專利名稱：植物中由病毒誘導(dǎo)的基因沉默的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中的功能性基因組學(xué)領(lǐng)域，且其涉及重組植物病毒載體之用途。具體而言，本發(fā)明涉及通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)及重組病毒載體在該等細(xì)胞中之累積的方法。
背景技術(shù)：
近些年來(lái)，作為基因組工程的一部分，已經(jīng)完成了大量種類的植物及動(dòng)物的基因組定序。該等基因組工程的最終目標(biāo)是鑒定基因組中每一基因的生物功能?；虻哪承┕δ芤淹ㄟ^(guò)各種方法進(jìn)行了鑒定。一種進(jìn)行基因功能性研究的方法是以基因表現(xiàn)型方式及生化方式剔除靶基因表達(dá)并監(jiān)測(cè)沉默效應(yīng)。此方法通過(guò)使用T-DNA或可轉(zhuǎn)位因子的插入誘變作用來(lái)實(shí)施，以剔除轉(zhuǎn)基因植物中的靶基因表達(dá)。除了插入誘變作用外，還使用了蛋白質(zhì)的超量表達(dá)來(lái)研究基因功能。然而，每一種方法都存在若干缺點(diǎn)。插入誘變作用可導(dǎo)致靶基因的完全失效，此會(huì)使胚胎特異性基因的研究變得更加復(fù)雜，尤其當(dāng)此基因作為胚胎發(fā)育的關(guān)鍵基因時(shí)。另一關(guān)注點(diǎn)是多基因家族中的基因研究，其中突變基因的功能可受到補(bǔ)償。近年來(lái)出現(xiàn)了另外一種用來(lái)研究基因功能的可選基因沉默方法，即由病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)。該方法有利于定向性轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。在有效轉(zhuǎn)錄宿主細(xì)胞基因的同時(shí)，RNA不會(huì)發(fā)生累積或不會(huì)在低于正常水平時(shí)發(fā)生累積。該方法組合了基于病毒的表達(dá)載體之新發(fā)展以及基因沉默之新發(fā)現(xiàn)。宿主基因區(qū)段通過(guò)使用能夠在植物細(xì)胞中復(fù)制的病毒載體加以感染而在細(xì)胞中獲得放大。細(xì)胞中存在該等異常的或超量表達(dá)的RNA區(qū)段可導(dǎo)致含有相同序列的宿主mRNA之退化。據(jù)報(bào)導(dǎo)，VIGS可由雙鏈RNA通過(guò)經(jīng)RNA調(diào)介的防御機(jī)制引起。VIGS通常會(huì)導(dǎo)致一特殊的表現(xiàn)型來(lái)指示基因沉默。例如，纖維素合成酶基因的失效會(huì)導(dǎo)致節(jié)間長(zhǎng)度更短、葉片小且植株矮小的表現(xiàn)型。使用煙草花葉病毒及馬鈴薯X病毒表達(dá)來(lái)自八氫蕃茄紅素去飽和酶的mRNA片段會(huì)導(dǎo)致受感染植物的上部葉片褪色，參見(jiàn)美國(guó)專利第6,376,752號(hào)。褪色原因是八氫蕃茄紅素去飽和酶之mRNA水平的降低，此可導(dǎo)致更低的蛋白質(zhì)累積水平。
然而，該等先前技術(shù)VIGS方法僅能使用有限宿主范圍的單分裂(單組成)植物病毒載體。另外，該等載體若不通過(guò)系統(tǒng)內(nèi)移動(dòng)則不能僅在局部擴(kuò)散。因此，需要開(kāi)發(fā)能夠使用具有更廣宿主范圍及/或不能在系統(tǒng)內(nèi)移動(dòng)的病毒載體之方法。此外，先前技術(shù)載體只能一次使一個(gè)基因沉默。假若尚不了解該等大量基因的功能，則需要可誘導(dǎo)多基因沉默的載體，尤其當(dāng)進(jìn)行代謝途徑研究時(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明概言之涉及用于干擾植物細(xì)胞中之基因表達(dá)及該等細(xì)胞中重組植物病毒載體之累積(二者皆由該等載體引發(fā))的方法。重組植物病毒載體可衍生自一植物病毒的基因組成份，其中該植物病毒可為單分裂、雙分裂及三分裂基因組病毒。有的載體不能在系統(tǒng)內(nèi)移動(dòng)，有的載體能夠使多個(gè)基因沉默。本發(fā)明亦揭示了用于使一轉(zhuǎn)基因宿主植物中的基因沉默的方法。
具體而言，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默(其由重組病毒載體引發(fā))來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法。在該方法中，該重組病毒載體在宿主植物的一或多個(gè)位置感染植物細(xì)胞。該病毒載體衍生自一植物病毒的重組基因組成份。該植物病毒的重組基因組成份具有選定基因(其與該病毒基因組異源)的一核酸區(qū)段。該載體于感染后能夠在該等細(xì)胞中發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生該核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但不能在宿主植物系統(tǒng)內(nèi)移動(dòng)。該核酸區(qū)段自該植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為該外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。然后使該宿主植物生長(zhǎng)一段時(shí)間。該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可干擾選定基因在該等植物細(xì)胞中的表達(dá)。此干擾可通過(guò)一基因改變、生化改變或表現(xiàn)型改變來(lái)確定。該等改變皆歸因于此干擾。該核酸區(qū)段不會(huì)就此出現(xiàn)或在該植物病毒(野生型)基因組中的同一位置出現(xiàn)。該核酸區(qū)段至少由約20個(gè)核苷酸組成，且至多由200個(gè)或至多由300個(gè)核苷酸組成。該選定基因可來(lái)自該宿主植物或?yàn)樵撍拗髦参镏械囊晦D(zhuǎn)基因。此轉(zhuǎn)基因可為(例如)植物病毒復(fù)制酶基因或冠嬰基因，或者此轉(zhuǎn)基因可來(lái)源于一單子葉或雙子葉植物。次基因組啟動(dòng)子不為外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因，而是一合成或人工或異源性次基因組啟動(dòng)子。核酸區(qū)段可在一獨(dú)立于病毒基因的單獨(dú)啟動(dòng)子(例如，P3或CP)下表達(dá)。
本發(fā)明的另一方面提供了一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法。該方法包括首先，使用一重組病毒載體在宿主植物的一或多個(gè)位置感染該等細(xì)胞，其中該重組病毒載體是該等細(xì)胞中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物。該載體具有一植物病毒的重組基因組成份及選定基因的一核酸區(qū)段。該載體于感染后能夠在該等細(xì)胞中發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生該核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但不能在該宿主植物系統(tǒng)內(nèi)移動(dòng)。該核酸區(qū)段自該植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為該外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。然后使該宿主植物生長(zhǎng)。該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可干擾選定基因在該等細(xì)胞中的表達(dá)，此干擾可通過(guò)一歸因于此干擾的基因改變、生化改變或表現(xiàn)型改變來(lái)確定。
本發(fā)明的再一方面提供了一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)及重組病毒載體之累積的方法。該方法包括使用該重組病毒載體在宿主植物的一或多個(gè)位置感染該等細(xì)胞，其中該重組病毒載體是該宿主植物中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物。該病毒載體可具有一植物病毒的重組基因組成份及選定基因的一核酸區(qū)段。該病毒載體于感染后能夠在該等位置發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生該核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但不能在該宿主植物系統(tǒng)內(nèi)移動(dòng)。該核酸區(qū)段自該植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為該外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。然后，使該宿主植物生長(zhǎng)一段時(shí)間。該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可干擾該等細(xì)胞中選定基因之表達(dá)(此干擾可通過(guò)一歸因于此干擾的基因改變、生化改變或表現(xiàn)型改變來(lái)確定)及該重組病毒載體之累積。
本發(fā)明的又一方面提供了一種通過(guò)重組病毒載體(其由經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默引發(fā))來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法。在該方法中，使用至少兩種類型的重組病毒載體在該宿主植物的一或多個(gè)位置感染細(xì)胞，從而使每一載體于感染后能夠在該等感染位置發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生一核酸區(qū)段(其存在于每一載體中)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，此核酸區(qū)段亦可見(jiàn)于該等植物表達(dá)基因之一中。該核酸區(qū)段自該植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為該外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。該第一類型的重組病毒載體具有一植物病毒的重組基因組成份及一第一基因的核酸區(qū)段。該第二類型的重組病毒載體具有該植物病毒的重組基因組成份及一第二基因的核酸區(qū)段。該等載體是該宿主植物中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物。然后使該宿主植物生長(zhǎng)一段時(shí)間。該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可干擾選定基因在該等細(xì)胞中的表達(dá)，此干擾可通過(guò)一歸因于此干擾的基因改變、生化改變或表現(xiàn)型改變來(lái)確定。該等載體可構(gòu)造為使該等載體能夠進(jìn)行有限的細(xì)胞間移動(dòng)，但不能在該宿主植物中進(jìn)行系統(tǒng)移動(dòng)。該第一及第二載體可在該宿主植物的同一位置或不同位置同時(shí)或依序施與。
本發(fā)明的另一方面提供了一種通過(guò)重組病毒載體(其由經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默引發(fā))來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法。在該方法中，使用一第一重組病毒載體及一第二重組病毒載體在一或多個(gè)位置感染該等宿主植物，從而使每一載體于感染后能夠在該等位置發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生一核酸區(qū)段(其存在于每一載體中)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，此核酸區(qū)段亦可見(jiàn)于該等植物表達(dá)基因之一中。該第一重組病毒載體具有一第一類植物病毒的重組基因組成份及一第一基因的核酸區(qū)段，因而，該第一基因的核酸區(qū)段自該第一類植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為該第一類病毒的外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。該第二重組病毒載體具有一第二類植物病毒的重組基因組成份及一第二基因的核酸區(qū)段，因而，該第二基因的核酸區(qū)段自該第二類植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為該第二類病毒的外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。該等載體是該宿主植物中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物。當(dāng)該宿主植物生長(zhǎng)一段時(shí)間后，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可干擾每一所述基因在該等細(xì)胞中的表達(dá)，此干擾可通過(guò)一歸因于此干擾的基因改變、生化改變或表現(xiàn)型改變來(lái)確定。
本發(fā)明的再一方面提供了一種通過(guò)重組病毒載體(其由經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默引發(fā))來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法。使用一第一及第二重組病毒載體在宿主植物的一或多個(gè)位置感染植物細(xì)胞。該第一載體具有一第一類植物病毒的重組基因組成份及一第一基因的核酸區(qū)段，因而，該第一基因的核酸區(qū)段自該第一類植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為該第一類病毒的外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。該第二重組病毒載體具有一第二類植物病毒的重組基因組成份及一第二基因的核酸區(qū)段，因而，該第二基因的核酸區(qū)段自該第二類植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為該第二類病毒的外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。該等載體是該宿主植物中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物。該等載體于感染后能夠發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生該核酸區(qū)段(其存在于每一載體中)的一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。至少一個(gè)載體能夠在該宿主植物中發(fā)生系統(tǒng)移動(dòng)。使該宿主植物生長(zhǎng)一段時(shí)間后，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可干擾每一所述基因在該等細(xì)胞中的表達(dá)，此干擾可通過(guò)一歸因于此干擾的基因改變、生化改變或表現(xiàn)型改變來(lái)確定。
本發(fā)明的又一方面提供了一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法。該方法包括使用一重組病毒載體在宿主植物的一或多個(gè)位置感染該等細(xì)胞，該載體具有AlMV的重組基因組成份及選定基因的一核酸區(qū)段。該載體于感染后能夠發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生該核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。該核酸區(qū)段自該AlMV外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為該外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分，且該載體是該等細(xì)胞中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物。使該宿主植物生長(zhǎng)，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可干擾選定基因在該等細(xì)胞中的表達(dá)，此干擾可通過(guò)一歸因于此干擾的基因改變、生化改變或表現(xiàn)型改變來(lái)確定。該AlMV的重組基因組成份具有復(fù)制酶核酸、一編碼移動(dòng)蛋白的核酸序列及一編碼外殼蛋白的核酸序列(其中缺少一或多個(gè)足以防止外殼蛋白翻譯的核苷酸)。
本發(fā)明的另一方面提供了一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法。該方法包括使用一重組病毒載體在宿主植物的一或多個(gè)位置感染該等細(xì)胞。該載體具有一植物病毒的重組基因組成份、一第一基因的核酸區(qū)段(該區(qū)段恰位于移動(dòng)蛋白核酸序列的上游，其中該移動(dòng)蛋白核酸序列包含于AlMV的基因組成份中并受控于一同時(shí)亦控制該移動(dòng)蛋白序列的次基因組啟動(dòng)子)及一第二基因的核酸區(qū)段(該區(qū)段恰位于外殼蛋白核酸序列的上游，其中該外殼蛋白核酸序列包含于該植物病毒的基因組成份中并受控于一同時(shí)亦控制該外殼蛋白序列的次基因組啟動(dòng)子)。該載體于感染后能夠發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生該等核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。該載體是該等細(xì)胞中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物。使該宿主植物生長(zhǎng)一段時(shí)間。該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可干擾該第一或該第二基因在該等細(xì)胞中的表達(dá)，此干擾可通過(guò)一歸因于此干擾的基因改變、生化改變或表現(xiàn)型改變來(lái)確定。該植物病毒可為T(mén)MV或AlMV。


圖1為AlMV基因組的示意圖。
圖2為基于AlMV及TMV基因組且可引起基因沉默的重組病毒載體之改造策略示意圖。
圖3為使用AlMV RNA3改造的VMB-RBC(核酮糖二磷酸羧化酶，Rubisco)及VMB-bAS(β-香樹(shù)素合成酶)之示意圖。
圖4為供多基因沉默的各種載體設(shè)計(jì)之示意圖。
圖5是使用wt AlMV或NF1-P1感染的植物中之CP西方墨點(diǎn)分析。
圖6為10dpi(接種后天數(shù))時(shí)苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白在蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)的子葉(cot)、葉(l)及根(r)中之累積的西方墨點(diǎn)分析。
圖7為苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白在蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)的子葉(7dpi)及在受系統(tǒng)感染的葉片(14dpi)中之累積的西方墨點(diǎn)分析。
圖8為蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)的照片，其展示歸因于對(duì)Rubisco之干擾的表現(xiàn)型改變(圖示所有植物皆使用一用于VIGS的病毒載體感染)。
圖9為煙草屬植物(Nicotiana benthamiana)的照片，其展示歸因于Rubisco之干擾的表現(xiàn)型改變(右側(cè)植物使用一用于VIGS的病毒載體感染，左側(cè)植物為一對(duì)照植物)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及基因沉默，并提供了可選擇性干擾基因表達(dá)或功能的工具及方法?；虺聊捎谵D(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生。本發(fā)明揭示了通過(guò)經(jīng)RNA調(diào)介的基因沉默(RNA沉默)來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已熟知，RNA沉默是指一類相關(guān)的、序列特異性、RNA定向基因沉默機(jī)制。具體而言，本發(fā)明之方法允許通過(guò)RNA沉默將功能賦予一由植物細(xì)胞表達(dá)的基因。該沉默涉及核苷酸序列特異性RNA退化。本發(fā)明使用基于植物RNA病毒的病毒載體來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞RNA在宿主植物細(xì)胞中的核苷酸序列特異性退化。此載體亦可為該RNA沉默的犧牲品。因此，本文用于在植物中導(dǎo)致基因沉默的病毒載體可為該基因沉默的抑制劑及靶物二者。
通過(guò)使用本文所揭示的方法可干擾3種不同基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)。該等基因?yàn)闊煵蒉D(zhuǎn)基因P12植物中的AlMV復(fù)制酶基因(P1)、蒺藜狀苜蓿及煙草屬植物中的核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)(參見(jiàn)實(shí)例1及2)以及β-香樹(shù)素合成酶基因(數(shù)據(jù)未提供)。
因此，本文揭示了基于植物RNA病毒的重組病毒載體。該等載體被設(shè)計(jì)為能夠于感染后在宿主細(xì)胞中復(fù)制。病毒載體在宿主植物中的移動(dòng)被限制為可局部擴(kuò)散且不能在系統(tǒng)內(nèi)擴(kuò)散，或能夠在系統(tǒng)內(nèi)擴(kuò)散。一病毒的系統(tǒng)感染或系統(tǒng)擴(kuò)散能力是指該病毒能夠在細(xì)胞之間擴(kuò)散且能夠在該整個(gè)植物中或在該植物的大多數(shù)細(xì)胞中復(fù)制或表達(dá)的能力。該等載體各具有一核酸區(qū)段，該核酸區(qū)段對(duì)應(yīng)于希望用于沉默的特定植物表達(dá)細(xì)胞mRNA之全部或其一部分。換言之，通過(guò)簡(jiǎn)單地在病毒載體中插入一靶基因(選定基因)序列的單拷貝從而使該等復(fù)制載體中的序列定向于供破壞的特定轉(zhuǎn)錄物而達(dá)成沉默特異性。因此，該載體中的核酸區(qū)段為一異源核酸序列或?yàn)榉亲匀淮嬖谟谠摬《局胁迦胛恢玫男蛄?。該插入的核酸區(qū)段可含有若干核苷酸，此取決于選定基因及病毒載體。例如，該區(qū)段可具有20個(gè)核苷酸至300個(gè)核苷酸之長(zhǎng)度。例如，在大多數(shù)情況下，可使用至多具有200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段。將該核酸區(qū)段供至植物細(xì)胞及通過(guò)本發(fā)明載體在該等植物細(xì)胞中對(duì)該核酸區(qū)段的放大可達(dá)成對(duì)該靶基因的抑制或降低該靶基因的表達(dá)。
選定基因是內(nèi)源表達(dá)基因，其可為來(lái)源于宿主植物的基因(例如，Rubisco)或可為宿主植物(例如，煙草或苜蓿)中的轉(zhuǎn)基因(例如，病毒復(fù)制酶基因或冠嬰基因)。宿主植物的靶基因可選自一給定數(shù)據(jù)庫(kù)中的特殊序列(例如，開(kāi)放閱讀框或ORF)。業(yè)內(nèi)已知多個(gè)植物序列數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，已知可用于阿拉伯芥(Arabidopsis)、水稻、苜蓿(Medicago)及大豆等植物的序列數(shù)據(jù)庫(kù)。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者熟知許多可用來(lái)快速鑒定及篩選DNA序列中之開(kāi)放閱讀框(ORF)的工具。自每一靶基因的ORF，可選出一具有100至200個(gè)核苷酸的區(qū)段或更長(zhǎng)的區(qū)域。PCR可用于放大期望克隆于一病毒載體中之片段。該片段以同義/反義取向克隆于一病毒載體中，然后以該載體接種一宿主植物(例如，蒺藜狀苜蓿植物)。此外，熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可知擬插入該載體中的區(qū)段之取向。PCR產(chǎn)物可通過(guò)單步驟克隆直接克隆于病毒載體中。對(duì)于單步驟克隆而言，可采用下述策略。首先，自一靶基因選擇靶序列。然后，設(shè)計(jì)并合成引物。在期望限制位點(diǎn)(亦存在于該載體的多克隆位點(diǎn)中)引入5’及3’引物以將靶序列克隆于病毒載體中。實(shí)施PCR。使用其位點(diǎn)已在靶序列PCR期間引入的相同限制酶來(lái)消化PCR產(chǎn)物。經(jīng)消化的PCR產(chǎn)物接入載體中。在使用構(gòu)造研究靶基因的功能活性之前可先進(jìn)行序列確認(rèn)。
表1列出了各種基因的核酸區(qū)段實(shí)例及用來(lái)將此等區(qū)段克隆于本發(fā)明之重組植物病毒載體中的引物。
業(yè)內(nèi)已知，RNA病毒可通過(guò)互補(bǔ)的RNA鏈來(lái)復(fù)制其基因組。此病毒復(fù)制優(yōu)先于對(duì)選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的干擾。對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)或RNA沉默的干擾過(guò)程可始于當(dāng)復(fù)制載體的RNA量開(kāi)始增多時(shí)。例如，該過(guò)程可較早始于以載體接種植物后7天時(shí)，而重度RNA沉默可于感染后14天觀察到(參見(jiàn)下述實(shí)例)。通過(guò)對(duì)感染植物中之表現(xiàn)型改變與未感染對(duì)照植物或與那些以不能誘導(dǎo)基因沉默的載體感染的植物進(jìn)行比較可確定本發(fā)明病毒載體達(dá)成之干擾。本文所用表現(xiàn)型改變系指外觀或形態(tài)改變?；蛘撸虺憩F(xiàn)型改變外，所述干擾還可通過(guò)分析植物細(xì)胞所表達(dá)的選定基因之mRNA或蛋白質(zhì)而加以確定。因此，熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者應(yīng)了解，基因功能可在考慮具體表現(xiàn)型或其它改變之后賦予，其中該等具體表現(xiàn)型或其它改變系通過(guò)受本發(fā)明病毒載體感染的宿主植物中RNA沉默之干擾而直接或間接導(dǎo)致。
圖8中示出了受用于Rubisco沉默的病毒載體感染的蒺藜狀苜蓿之照片。與未圖示于此的對(duì)照相比，圖中植物顯示萎黃、小葉及灌木狀生長(zhǎng)。圖9示出了煙草屬植物的照片，其展示歸因于對(duì)Rubisco之干擾的表現(xiàn)型改變。右側(cè)植物使用一用于VIGS的病毒載體感染，與左側(cè)對(duì)照植物相反，該受感染植物顯示出小卷狀葉片。
由植物細(xì)胞表達(dá)的選定基因可為(例如)木質(zhì)素特異性基因、韌皮部特異性基因、類黃酮途徑基因、受體基因、激素基因、針對(duì)果實(shí)成熟的基因、針對(duì)脂肪酸合成的基因、用于淀粉或纖維素合成的基因、針對(duì)種子成熟的基因、針對(duì)種子發(fā)芽的基因、用于加速根部形成的基因、用于組織體外再生的基因、用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組織的基因、用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因、冠嬰基因、β-香樹(shù)素合成酶基因、Rubisco基因或查耳酮合成酶基因，其可發(fā)生一可歸因于此干擾的基因改變、生化改變或表現(xiàn)型改變。
用于實(shí)施本發(fā)明方法的重組病毒載體可通過(guò)操縱植物病毒(尤其為RNA病毒)的基因組成份來(lái)構(gòu)造。此等植物病毒可為單分裂、雙分裂或三分裂病毒且此等病毒已為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知?！盎蚪M”指病毒的全部基因材料。
該等病毒包括苜?；ㄈ~病毒(AlMV)、等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒、南瓜花葉病毒(例如，黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV))、線性病毒或煙草花葉病毒(煙草花葉病毒屬)(例如，煙草花葉病毒(TMV)、煙草蝕紋病毒(TEV)、花葉病毒(CMV))以及來(lái)自雀麥草花葉病毒屬的病毒(例如，雀麥草花葉病毒(BMV)、蠶豆斑點(diǎn)病毒及豇豆萎黃斑點(diǎn)病毒)。其它適宜病毒包括稻壞死病毒(RNV)、及雙粒病毒(例如，番茄金黃花葉病毒(TGMV)、木薯潛隱病毒(CLV)及玉蜀黍條紋病毒(MSV))。該等適宜病毒之群中之任一種皆可良好表征且已為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知。
本發(fā)明所用載體可為DNA或RNA形式。較佳的病毒載體為衍生自AlMV及TMV基因組的那些載體。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已使用該等載體(AlMV及TMV)在植物中產(chǎn)生多肽。參見(jiàn)美國(guó)專利第6,042,832號(hào)、WO96/12028及WO00/25574。在本發(fā)明的一尤佳實(shí)施例中，使用苜?；ㄈ~病毒(AlMV)來(lái)制備用于VIGS的載體。該載體可容納一給定基因(靶基因)的較大片段(例如長(zhǎng)度為300個(gè)核苷酸的片段)。AlMV為一正義RNA病毒(三分裂病毒)，其基因組由3個(gè)基因組RNA及次基因組RNA4組成。AlMV病毒粒由一特殊的蛋白質(zhì)(24kD)包覆并形成大小(長(zhǎng)度為30至60nm，直徑為18nm)及形狀(球形、橢賀形或桿形)不同的顆粒，視包殼RNA的大小而定。此外，AlMV具有較寬的宿主范圍，包括蒺藜狀苜蓿(如下所示)。
圖1示出了AlMV的基因組。圖1及其它圖中RNA3中的箭頭(->-)指示次基因組啟動(dòng)子。制備AlMV載體時(shí)，在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前，使用SmaI在病毒RNA序列的3’末端將對(duì)應(yīng)于AlMV的基因組RNA1、2(分別為pUT17及pUT27)、3(recRNA3)或次基因組RNA4(pSP65A4)的純化質(zhì)粒DNA線性化。在一較佳實(shí)施例中，靶基因的一區(qū)域被克隆于RNA3中并在植物中表達(dá)為基因組RNA3及次基因組RNA4的一部分。
該等載體可具有轉(zhuǎn)錄末端區(qū)域。轉(zhuǎn)錄末端區(qū)域是一用于控制該轉(zhuǎn)錄物3’末端形成的序列，例如聚腺苷酸化作用序列及自解離核酶。供在其它有機(jī)體中表達(dá)的末端信號(hào)已為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知。亦可包括供精確剪接轉(zhuǎn)錄物的序列。其實(shí)例為內(nèi)含子及轉(zhuǎn)座子。
圖2所示為基于供VIGS的載體的不同AlMV(2A及2B)及TMV(2C及2D)之示意圖。其中，圖2A及2C所示載體用于系統(tǒng)感染，圖2B及2D所示載體用于局部感染。字母“s”代表植物表達(dá)基因的核酸區(qū)段。例如，該區(qū)段可為Rubisco基因或β-香樹(shù)素合成酶基因，見(jiàn)圖3。
本文所用重組病毒載體可進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。當(dāng)裝配完重組基因組成份及異源核酸序列后，可將該組合置于一異源啟動(dòng)子之后(下游)，該啟動(dòng)子可驅(qū)使下游序列的體外轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生體外轉(zhuǎn)錄物。供體轉(zhuǎn)錄的有效異源啟動(dòng)子的實(shí)例包括噬菌體啟動(dòng)子，例如T7噬菌體啟動(dòng)子或SP6啟動(dòng)子。當(dāng)裝配完此一病毒載體/體外轉(zhuǎn)錄載體組合后，用于感染的體外轉(zhuǎn)錄物可通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生并與體外轉(zhuǎn)錄物中將病毒載體維持于植物細(xì)胞中所必需的任何其它病毒RNA混合。RNA可使用(例如)闡述于Yusibov等人之文獻(xiàn)(1998，Virology，2421-5)中的方法來(lái)產(chǎn)生。例如，AlMV RNA的體外轉(zhuǎn)錄物可根據(jù)制造商導(dǎo)則使用T7(對(duì)于基因組RNA1、2及3)或SP6(對(duì)于次基因組RNA4)RNA聚合酶(Promega，Madison，WI)及純化質(zhì)粒DNA來(lái)合成。反應(yīng)可于100μl體積中進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄物使用(例如)RNA帽結(jié)構(gòu)類似物m7G(5)ppp(5)G(Biolabs，Beverly，MA)封閉。
用于感染的體外轉(zhuǎn)錄物可通過(guò)熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知的任一技術(shù)施于植物細(xì)胞中。適宜技術(shù)包括但不限于手工接種(例如打磨接種，諸如葉片磨擦，在一緩沖溶液中磨擦)、機(jī)械噴霧接種、真空滲透、粒子轟擊及/或電穿孔。
體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的混合物包含感染性RNA1、2、3及次基因組RNA4，可用于通過(guò)電穿孔法接種宿主植物原生質(zhì)體(例如，煙草原生質(zhì)體)。經(jīng)電穿孔后約20小時(shí)時(shí)收集樣品并進(jìn)行過(guò)濾以實(shí)施病毒感染。此樣品的等分試樣可用于接種宿主植物(例如，蒺藜狀苜蓿種苗)。為了產(chǎn)生一野生型AlMV以供用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，可使用稀釋于FES緩沖液(2ng/μl)中的AlMV顆粒接種一適宜植物(例如，珊西煙(N.tabacum cv.Xanthi-nc)植物)的4片上部葉片(在6葉片階段)。接種后，可監(jiān)測(cè)植物是否受到病毒感染以及是否出現(xiàn)基因沉默和基因沉默的可見(jiàn)效果。
其中懸浮有重組載體以制備接種物的適宜緩沖溶液已為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知。例如，植物葉片可在向重組病毒載體的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中添加1份體積(v/v)FES緩沖液[1％(w/v)焦磷酸鈉，1％(w/v)變水鋯石(malacoid)，1％(w/v)C鹽，0.5M甘氨酸，0.3M K2HPO4，pH8.5，及磷酸]之后使用其進(jìn)行接種(如Yusibov等人于1997之文獻(xiàn)中所述)。體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及FES緩沖液的混合物可在使用金剛砂(粒度為320，F(xiàn)isher，Pittsburgh，PA)打磨葉片表面后施于葉片。通過(guò)輕微磨擦以擴(kuò)散接種物并進(jìn)一步打磨葉片表面來(lái)實(shí)施接種。
本發(fā)明涵蓋具有不同感染能力的不同類型載體。例如，可設(shè)計(jì)適宜載體用于系統(tǒng)感染。該等載體(如下文實(shí)例部分所述)在植物感染及靶基因沉默方面可非常高效。克隆于系統(tǒng)載體中的核酸區(qū)段(對(duì)于RNA沉默)可改造為在該區(qū)段的3′末端而不是在5′末端具有一起始密碼子(例如，ATG)。當(dāng)將此一片段置于一次基因組啟動(dòng)子的控制之下時(shí)，此片段并非自身進(jìn)行翻譯，而是為恰在該區(qū)段下游的序列提供起始密碼子，以便可翻譯該等下游序列。該等下游序列可為(例如)AlMV的P3或CP，其不具有起始密碼子，該起始密碼子可能已在載體消化及將核酸區(qū)段克隆于載體中的過(guò)程中丟失。該等載體亦可改造為，當(dāng)引發(fā)靶基因沉默的同時(shí)亦會(huì)引發(fā)載體破壞及載體自植物中消除(約于接種后15至20天)，從而可最小化對(duì)發(fā)生于靶基因沉默后的病毒感染癥狀(與RNA沉默無(wú)關(guān))之干擾。盡管AlMV(載體)可在受感染的蒺藜狀苜蓿植物中持續(xù)存在5個(gè)月以上，從而產(chǎn)生顯著的矮小綜合征，但上述經(jīng)改造的靶構(gòu)造可在接種后2至3周內(nèi)清除。在該等植物中，未見(jiàn)到矮小綜合征及殘余的病毒感染癥狀。
圖6顯示在使用能夠發(fā)生系統(tǒng)擴(kuò)散的AlMV病毒載體接種后病毒載體在一宿主植物的不同器官中的累積情況。更具體而言，該示意圖顯示了10dpi(接種后天數(shù))時(shí)苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白在蒺藜狀苜蓿的子葉(cot)、葉(l)及根(r)中之累積的西方墨點(diǎn)分析。圖7顯示苜?；ㄈ~病毒的西方墨點(diǎn)分析，其展示外殼蛋白在蒺藜狀苜蓿的子葉(7dpi)及在受系統(tǒng)感染的葉片(14dpi)中之累積。通過(guò)14dpi，病毒載體累積可顯著降低。
其它適宜載體亦可設(shè)計(jì)為僅能用于局部感染。該等載體(如下文實(shí)例部分所示)在植物感染及僅局部擴(kuò)散(例如，僅限制于接種葉片，不能在系統(tǒng)內(nèi)移動(dòng))方面可非常高效。本發(fā)明所用植物病毒載體需要通過(guò)外殼蛋白方可在系統(tǒng)內(nèi)移動(dòng)。但局部載體可設(shè)計(jì)為在外殼蛋白產(chǎn)生方面具有缺陷。通過(guò)使包括起始密碼子的開(kāi)放閱讀框之若干部分缺失從而外殼蛋白R(shí)NA序列不會(huì)發(fā)生翻譯可達(dá)成此設(shè)計(jì)。然而，對(duì)復(fù)制及細(xì)胞間移動(dòng)非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)序列(例如，5′及3′非編碼區(qū)域)必須到位。例如，基于TMV且缺乏CP序列及某些CP序列的Av序列。此等病毒載體仍保持在局部位置。為了測(cè)試載體是否能夠保持于局部位置且不在系統(tǒng)內(nèi)擴(kuò)散，可使用不含外殼蛋白的受感染細(xì)胞作為標(biāo)記物?；蛘?，可使用熒光標(biāo)記物(例如，可使用Av及Av+GFP作為可見(jiàn)的沉默標(biāo)記物)。
局部載體(例如系統(tǒng)載體)在植物細(xì)胞中復(fù)制一段時(shí)間后，不僅會(huì)對(duì)基因表達(dá)造成干擾，而且會(huì)對(duì)載體累積造成干擾(即，定向于載體及基因二者的RNA)。該感染不會(huì)擴(kuò)散于感染區(qū)域之外的范圍。例如，如果一葉片受到感染，則該感染不會(huì)擴(kuò)散于該葉片之外。
業(yè)內(nèi)已知，基因組激活及系統(tǒng)感染皆需要病毒外殼蛋白基因。然而，基因組激活及系統(tǒng)感染并不需要全長(zhǎng)序列。例如，業(yè)內(nèi)已知，許多氨基酸(多達(dá)12個(gè)氨基酸)可自AlMV外殼蛋白N末端去除而不改變其系統(tǒng)功能。自AlMV外殼蛋白去除14個(gè)以上的氨基酸會(huì)使該蛋白失去其系統(tǒng)功能。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已熟知多種自核酸序列去除序列的方法。因此，本發(fā)明亦可使用具有突變型或缺失型外殼蛋白核酸序列或病毒基因組成份的載體，以使載體保持于局部范圍。亦可將去除及改造方法用于病毒的其它核酸序列，例如，編碼移動(dòng)蛋白的序列。
本發(fā)明亦允許抑制受感染植物中一個(gè)以上的基因。在一實(shí)施例中，就基因沉默的此一方面而言，本發(fā)明載體可具有一核酸區(qū)段，該核酸區(qū)段對(duì)應(yīng)于希望用于沉默的特定植物表達(dá)細(xì)胞mRNA之全部或其一部分。例如，具有200個(gè)核苷酸的核酸區(qū)段可具有長(zhǎng)度各為50個(gè)鄰接核苷酸的序列片段(基于4個(gè)不同的植物表達(dá)基因之序列)且該等序列片段各對(duì)應(yīng)于特定植物表達(dá)細(xì)胞mRNA之全部或其一部分。因此，核酸區(qū)段可構(gòu)造為具有4個(gè)長(zhǎng)度各為50個(gè)鄰接核苷酸的子區(qū)段。每一子區(qū)段旨在用于特定mRNA的退化，且具有此一核酸區(qū)段的復(fù)制病毒載體可干擾4個(gè)不同基因的表達(dá)。因此，該等載體可用于多基因沉默。
在多基因沉默的另一實(shí)施例中，本發(fā)明之一載體可具有兩個(gè)核酸區(qū)段，該等核酸區(qū)段對(duì)應(yīng)于希望用于沉默的特定植物表達(dá)細(xì)胞mRNA之全部或其一部分。將此兩個(gè)核酸區(qū)段插入載體的不同位置。其中每一核酸區(qū)段可具有上段所述的用于多基因沉默的子區(qū)段。圖4顯示了用來(lái)干擾2個(gè)不同的內(nèi)源基因在一宿主植物中之表達(dá)的載體之示意圖。靶基因片段可在2個(gè)次基因組啟動(dòng)子下的2個(gè)位置插入基因組RNA3(圖4A)。在本文中，該類型的載體被稱為供雙重沉默的載體。核酸區(qū)段被表達(dá)為基因組及次基因組RNA(移動(dòng)蛋白(P3)及外殼蛋白(CP))的一部分而非P3及CP之ORF的一部分。此類型的載體可用于系統(tǒng)感染。在圖4B中，在2個(gè)次基因組啟動(dòng)子下的2個(gè)位置將靶基因插入基因組RNA3，但該載體具有一無(wú)效CP，因而不能在系統(tǒng)內(nèi)擴(kuò)散。次基因組啟動(dòng)子可為自體啟動(dòng)子、異源啟動(dòng)子或合成啟動(dòng)子。
在各種情況下，無(wú)論是局部情況還是系統(tǒng)情況，皆可將核酸區(qū)段克隆為基因組或次基因組RNA的一部分。然而，此等部分不是P3或CP ORF的一部分且未對(duì)該等區(qū)段進(jìn)行翻譯。
本發(fā)明載體可在不同生長(zhǎng)階段施與，例如，可在苗期、葉期、開(kāi)花期、種子形成期及成熟期通過(guò)根、子葉、葉、種皮、種子、莢果或枝干接種等途徑施與。載體接種物可在宿主植物的一或多個(gè)位置施與。例如，該接種物可在葉片及根部同時(shí)或相繼施與?；蛘?，該接種物可在同一位置(例如，在一給定葉片上)以連續(xù)間隔施與多次。此時(shí)間間隔可視實(shí)驗(yàn)條件及擬沉默的靶基因而定?？蓪煞N類型的能夠誘導(dǎo)兩種不同基因的載體(例如局部及系統(tǒng)載體)混合在一起并在一給定位置或一個(gè)以上的位置處施與。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種通過(guò)由重組病毒載體引發(fā)的RNA沉默來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中表達(dá)的方法，其中該載體不能在該宿主植物的系統(tǒng)內(nèi)移動(dòng)。該病毒載體具有該選定基因的的一核酸區(qū)段，且該載體被設(shè)計(jì)為能夠于感染后發(fā)生自我復(fù)制并在受感染細(xì)胞中產(chǎn)生該核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。該核酸區(qū)段可自該植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為該外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分。或者，該核酸區(qū)段可自一合成次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，且該核酸區(qū)段獨(dú)立于該外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的mRNA表達(dá)。
本發(fā)明的另一方面提供了一種干擾一個(gè)以上的基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法。例如，提供了兩種不同類型的載體，其中每一類型皆能夠使一不同于另一載體的基因沉默。所使用的該第一類型的重組病毒載體(例如，TMV)具有一第一基因的核酸區(qū)段，該第二類型的重組病毒載體(例如，TMV)具有一第二基因的核酸區(qū)段。亦可使用異源載體使兩個(gè)不同的基因沉默。例如，可使用具有一第一類植物病毒(例如，單分裂病毒，例如TMV)的重組基因組成份的第一重組病毒載體及具有一第二類植物病毒(例如，三分裂病毒，例如AlMV)的重組基因組成份的第二重組病毒載體。該等載體中至少有一類或兩類皆可為系統(tǒng)載體。
在本發(fā)明方法中亦涵蓋嵌合病毒載體。例如，可使TMV的外殼蛋白核酸序列失活并可將一異源外殼蛋白核酸序列(例如，AlMV)插入?？蓪⒃摦愒赐鈿さ鞍缀怂嵝蛄懈脑鞛槭乖撦d體能夠在系統(tǒng)內(nèi)移動(dòng)或保持于局部區(qū)域。此一嵌合載體中的系統(tǒng)擴(kuò)散功能系由異源外殼蛋白序列賦予。圖3C為T(mén)MV嵌合載體的示意圖。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已將嵌合病毒載體用于在植物中產(chǎn)生多肽的場(chǎng)合。
本發(fā)明亦涉及能夠在一適宜宿主植物中誘導(dǎo)RNA沉默的組合物及重組體外轉(zhuǎn)錄物。因此，本發(fā)明方法及組合物系提供用于干擾基因在植物中之表達(dá)的新穎方法。
除非另外指明，否則，本發(fā)明使用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)、病毒學(xué)技術(shù)、重組DNA技術(shù)且尤其使用免疫學(xué)技術(shù)來(lái)實(shí)施，該等技術(shù)皆屬于此項(xiàng)技術(shù)領(lǐng)域。用于實(shí)施本發(fā)明的重組植物病毒核酸可使用業(yè)內(nèi)已知的技術(shù)來(lái)構(gòu)造。簡(jiǎn)言之，通過(guò)諸如限制酶切、填充突出端以提供鈍端、連接體鏈接等操作可提供片段互補(bǔ)端以便進(jìn)行連接及鏈接。在實(shí)施各步驟的過(guò)程中使用克隆來(lái)制得期望的病毒基因組成份及異源核酸組合，以放大DNA量并允許分析此DNA從而確保該等操作皆以正確方式實(shí)施?？墒褂枚喾N克隆載體，其中克隆載體包括一在大腸桿菌中發(fā)揮功能的復(fù)制系統(tǒng)及一允許選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)記物。實(shí)例載體包括pBR332、pUC系列、M13mp系列、pACYCl84等用于操縱一級(jí)DNA構(gòu)造的載體，參見(jiàn)Life Technologies Catalogue(1999)及Amersham PharmaciaBiotech Catalogue(1999)。因此，可在一適當(dāng)限制酶切位點(diǎn)將序列插入載體中，所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主，使大腸桿菌生長(zhǎng)于一適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，收集并裂解細(xì)胞，回收質(zhì)粒。分析可包括序列分析、限制酶切分析、電泳或諸如此類。在每一操作后，可對(duì)擬用于最終構(gòu)造的DNA序列進(jìn)行限制酶切并將其連接于下一序列，其中各局部構(gòu)造可克隆于相同或不同質(zhì)粒中。標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)中已闡述了多種適宜技術(shù)，此等技術(shù)已為業(yè)內(nèi)所熟知。DNA操作及酶處理皆根據(jù)制造商的推薦程序進(jìn)行。
植物及植物組織(即，將外源DNA穩(wěn)定納入植物中)的基因轉(zhuǎn)化可采用多種技術(shù)實(shí)施且此等技術(shù)已為業(yè)內(nèi)所熟知。此包括通過(guò)土壤桿菌(agrobacterium)種屬之轉(zhuǎn)化及通過(guò)直接基因轉(zhuǎn)移之轉(zhuǎn)化。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)的土壤桿菌載體通過(guò)一轉(zhuǎn)化方案(例如，如Moloney等人于1989，Plant Cell Rep.，8238-242以及Hinchee等人于1988，Bio/Technol.，6915-922中所述)或業(yè)內(nèi)已熟知的其它技術(shù)將嵌合DNA構(gòu)造引入自雙子葉植物(例如，煙草及十字花科蕓苔屬植物)獲得的宿主細(xì)胞中。例如，使用T-DNA來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞已收到了廣泛的研究結(jié)果，此詳細(xì)闡述于Knauf等人(1983)之Genetic Analysis of Host RangeExpression by Agrobacterium，p245，InMolecular Genetics of theBacteria-Plant Interaction，Puhler，A.ed.，Springer-Verlag，NY、Hoekema等人(1985)之Chapter V，InThe Binary Plant Vector SystemOffset-drukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam以及An等人(1985)之EMBO J.，4277-284中。簡(jiǎn)言之，外植體可與根瘤土壤桿菌(A.tumefaciens)或發(fā)根土壤桿菌(A.rhizogenes)一起培育，以便將轉(zhuǎn)錄構(gòu)造轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中。在使用土壤桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化之后，將植物細(xì)胞分散于適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇，隨后回收愈傷組織、枝條并最后回收植株。土壤桿菌宿主中將引入一質(zhì)粒，該質(zhì)粒中含有將T-DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中所需的病毒基因。另請(qǐng)參見(jiàn)Dodds，J-ed.，Plant Genetic Engineering，Cambridge University Press，Cambridge(1985)。
使用非土壤桿菌技術(shù)時(shí)允許使用本文所述構(gòu)造來(lái)達(dá)成在各種單子葉及雙子葉植物以及其它有機(jī)體中的表達(dá)及轉(zhuǎn)化。該等技術(shù)尤其適用于那些在土壤桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中難以處理的種屬。其它基因轉(zhuǎn)移技術(shù)包括基因槍(Sanfoid，1988，Trends in Biotech，6299-302)、電穿孔法(Fromm等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，825824-5828；Riggs及Bates，1986，Proc.Natl.AcadSci.U.S.A.825602-5606)或PEG調(diào)介的DNA吸收法(Potrykus等人，1985，Mol.Gen.Genet.，199169-177)。
根據(jù)本發(fā)明，各種高等及低低植物均屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的宿主植物。成熟植物、籽苗及種子皆包括于本發(fā)明范圍內(nèi)。成熟植物指處于除籽苗階段之外任何發(fā)育階段的植物。籽苗指處于早期發(fā)育階段的非常幼小且未成熟的植物。具體而言，可用作宿主來(lái)產(chǎn)生外源序列及多肽的植物包括但不限于被子植物(Angiosperms)、苔蘚植物(Bryophytes)(例如，苔綱(Hepaticae)(苔類(liverworts))植物及蘚綱(蘚類)(Musci(mosses)植物)、蕨類植物(Pteridophytes)(例如，蕨類(ferns)、木賊屬(horsetails)及石松類(lycopods))、裸子植物(Gymnosperm)(例如，針葉植物(conifers)、蘇鐵(cycads)、銀杏(Ginkgo)及買(mǎi)麻藤目(Gnetales)植物)及藻類(包括綠藻(Chlorophyceae)、褐藻(Phaeophpyceae)、紅藻(Rhodophyceae)、藍(lán)藻(Myxophyceae)、黃藻(Xanthophyceae)及裸藻(Euglenophyceae))。
用于基因沉默的宿主植物視選定植物及地理位置而定可于體內(nèi)及/或體外生長(zhǎng)。重要的是，選定植物適于在適宜田間條件及/或體外條件下培育。植物的生長(zhǎng)條件闡述于各種關(guān)于植物學(xué)、農(nóng)學(xué)、分類學(xué)及植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)書(shū)籍中且已為業(yè)內(nèi)所熟知。
本發(fā)明特別涵蓋，在被子植物中可使用各科作物及/或與作物相關(guān)的成員。用于本發(fā)明方法的植物成員亦包括種間及/或?qū)匍g雜交、誘變及/基因改造植物。該等科包括且不限于豆科(豆科牧草)(Leguminosae(Fabaceae))，包括豌豆、苜蓿及大豆；禾本科(Gramineae(Poaceae))，包括水稻、玉米及小麥；茄科(Solanaceae)，尤其為番茄屬(Lycopersicon)(尤其為番茄類(esculentum(番茄)))，茄屬(Solanum)(尤其為馬鈴薯種(tuberosum(馬鈴薯))及茄子類(melongena(茄子)))，辣椒屬(Capsicum)(尤其為胡椒類(Capsicum annum(胡椒))、煙草屬及諸如此類)；傘形科(Umbelliferae)，尤其為胡蘿卜屬(geneiaDaucus)(尤其為胡蘿卜類(carota(胡蘿卜))及旱芹類(Apium)，尤其為芹菜類(graveolens dulce(芹菜))及諸如此類)；蕓香科(Rutaceae)，尤其為柑橘屬(genera Citrus(橙子))及諸如此類；菊科植物(Compositae)，尤其為萵苣屬(genus Lactuca species sativa(萵苣))及諸如此類；十字花科植物(Family Cruciferae)，尤其為十字花科蕓苔屬(genera Brassica)及芥菜種(Sinapis)。十字花科(family Brassicaceae)“營(yíng)養(yǎng)”作物成員的實(shí)例包括但不限于雙染色體四倍體植物(例如，芥菜(Brassica juncea(L.)Czern.(mustard))，埃塞俄比亞芥菜(B.carinata Braun(ethopian mustard)))及單基因二倍體植物(例如，棉花(B.oleracen(L.)(cole crops))，黑芥(B.nigra(L.)Koch(black mustard))，白菜型油菜(B.campestris(L)(turnip rape))，及蘿卜(Raphanus sativus(L)(radish)))。十字花科“油籽”作物成員的實(shí)例包括但不限于甘藍(lán)型油菜(B napus(L)(油菜籽))、油菜(B.campestris(L.))、葉用芥菜(B.tourNifortii)及白芥(B，tounrifortii Sinapis alba(L)(white mustard))。本發(fā)明亦涵蓋亞麻植物。
尤佳的宿主植物是那些可被AlMV感染的植物。例如，業(yè)內(nèi)已知苜蓿花葉病毒具有全宿主范圍。已知可受此病毒感染的其它種屬為咖啡黃葵(Abelmoschusesculentus)、大花藿香薊(Ageratum conyzoides)、大車(chē)前(Amaranthuscaudatus)、反枝莧(Amaranthus retroflexus)、金魚(yú)草(Antirrhinum majus)、旱芹(Apium graveolens)、根洋芹(Apium graveolens var rapaceum)、落花生(Arachis hypogaea)、黃耆(Astragalus glycyphyllos)、紅添菜(Betavulgaris)、蔓菁(Brassica campestris ssp rapa)、金盞菊(Calendulaofficinalis)、菜椒(Capsicum annuum)、辣椒(Capsicum frutescens)、蘭香草(Caryopteris incana)、長(zhǎng)春花(Catharanthus roseus)、青葙(Celosiaargentea)、桂竹香(Cheiranthus cheiri)、灰菜(Chenopodium album)、紅藜(Chenopodium amaranticol)、綠藜(Chenopodium murale)、白藜(Chenopoditim quinoa)、鷹嘴豆(Cicer arietinum)、Cichium endiva、芫荽(Ciandrun sativum)、美麗豬屎豆(Crotalaria spectabilis)、甜瓜(Cucumismelo)、黃瓜(Cucumis sativus)、北瓜(Cucurbita pepo)、瓜兒豆(Cyamopsistetragonoloba)、胡蘿卜(Daucus carota(var.saliva))、美國(guó)石竹(Dianthusbarbatus)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一點(diǎn)紅(Emilia sagittata)、甜蕎(Fagopyrum esculentum)、大豆(Glycine max)、千日紅(Gomphrenaglobosa)、向日葵(Helianthus annuus)、紫花鵲豆(Lablab purpureus)、萵苣(Lactuca sativa)、香豌豆屬(Lathyrus odatus)、小扁豆(Lens culinaris)、普通亞麻(Linum usitatissimum)、羽扇豆(Lupinus albus)、番茄(Lycopersiconesculentum)、寬翼豆(Macroptilium lathyroides)、錦葵(Malva parvifla)、紫羅蘭(Matthiola incana)、苜薺頭(Medicago hispida)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、白香草木樨(Melilotus albus)、印地安南西煙草(Nicotianabigelovii)、克利夫蘭煙(Nicotiana clevelandii)、debneyi煙(Nicotianadebneyi)、心葉煙(Nicotiana glutinosa)、megalosiphon煙(Nicotianamegalosiphon)、馬合煙草(Nicotiana rustica)、林生煙草(Nicotianasylvestris)、角蒿(Nicotiana tabacum)、香菜(Ocimum basilicum)、矮牽牛(Petunia hybrida)、白扁豆(Phaseolus lunatus)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、山梅(Philadelphus)、洋酸漿(Physalis flidana)、小果酸漿(Physalis peruviana)、美國(guó)商陸(Phytolacca americana)、豌豆(Pisumsativum)、野生馬鈴薯種(Solanum demissum)、茄子(Solanum melongena)、龍葵(Solanum nigrum)、茄屬植物(Solanum nodiflum)、刺萼龍葵(Solamimrostratum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、苣荬菜(Sonchus oleraceus)、菠菜(Spinacia oleracea)、魚(yú)腸菜(Stellaria media)、番杏(Tetragoniatetragonioides)、黃花苜蓿(Trifolium dubium)、雜三葉(Trifoliumhybridum)、絳三葉(Trifolium incarnatum)、紅三葉(Trifolhim pratense)、白三葉(TrifoHum repens)、地三葉草(Trifolium subterraneum)、金蓮花(tropaeolum majus)、歐洲繡球(Viburnum opulus)、蠶豆(Vicia faba)、綠豆(Yigna radiata)、豇豆(Vigna unguiculata)、長(zhǎng)豇豆(Yigna unguiculatassp sesquipedalis)及百日菊(Zinnia elegans)。
下述實(shí)例進(jìn)一步闡釋了本發(fā)明，但當(dāng)然不應(yīng)將其理解為以任何方式限制其范圍。除非另外詳細(xì)說(shuō)明，下述實(shí)例皆使用業(yè)內(nèi)所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施。
實(shí)例1在轉(zhuǎn)基因P12植物中由RNA觸發(fā)的AlMV復(fù)制酶基因(P1)的基因沉默對(duì)于轉(zhuǎn)基因P12植物中AlMV復(fù)制酶基因(P1)的VIGS而言，在RNA4的次基因組啟動(dòng)子的控制下將用于編碼AlMV P1蛋白質(zhì)(RNAl)C末端的長(zhǎng)度為100個(gè)核苷酸的區(qū)段改造于AlMV的基因組RNA3中。使用重組病毒構(gòu)造(NF1-P1)來(lái)接種表達(dá)AlMV P1及P2(P12)復(fù)制酶基因的轉(zhuǎn)基因野生型煙草(Nicotianatabacum(N.tabacum)cv.Samsun NN)植物。接種時(shí)，在用金剛砂(粒度為320，F(xiàn)isher，Pittsburgh，PA)打磨葉片表面后將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以1∶2稀釋于FES緩沖液中的混合物(RNA4∶RNA3＝1∶1000)施與轉(zhuǎn)基因P12植物的葉片，并輕輕磨擦葉片表面，以使接種物擴(kuò)散及進(jìn)一步打磨此表面。在接種后14天時(shí)，通過(guò)免疫印跡法評(píng)價(jià)葉片樣品是否存在AlMV CP。圖5所示為受wt AlMV或NF1-P1感染的植物中之CP的西方墨點(diǎn)分析。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)移至一膜中并與不同的抗體反應(yīng)。對(duì)AlMV CP具有特異性的單克隆抗體僅在自受wt RNA3感染的植物中得到的提取物中識(shí)別出24.0kDa蛋白質(zhì)。如圖5所示，僅能在接種有野生型RNA3的植物中檢測(cè)出AlMV CP，但不能在自接種有重組RNA3(含有來(lái)自AlMV RNA1的序列)的植物獲得的樣品中檢測(cè)出AlMVCP。這些結(jié)果表明，RNA1轉(zhuǎn)基因沉默化后可導(dǎo)致對(duì)AlMV RNA的抑制。
實(shí)例2在蒺藜狀苜蓿及煙草屬植物中由RNA觸發(fā)的核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)的基因沉默以w/t AlMV(c+)或重組病毒(bis)(含有來(lái)自核酮糖二磷酸羧化酶短鏈前驅(qū)體的片段)接種植物。在7dpi時(shí)病毒在bis的子葉中達(dá)到期望累積并與c+的累積相當(dāng)。然而，14dpi后，AlMV CP在bis中的累積與c+的累積相比顯著降低。此結(jié)果與在使用含有查耳酮合成酶基因的病毒感染期間所觀測(cè)到的圖片相似。此類病毒累積降低未在wt AlMV感染期間觀測(cè)到。因此，AlMV累積的降低可能是由基因沉默所致。
結(jié)果如圖6及圖7所示。圖6示出了在使用能夠在系統(tǒng)內(nèi)擴(kuò)散的病毒載體接種后AlMV外殼蛋白在宿主植物的不同器官中的累積情況。更具體而言，圖示顯示了10dpi(接種后天數(shù))時(shí)苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白在蒺藜狀苜蓿的子葉(cot)、葉(l)及根(r)中之累積的西方墨點(diǎn)分析。圖7所示為苜?；ㄈ~病毒的西方墨點(diǎn)分析，其展示外殼蛋白在蒺藜狀苜蓿的子葉(7dpi)及在受系統(tǒng)感染的葉片(14dpi)中的累積情況。應(yīng)注意，在14dpi時(shí)，AlMV外殼蛋白累積顯著降低。
實(shí)例3在蒺藜狀苜蓿植物中由RNA觸發(fā)的β-香樹(shù)素合成酶(bAS)基因的基因沉默為了驗(yàn)證β-香樹(shù)素合成酶基因在蒺藜狀苜蓿植物中的沉默，使用一AlMV載體(含有一供蒺藜狀苜蓿之β-香樹(shù)素合成酶基因的區(qū)段)感染該等植物。5dpi時(shí)該等植物的西方墨點(diǎn)分析顯示CP在植物中局部顯著累積。14dpi后的西方墨點(diǎn)分析顯示感染植物中的CP顯著降低或不存在。使用自受野生型AlMV感染的植物(陽(yáng)性對(duì)照)、受重組AlMV病毒載體(含有β-香樹(shù)素合成酶片段)感染的植物及健康植物獲得的葉片樣品進(jìn)行西方墨點(diǎn)分析。本文中未提供數(shù)據(jù)。
本說(shuō)明書(shū)引用的所有出版物及參考文獻(xiàn)(包括但不限于專利)皆以引用方式全部并入本文中，就如同已特定地及個(gè)別地指明將各個(gè)出版物或參考文獻(xiàn)之整體內(nèi)容以引用的方式并入一般。盡管已參照具體實(shí)施例闡述了本發(fā)明，但熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者應(yīng)了解，可對(duì)該等方法及組合物進(jìn)行各種改變，此意味著本發(fā)明可以未特定闡述于本文中的其它方式來(lái)實(shí)施。因此，本發(fā)明包括涵蓋于如權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明之精神及范疇的所有修改。
表1基因片段及PCR引物的序列

權(quán)利要求
1.一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾一選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法，其中所述基因沉默由一重組病毒載體引發(fā)；該方法包括(a)使用所述重組病毒載體在一宿主植物的一或多個(gè)位置感染所述植物細(xì)胞，所述病毒載體包含一植物病毒的重組基因組成份及所述選定基因的一核酸區(qū)段，其中所述載體于感染后能夠在所述細(xì)胞中發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生所述核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但不能在所述宿主植物內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)移動(dòng)；其中所述核酸區(qū)段自所述植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為所述外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；及(b)使所述宿主植物生長(zhǎng)，其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將干擾所述選定基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選定基因來(lái)自所述宿主植物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述選定基因是木質(zhì)素特異性基因、韌皮部特異性基因、類黃酮途徑基因、受體基因、激素基因、針對(duì)果實(shí)成熟的基因、針對(duì)種子成熟的基因、針對(duì)種子發(fā)芽的基因、用于加速根部形成的基因、用于組織體外再生的基因、用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組織的基因、用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因、冠嬰基因、β-香樹(shù)素合成酶基因、Rubisco基因或查耳酮合成酶基因。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選定基因是所述宿主植物中的一轉(zhuǎn)基因。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因是植物病毒復(fù)制酶基因或冠嬰基因。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因來(lái)自于單子葉或雙子葉植物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述次基因組啟動(dòng)子不是所述外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子，而是一合成次基因組啟動(dòng)子，且所述核酸區(qū)段獨(dú)立于所述mRNA表達(dá)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒是單分裂病毒。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述病毒是煙草花葉病毒。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒是三分裂病毒。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述病毒是AlMV、等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒或黃瓜花葉病毒。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸區(qū)段不會(huì)就此出現(xiàn)在所述植物病毒的基因組中。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核酸區(qū)段至少由約20個(gè)核苷酸組成。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核酸區(qū)段至多由200個(gè)核苷酸組成。
15.一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾一選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法，該方法包括(a)使用一重組病毒載體在一宿主植物的一或多個(gè)位置感染所述細(xì)胞，其中所述重組病毒載體是所述細(xì)胞中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物；所述載體包含一植物病毒的重組基因組成份及所述選定基因的一核酸區(qū)段，其中所述載體于感染后能夠在所述細(xì)胞中發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生所述核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但不能在所述宿主植物內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)移動(dòng)；其中所述核酸區(qū)段自所述植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為所述外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；及(b)使所述宿主植物生長(zhǎng)，其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將干擾所述選定基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)。
16.一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾一選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)及一重組載體在所述細(xì)胞中之累積的方法，該方法包括(a)使用所述重組病毒載體在一宿主植物的一或多個(gè)位置感染所述細(xì)胞，其中所述重組病毒載體是所述宿主植物中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物；所述病毒載體包含一植物病毒的重組基因組成份及所述選定基因的一核酸區(qū)段，其中所述病毒載體于感染后能夠在所述位置發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生所述核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但不能在所述宿主植物內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)移動(dòng)；其中所述核酸區(qū)段自所述植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為所述外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；及(b)使所述宿主植物生長(zhǎng)，其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將干擾所述選定基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)及所述重組病毒載體的累積，其中此干擾可通過(guò)一歸因于此干擾的基因改變、生化改變或表現(xiàn)型改變來(lái)確定。
17.一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾一選定基因在一宿主植物的植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法，其中所述基因沉默由一重組病毒載體引發(fā)；該方法包括(a)使用至少兩種類型的重組病毒載體在所述宿主植物的一或多個(gè)位置感染所述細(xì)胞，從而使所述載體中的每一載體于感染后皆能夠在所述位置發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生一核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中所述核酸區(qū)段存在于所述載體的每一載體中，此核酸區(qū)段亦可見(jiàn)于所述植物表達(dá)的基因之一中；其中所述核酸區(qū)段自所述植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為所述外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；其中一第一類型的重組病毒載體包含一植物病毒的重組基因組成份及一第一基因的核酸區(qū)段；其中一第二類型的重組病毒載體包含所述植物病毒的重組基因組成份及一第二基因的核酸區(qū)段；其中所述載體是所述宿主植物中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物；及(b)使所述宿主植物生長(zhǎng)，其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將干擾所述選定基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述載體構(gòu)造為使所述載體能夠進(jìn)行有限的細(xì)胞間移動(dòng)但不能在所述宿主植物內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)移動(dòng)。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述第一及第二載體在所述宿主植物的相同位置或不同位置同時(shí)或依序施與。
20.一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾選定基因在一宿主植物的植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法，其中所述基因沉默由一重組病毒載體引發(fā)；該方法包括(a)使用一第一重組病毒載體及一第二重組病毒載體在一或多個(gè)位置感染所述宿主植物，從而使所述載體中的每一載體于感染后皆能夠在所述位置發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生一核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中所述核酸區(qū)段存在于所述載體的每一載體中，此核酸區(qū)段亦可見(jiàn)于所述植物表達(dá)的基因之一中；其中所述第一重組病毒載體包含一第一類植物病毒的重組基因組成份及一第一基因的核酸區(qū)段，從而使所述第一基因的核酸區(qū)段自所述第一類植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為所述第一類病毒的外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；其中所述第二重組病毒載體包含一第二類植物病毒的重組基因組成份及一第二基因的核酸區(qū)段，從而使所述第二基因的核酸區(qū)段自所述第二類植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為所述第二類病毒的外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；其中所述載體是所述宿主植物中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物；及(b)使所述宿主植物生長(zhǎng)，其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將干擾所述基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第一及第二載體在所述宿主植物的相同位置或不同位置同時(shí)或依序施與。
22.一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法，其中所述基因沉默由一重組病毒載體引發(fā)；該方法包括(a)使用一第一重組病毒載體及一第二重組病毒載體在一宿主植物的一或多個(gè)位置感染所述細(xì)胞，所述第一載體包含一第一類植物病毒的重組基因組成份及一第一基因的核酸區(qū)段，從而使所述第一基因的核酸區(qū)段自所述第一類植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為所述第一類病毒的外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；所述第二載體包含一第二類植物病毒的重組基因組成份及一第二基因的核酸區(qū)段，從而使所述第二基因的核酸區(qū)段自所述第二類植物病毒外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為所述第二類病毒的外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；其中所述載體是所述宿主植物中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物；其中所述載體中的每一載體于感染后皆能夠發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生所述核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中所述核酸區(qū)段存在于所述載體的每一載體中，及其中所述載體中的至少一個(gè)載劑能夠在所述宿主植物中進(jìn)行系統(tǒng)移動(dòng)；及(b)使所述宿主植物生長(zhǎng)，其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將干擾所述基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述第一及第二載體在所述宿主植物的相同位置或不同位置同時(shí)或依序施與。
24.一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾一選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法，該方法包括(a)使用一重組病毒載體在一宿主植物的一或多個(gè)位置感染所述細(xì)胞，所述載體包含AlMV的一重組基因組成份及所述選定基因的一核酸區(qū)段，其中所述載體于感染后能夠發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生所述核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中所述核酸區(qū)段自所述AlMV外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因的次基因組啟動(dòng)子表達(dá)，并被表達(dá)為所述外殼蛋白基因或移動(dòng)蛋白基因之信使RNA(mRNA)的一部分；其中所述載體是所述細(xì)胞中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物；及(b)使所述宿主植物生長(zhǎng)，其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將干擾所述選定基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述AlMV的重組基因組成份包括復(fù)制酶核酸、一編碼移動(dòng)蛋白的核酸序列及一編碼外殼蛋白的核酸序列，所述外殼蛋白編碼的核酸序列中缺少一或多個(gè)足以防止外殼蛋白翻譯的核苷酸。
26.一種通過(guò)經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默來(lái)干擾選定基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法，該方法包括(a)使用一重組病毒載體在一宿主植物的一或多個(gè)位置感染所述細(xì)胞，所述載體包括一植物病毒的重組基因組成份；一第一基因的核酸區(qū)段，所述區(qū)段恰位于移動(dòng)蛋白核酸序列的上游，其中所述移動(dòng)蛋白核酸序列包含于所述AlMV的基因組成份中并受控于一同時(shí)亦控制所述移動(dòng)蛋白序列的次基因組啟動(dòng)子；一第二基因的核酸區(qū)段，所述區(qū)段恰位于外殼蛋白核酸序列的上游，其中所述外殼蛋白核酸序列包含于所述植物病毒的基因組成份中并受控于一同時(shí)亦控制所述外殼蛋白序列的次基因組啟動(dòng)子；其中所述載體于感染后能夠發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生所述核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；及其中所述載體是所述細(xì)胞中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物；及(b)使所述宿主植物生長(zhǎng)，其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將干擾所述第一或所述第二基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)，此干擾可通過(guò)一歸因于此干擾的基因改變、生化改變或表現(xiàn)型改變來(lái)確定。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述植物病毒為T(mén)MV或AlMV。
全文摘要
本發(fā)明揭示了使用復(fù)制重組病毒載體來(lái)干擾基因在植物細(xì)胞中之表達(dá)的方法。一宿主植物在一或多個(gè)位置受到一重組病毒載體的感染。該載體是該等植物細(xì)胞中經(jīng)RNA觸發(fā)的基因沉默的抑制劑及靶物。該載體于感染后能夠發(fā)生自我復(fù)制并產(chǎn)生一核酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可干擾特定基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1768143SQ03822979
公開(kāi)日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月25日
發(fā)明者維達(dá)季·尤西波夫 申請(qǐng)人:美國(guó)弗勞恩霍夫股份有限公司