專利名稱：一種簡便、高效誘導辣椒疫霉菌產生游動孢子的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農業(yè)植物保護技術領域，具體涉及一種簡便、高效誘導植物病原菌辣椒疫霉菌產生大量游動孢子的方法。
背景技術：
由辣椒疫霉菌iPhytophthora capsici Leonian)侵染引起的辣椒疫病是一種毀滅性的世界病害，該病害在適宜發(fā)病的條件下，可在短期內暴發(fā)成災，病原菌可侵染辣椒引起根、莖和果實腐爛，甚至造成寄主作物絕收，給辣椒生產造成嚴重的經濟損失。辣椒是我國的傳統(tǒng)產業(yè)，改革開放以來，隨著市場經濟的推進，我國辣椒產業(yè)每年以7%的速度發(fā)展，我國辣椒出口也在不斷增長，韓國、日本、澳大利亞、美國和東南亞等已成為我國辣椒的常年進口國。由于辣椒的適應性強，栽培區(qū)域廣泛，種植辣椒的經濟效益和社會效益都很高，對于中國蔬菜市場的周年供應有重要意義，辣椒已成為我國部分貧困山區(qū)脫貧致富的好幫手、城市菜籃子的當家菜。但是近年來，辣椒疫病在我國不少省份發(fā)生為害日益嚴重，重病田死秧率達30-100%，成為影響我國辣椒生產的重要障礙，如何有效地對辣椒疫病進行綜合管理并使之造成的經濟損失降低至最小是農業(yè)科研推廣部門的一大挑戰(zhàn)。研究并明確辣椒疫病發(fā)生流行規(guī)律是制定病害綜合管理措施的前提條件，研究病害流行規(guī)律需借助病原菌人工接種技術，而通過分離純化獲得目標病原菌的純培養(yǎng)，再由純培養(yǎng)獲得大量的人工接種體是人工接種的第一步。在辣椒疫病研究中人工接種體是游動孢子，傳統(tǒng)的獲得游動孢子的方法是獲得孢子囊，再通過刺激孢子囊使之釋放游動孢子，從而獲得最終的接種體。辣椒疫霉菌產生游動孢子的傳統(tǒng)或常規(guī)方法比較復雜，操作步驟繁多，產孢量低，產孢時間長，且效果不穩(wěn)定，難以滿足大批量接種試驗的需求。因此，很有必要建立一種簡易、高效的誘導辣椒疫霉菌產生大量游動孢子的方法，旨在為開展辣椒疫霉菌的群體遺傳研究及揭示病害的傳播和發(fā)生規(guī)律奠定基礎，為建立有效的病害管理措施提供科依據和技術手段。

發(fā)明內容
為了解決上述難題，本發(fā)明提供了一種簡便、高效誘導辣椒疫霉菌產生游動孢子的方法。為達到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術方案得以實現。(1)辣椒疫霉菌菌絲體的培養(yǎng)將辣椒疫霉菌菌絲塊接種于黑麥培養(yǎng)基平板上，置于500-600勒克斯的白色日光燈下連續(xù)光照的25°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(2)辣椒疫霉菌菌絲體的抹傷待步聚(1)菌絲長滿整個平板后，以無菌的L型玻棒涂抹長滿菌絲的平板；
(3)辣椒疫霉菌孢子囊的誘導將步驟(2)得到的平板放置于500-600勒克斯的白色日光燈下連續(xù)光照的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)對-3他；(4)游動孢子的釋放在步驟(3)得到的平板中加入無菌水，移至4°C冰箱或生化培養(yǎng)箱中靜置l_2h，然后再置于生化培養(yǎng)箱中孵育1- ；
(5)辣椒疫霉菌游動孢子的收集用滅過菌的毛筆輕輕撥動步驟(4)得到的培養(yǎng)基平板表面的菌絲，以達到刷洗游動孢子的目的，雙層無菌紗布過濾，所得到的過濾液即為辣椒疫霉菌游動孢子懸浮液。本發(fā)明的顯著優(yōu)點
誘導辣椒疫霉菌產生大量孢子囊或游動孢子對開展辣椒疫霉菌的生物學、生態(tài)學、遺傳分析、分子分析以及致病性測定和制定植物病害適時有效的綜合管理措施等研究都具有重要的意義。辣椒疫霉菌孢子囊和游動孢子的傳統(tǒng)誘導方法也能產生孢子囊和游動孢子， 這些方法步驟比較復雜，且產生孢子囊的數量不穩(wěn)定，比如土壤浸出液法和黃瓜接種保濕法(發(fā)明專利申請?zhí)?01110022114. 2)也能誘導辣椒疫霉菌產生大量的孢子囊，但這些方法要求需不斷的換水或保濕，而且要通過收集孢子囊后再刺激游動孢子釋放，存在工作量大的缺點，無法滿足大量試驗的需求。本發(fā)明采用了抹傷辣椒疫霉菌菌絲體，再通過光照和低溫刺激受傷菌體可直接產生大量游動孢子，本發(fā)明具有取材容易、成本低、操作步驟簡便、 游動孢子產生時間短等優(yōu)點。本發(fā)明為植物病害辣椒疫病的研究中游動孢子的產生提供了一種經濟、快速和有效的簡便方法。本發(fā)明為實現在短時間內誘導辣椒疫霉菌產生大量游動孢子提供了保證，本發(fā)明具有簡易、高效、無雜菌污染的優(yōu)點，對于開展辣椒疫病的研究具有重大意義。


圖1辣椒疫霉菌菌絲體抹傷處理； 圖2辣椒疫霉菌孢子囊形態(tài)特征；
圖3辣椒疫霉菌游動孢子釋放。
具體實施例方式下面結合實例對本發(fā)明一種簡便、高效誘導辣椒疫霉菌產生游動孢子的方法進一步描述。實施例1:
辣椒品種對辣椒疫病的抗性鑒定，按以下程序進行
(1)將供試的辣椒種子(種子可購于蔬菜種子公司或辣椒種子育種單位，品種適為辣椒疫病感品種)播于72格的穴盤(每格大小為4. 2X4. 2X5. 5cm3)內的培養(yǎng)土中，培養(yǎng)土為育苗專用泥炭士，發(fā)芽后每穴蔬成1苗，放置于溫室中(日溫維持在25-28°C )生長4個星期， 植株長出約4-6片真葉時便可用于接種試驗；
(2)供試辣椒疫霉菌菌株(菌株可分離自辣椒疫病發(fā)病的根、莖、果實和葉片組織)培養(yǎng)于黑麥培養(yǎng)基平板上，放置于的光照生化培養(yǎng)箱(500勒克斯的白色日光燈照射)中生長，經5d后菌絲生滿整個平板，以涂抹菌絲方法促進游動孢子囊產生以供接種使用(如圖1 所示)。首先以無菌的9cm的L型玻棒涂抹長滿菌絲的平板后，放置于光照生化培養(yǎng)箱 (500勒克斯的白色日光燈照射)中培養(yǎng)Mh，便能刺激產生大量孢子囊(如圖2所示)，再將已產生孢子囊的培養(yǎng)基平板加入ISmL無菌水后移至4°C冰箱中l(wèi)h，以促進游動孢子分化，然后再取出置于生化培養(yǎng)箱中孵育lh，使游動孢子同時大量釋放，以利于收集大量游動孢子懸浮液(如圖3所示);用滅過菌的毛筆輕輕撥動培養(yǎng)基平板表面的菌絲，以達到刷洗游動孢子的目的，雙層無菌紗布過濾，所得到的過濾液即為辣椒疫霉菌游動孢子懸浮液。再以血球計數板計算游動孢子數目后，調整游動孢子濃度為IX IO5個/mL作為接種體。接種的方法是采用灌根法，將游動孢子懸浮液直接灌注于每個植株的根部及培養(yǎng)土中，每株各 5ml。接種后的植株放置于溫室內，其日溫必需維持在25°C以上，每天澆水兩次，以維持高濕度的土壤而有利于病情進展；
所述的黑麥培養(yǎng)基的配制方法如下取50 g黑麥種子在1000 mL去離子水中浸泡 Μ-3Μι，在121 ！下高壓蒸汽滅菌30 min，4層紗布過濾去渣，上清液補足水至1000 ml，加入瓊脂20 g，加熱使瓊脂完全熔化后，趁熱用紗布過濾。而后分裝三角瓶，培養(yǎng)基在121。C 下高壓蒸汽滅菌20 min。(3)病害反應的調查及抗感病反應的分類接種經過7、14、21d后，調查植株的存活百分率，再按下述等級歸類其抗感病之反應高度抗病=植株存活率大于80% ；中度抗病=植株存活率為50-79% ；中度感病=植株存活率為30-49% ；高度感病=植株存活率低于 29%。(5)結果顯示供試的辣椒疫霉菌所產生的游動孢子具有很強的致病力，感病的辣椒品種接種4d后植株便全部死亡，植株存活率為0。實施例2:
不同誘導方法對辣椒疫霉菌產孢量的影響，按以下程序進行
(1)日光照射受傷菌絲供試菌株(見實例1)培養(yǎng)于黑麥培養(yǎng)基平板上，置于500-600 勒克斯的白色日光燈連續(xù)照射的25V 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲長滿整個平板后， 以涂抹菌絲方法促進游動孢子囊產生以供作接種體。先以L型玻棒涂抹長滿菌絲的平板， 即利用玻棒的涂抹壓倒所有的菌絲貼于培養(yǎng)基平板上，再放置于觀°C下光照培養(yǎng)箱(與前述相同)中培養(yǎng)M-36 h，然后向培養(yǎng)基平板加入18-20mL無菌水，移至4°C冰箱或生化培養(yǎng)箱中靜置l_2h，然后再置于生化培養(yǎng)箱中孵育1- ；用消毒毛筆刷洗菌絲表面，雙層紗布過濾，吸取10-20 μ L過濾液制成玻片，于100倍視野下鏡檢，每塊玻片觀察10個視野， 記錄游動孢子數量，然后根據菌絲塊面積，換算成每平方厘米菌絲塊上產生孢子囊數；
(2)菌絲塊水培法將供試辣椒疫霉菌株移至胡蘿卜培養(yǎng)基上，28°C光照中培養(yǎng)4d，用直徑為7 mm無菌打孔器沿菌落邊緣打取菌絲塊(所有菌絲塊菌齡一致)，把菌絲塊分別挑入滅好菌的培養(yǎng)皿中，每皿移入10塊菌碟，菌絲塊的菌絲面朝上，加入滅菌自來水，讓自來水剛剛淹過菌絲面。培養(yǎng)皿置光照培養(yǎng)箱(與前述相同)中培養(yǎng)M-48 h，用消毒毛筆刷洗菌絲表面，雙層紗布過濾，所得濾液移至4°C冰箱或生化培養(yǎng)箱中靜置l_2h，然后再置于生化培養(yǎng)箱中孵育l_2h，吸取10 μ L過濾液制成玻片，于100倍視野下鏡檢，每塊玻片觀察 10個視野，記錄游動孢子數量，然后根據菌絲塊面積，換算成每平方厘米菌絲塊上產生游動孢子數；
(3)結果顯示在黑麥培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)的辣椒疫霉菌，用玻棒的涂抹壓倒所有的菌絲使其貼于培養(yǎng)基平板上，再放置于觀°C下光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M-36 h，然后向培養(yǎng)基平板加入18-20mL無菌水，移至4°C冰箱或生化培養(yǎng)箱中靜置l_2h，然后再置于生化培養(yǎng)箱中孵育l_2h，可產生大量的游動孢子，菌絲塊上孢子囊的平均密度為2. 56X IO6個/ cm2。菌絲塊水培法培養(yǎng)M h未產生孢子囊，但培養(yǎng)48 h后也能產生一定數量的孢子囊，菌絲塊上孢子囊的密度為2. 02X IO4個/ cm2，其數量比日光照射受傷菌絲法少。
權利要求
1. 一種簡便、高效誘導辣椒疫霉菌產生游動孢子的方法，其特征和步聚如下(1)辣椒疫霉菌菌絲體的培養(yǎng)將辣椒疫霉菌菌絲塊接種于黑麥培養(yǎng)基平板上，置于500-600勒克斯的白色日光燈下連續(xù)光照的25°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(2)辣椒疫霉菌菌絲體的抹傷待步聚(1)菌絲長滿整個平板后，以無菌的L型玻棒涂抹長滿菌絲的平板；(3)辣椒疫霉菌孢子囊的誘導將步驟(2)得到的平板放置于500-600勒克斯的白色日光燈下連續(xù)光照的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)對-3他；(4)游動孢子的釋放在步驟(3)得到的平板中加入無菌水，移至4°C冰箱或生化培養(yǎng)箱中靜置l_2h，然后再置于生化培養(yǎng)箱中孵育1- ；(5)辣椒疫霉菌游動孢子的收集用滅過菌的毛筆輕輕撥動步驟(4)得到的培養(yǎng)基平板表面的菌絲，以達到刷洗游動孢子的目的，雙層無菌紗布過濾，所得到的過濾液即為辣椒疫霉菌游動孢子懸浮液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種簡便、高效誘導辣椒疫霉菌產生游動孢子的方法。該方法將辣椒疫霉菌培養(yǎng)于黑麥瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于28℃光照生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲長滿整個平板后，以無菌L型玻棒涂抹長滿菌絲的培養(yǎng)基平板，再置于28℃光照生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h以誘導孢子囊的產生，再將已產生孢子囊的培養(yǎng)基平板加入18mL的無菌水后移至4℃冰箱中1h，以促進游動孢子分化，然后再取出放置28℃生化培養(yǎng)箱中1h，使游動孢子同時大量釋放，以利收集大量游動孢子懸浮液。本發(fā)明為實現在短時間內誘導辣椒疫霉菌產生大量游動孢子提供了保證，本發(fā)明具有簡易、高效、無雜菌污染的優(yōu)點，對于開展辣椒疫病的研究具有重大意義。
文檔編號C12N3/00GK102391980SQ20111037941
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月25日 優(yōu)先權日2011年11月25日
發(fā)明者蘭成忠, 李本金, 翁啟勇, 趙健, 陳慶河 申請人:福建省農業(yè)科學院植物保護研究所