的DNA構(gòu)建體。
[0017] 所述系統(tǒng)可以被配置成以非融合多肽的形式生產(chǎn)第一多肽。
[0018] 所述系統(tǒng)可以被配置成以非融合多肽的形式生產(chǎn)第二多肽。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種生產(chǎn)堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)的方 法，所述堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)為大腸桿菌宿主的細胞外產(chǎn)物和/或來自大腸桿 菌宿主的細胞質(zhì)，該方法包括在DNA構(gòu)建體中使用內(nèi)含肽以促進所述bFGF表達的步驟。
[0020] 優(yōu)選地，所述內(nèi)含肽可以是SeeVMA內(nèi)含肽。
[0021] 在一種實施方式中，所述方法可以適用于在相同的大腸桿菌宿主中以非融合多肽 的方式共表達bFGF和真人類表皮生長因子（EGF)。
[0022] 在一種實施方式中，所述方法可以包括在在宿主細胞質(zhì)中和/或培養(yǎng)宿主的細胞 培養(yǎng)基中生產(chǎn)bFGF和/或EGF的步驟。
[0023] 優(yōu)選地，所述方法提供：在DNA構(gòu)建體中，將內(nèi)含肽置于bFGF和EGF的DNA編碼序 列之間的步驟。
[0024] 在一種實施方式中，bFGF和EGF的DNA編碼序列可以置于相同的DNA構(gòu)建體中。
【附圖說明】
[0025] 圖1是展示用在引導(dǎo)本發(fā)明的研究中DNA構(gòu)建體的示意圖。中的上部分展示了使 用的3種DNA質(zhì)粒，SP(A)pWKW2FGFR、（B)pWKW20VMA和（C)pWK3R?；蛟姆柸缦滤?示：bfgf=bFGF基因；VMA=SceVMA內(nèi)含肽的編碼序列；egf=EGF基因；ori=大腸桿菌 中的復(fù)制起始位點；ampR =氨節(jié)青霉素抗性基因。圖下部分展示了LacUV5表達盒的5'端 區(qū)域，按包括lacUV5啟動子（lacUV5)、lac操縱子（lacO)、共有核糖體結(jié)合位點 (RBS)和ompA前導(dǎo)序列（ompA)。箭頭指示了從lacUV5啟動子的轉(zhuǎn)錄方向。所述箭頭指示 了從lacUV5啟動子的轉(zhuǎn)錄方向。位于圖的最下部分的圖（D)展示了在構(gòu)建體pWKW20VMA 和PWK3R中，在VMA內(nèi)含肽融合邊界的DNA編碼序列和氨基酸序列。
[0026] 圖2是多種質(zhì)粒構(gòu)建體表達的bFGF和EGF的蛋白印跡（WesternBlot)的示意 圖。將在IPTG誘導(dǎo)下生長8小時的含有pWK3R、pWKW20VMA和pWKW2FGFR三種構(gòu)建體的大 腸桿菌培養(yǎng)物分離成細胞上清液（SN)和細胞裂解液（CL)制品（preparation)。通過使用 抗：[凝膠（A)]bFGF和MazG(內(nèi)參）；[凝膠⑶]bFGF、EGF和MazG的抗體（antibodies raisedagainst)的蛋白印跡來分析樣品的bFGF和EGF產(chǎn)物。樣品也用考馬斯亮藍 R-250進行染色，并展示在凝膠C中。展示了未成熟的（premature)bFGF(OmpA-bFGF)和 未成熟的EGF(OmpA-EGF)的中間體，對應(yīng)的，也展示了成熟的bFGF(Mat-bFGF)和成熟的 EGF(Mat-EGF)產(chǎn)物。SN和CL的上樣量分別相當(dāng)于細胞培養(yǎng)物的10y1和5y1。所述三 種構(gòu)建體的名稱顯示在凝膠圖片下方來表示制備的分離樣品所來自的細胞培養(yǎng)物。表明 了圖2a(泳道2和3)以及圖2b(泳道3和4)所示的是前體OmpA-EGF-VMA-bFGF(A)和 EGF-VMA-bFGF( )。其他使用的符號：M=蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；+VE=作為陽性對照的bFGF 或bFGF和EGF標(biāo)準(zhǔn)物。
[0027] 圖3是兩張展示通過MALDI-T0F測定的純化EGF的質(zhì)量圖。展示分析（見方法）： (a)具有天然的初級結(jié)構(gòu)的商業(yè)化的EGF標(biāo)準(zhǔn)物；(b)從JM101(pW3R)培養(yǎng)物（見方法中的 生長和誘導(dǎo)條件）的SN純化得到的EGF。表明主峰在6213至6217的區(qū)域處具有的質(zhì)荷比 (m/z)是期望從真EGF在兩處得到的。（a.u.)表示任意單位。
[0028] 圖4是兩張展示EGF和bFGF的生物測定的圖。成熟的EGF和bFGF樣品是從誘導(dǎo) 的JM101 [pWK3R]的培養(yǎng)上清液中純化得到的（見方法中的生長和誘導(dǎo)條件）。EGF和bFGF 對BALB/C3T3纖維原細胞增殖的有絲分裂影響的分析在方法中做了描述。兩種成熟因子 r'f:):的生物活性與具有正確初級結(jié)構(gòu)的EGF和bFGF標(biāo)準(zhǔn)物（ _t_ )的生物活性做了比 較。兩個測試都得到了能夠重合的曲線。每個測試重復(fù)四次<〇.〇5);以及
[0029] 圖5是兩張展示成熟的bFGF和成熟的EGF在JM101[pWK3R]培養(yǎng)物中共表達的圖。 JM101[pWK3R]培養(yǎng)物的生長和誘導(dǎo)條件在方法中做了描述。頂部圖表示了：在SN中成熟 的bFGF的濃度（-□-)，在CL中成熟的bFGF的濃度（-?-)，在SN中成熟的EGF的濃度 (一A-)，以及在CL中成熟的EGF的濃度（==?==)。表示出的結(jié)果是四次不同實驗 的平均值土SEM值。底部圖表示了：普通瓊脂平板（plainagarplate)上收獲的活細胞數(shù) 添加有氨芐青霉素的瓊脂平板的活細胞數(shù)（--) ;CFU指的是細胞形成單 位。
【具體實施方式】
[0030] 大腸桿菌被用來在細胞外生產(chǎn)多種不同來源、功能和尺寸的自然分泌的蛋白。引 導(dǎo)本發(fā)明的研究提供了在大腸桿菌中通過細胞分泌/外排的方式表達真bFGF的機制，該機 制在之前是不可能的或者