一種樟疫霉菌的lamp檢測(cè)引物組合物及其lamp檢測(cè)試劑盒和lamp檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種樟疫霉菌的LAMP檢測(cè)引物組合物及其LAMP檢測(cè)試劑盒和LAMP檢測(cè)方法。該LAMP檢測(cè)引物組合物由正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環(huán)引物L(fēng)F和反向環(huán)引物L(fēng)B組成。本發(fā)明的檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、操作方便、實(shí)用性好、實(shí)現(xiàn)了恒溫?cái)U(kuò)增，同時(shí)還為樟疫霉菌的檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，可用于樟疫霉菌的高靈敏度快速檢測(cè)，同時(shí)在病害侵染初期鑒定出病原物，能夠?qū)μ镩g土壤中的樟疫霉菌進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明對(duì)樟疫霉菌引起的疫病防治和對(duì)減少農(nóng)藥盲目使用，降低生產(chǎn)成本，減少農(nóng)藥的環(huán)境污染也具有重要意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種樟疫霉菌的LAMP檢測(cè)引物組合物及其LAMP檢測(cè)試劑 盒和LAMP檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及樟疫霉菌的LAMP檢測(cè)引物組合物及其LAMP 檢測(cè)試劑盒和LAMP檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 樟疫霉菌（Phytophthora cinnamomi)屬于卵菌門(mén)（Oomycota)、卵菌綱 (Oomycetes)、霜霉目（Peronosporales)、腐霉科（Pythiaceae)、疫霉屬（Phytophthora)。 樟疫霉可侵染樟屬植物引起根部腐爛以及枝干潰瘍等病害，會(huì)對(duì)樟屬植物造成毀滅性打 擊。樟疫霉菌寄主廣泛，可以侵染上千種植物。據(jù)報(bào)道，樟疫霉已經(jīng)造成澳大利亞西南地區(qū) 森林發(fā)生結(jié)構(gòu)和植物種群變化，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到當(dāng)?shù)刈匀簧鷳B(tài)系統(tǒng)以及生物多樣性。目前 對(duì)該病害還沒(méi)有有效的防治措施，加強(qiáng)檢疫，防止病原菌的傳播擴(kuò)散是控制該病的最有效 措施。為此應(yīng)加強(qiáng)疫情監(jiān)測(cè)，建立快速檢測(cè)方法，為病害的風(fēng)險(xiǎn)及研究決策提供依據(jù)，從而 有利于降低樟樹(shù)疫病引起的損失。
[0003] 傳統(tǒng)的樟疫霉菌的分類(lèi)鑒定主要是基于形態(tài)學(xué)特征、致病性測(cè)定、生理生化特征 等。傳統(tǒng)的分離疫霉菌的方法采用誘捕法從土壤、灌溉水和植物材料中分離疫霉菌。為了 提高誘捕效果，可在土壤溶液中加入少量抗生素和殺菌劑抑制雜菌生長(zhǎng)。適用于做誘餌的 植物材料因不同疫霉菌也有所不同，松針適合用于誘捕樟疫霉菌。傳統(tǒng)方法在樟疫霉菌檢 測(cè)中發(fā)揮了重要作用，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且要求操作者具備專(zhuān)業(yè)的疫霉菌分離、形態(tài)學(xué)鑒定 知識(shí)和豐富的經(jīng)驗(yàn)；同時(shí)傳統(tǒng)分類(lèi)鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、易受人為及環(huán)境等諸多因素 的干擾，不能在病害潛伏期和發(fā)病初期做出診斷，很難對(duì)病害發(fā)生進(jìn)行及時(shí)的監(jiān)測(cè)和有效 控制。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。普 通PCR的方法已經(jīng)成功用于檢測(cè)樟疫霉菌，雖然PCR法在特異性和敏感性上有較大的提高， 但是檢測(cè)時(shí)間仍然比較長(zhǎng)，大概4?5h，同時(shí)PCR法依賴(lài)精密的溫度循環(huán)裝置，其檢測(cè)靈敏 度比較高、檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，不能滿(mǎn)足快速檢測(cè)的需求。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種 新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，因其操作簡(jiǎn)單、快速、特異性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為可以替代PCR的新 的核酸擴(kuò)增技術(shù)。它是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異的引物，在Bst大片段聚合酶 的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60?65°C范圍80min內(nèi)，大量合成目標(biāo)DNA的同時(shí)伴隨 有副產(chǎn)物一白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。由于LAMP擴(kuò)增過(guò)程依賴(lài)識(shí)別靶序列6個(gè)獨(dú)立區(qū) 域，所以反應(yīng)特異性很強(qiáng)，并且核酸擴(kuò)增過(guò)程是在恒溫條件下進(jìn)行，普通水浴鍋或有穩(wěn)定熱 源的設(shè)備就能滿(mǎn)足反應(yīng)要求，檢測(cè)成本大大降低。由于LAMP反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)等 特征，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。自L(fǎng)AMP檢測(cè)技術(shù)建立14年以來(lái)，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng) 用于對(duì)病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、真菌等病原菌的檢測(cè)研究，但在植物病原卵菌的檢測(cè)報(bào)道很少， 樟疫霉菌的檢測(cè)國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中樟疫霉菌生物學(xué)檢測(cè)方法所需周期長(zhǎng)、檢測(cè)方法特異 性差、靈敏度低的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種樟疫霉菌的LAMP檢測(cè)引物組合物。本發(fā) 明的另一目的是提供上述樟疫霉菌的LAMP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明另一目的是提供上述樟疫 霉菌的LAMP檢測(cè)方法。
[0006] 技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種用于檢測(cè)樟疫霉菌的LAMP檢測(cè)引物組合物：由正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物 BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環(huán)引物L(fēng)F和反向環(huán)引物L(fēng)B組成；各引物序列具體 如下：
[0008] FIPji -CAGTCAGCTCCACGAAC-AGCTCCAGATTGTACGTCCTTCGC-3，；
[0009] BIPji -AGGAGCGTTTCCGCACGATC-CGTGACGTCGTACACCAC-3，；
[0010] F3:5，-ACGGCAAGACCATCAAGC-3，；
[0011] B3 :5' -ACGTTGTTGAACGACTCCTG-3';
[0012] LF:5，-TCCAACAGGCGAATAGGACC-3，；
[0013] LB:5' -ACTAGCAGCTACTACCGCG-S'。
[0014] 所述的LAMP檢測(cè)引物組合物在檢測(cè)樟疫霉菌中的應(yīng)用。
[0015] 一種檢測(cè)樟疫霉菌的LAMP檢測(cè)試劑盒：包含ImL檢測(cè)溶液，所述的檢測(cè)溶液包括： 32mM正向內(nèi)引物FIP、32mM反向內(nèi)引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM正 向環(huán)引物L(fēng)F、8mM環(huán)引物L(fēng)B、48mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)2S04、0.24mM MgS0 4、4% Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 單位，200mM 羥基萘酚藍(lán)；其中，各引物 序列具體如下：
[0016] FIPji -CAGTCAGCTCCACGAAC-AGCTCCAGATTGTACGTCCTTCGC-3，；
[0017] BIPji -AGGAGCGTTTCCGCACGATC-CGTGACGTCGTACACCAC-3，；
[0018] F3:5，-ACGGCAAGACCATCAAGC-3，；
[0019] BS=Si -ACGTTGTTGAACGACTCCTG-3;；
[0020] LF:5，-TCCAACAGGCGAATAGGACC-3，；
[0021] LB:5' -ACTAGCAGCTACTACCGCG-S'。
[0022] 所述的檢測(cè)樟疫霉菌的LAMP試劑盒在檢測(cè)樟疫霉菌中的應(yīng)用。
[0023] -種檢測(cè)樟疫霉菌的LAMP檢測(cè)方法：包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA 為模板，利用LAMP檢測(cè)引物組合物或LAMP檢測(cè)試劑盒進(jìn)行LAMP ;擴(kuò)增產(chǎn)物觀(guān)察LAMP反應(yīng) 溶液顏色變化，天藍(lán)色表示陽(yáng)性結(jié)果，存在樟疫霉菌；紫色表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，不存在樟 疫霉菌。
[0024] 所述的檢測(cè)樟疫霉菌的LAMP檢測(cè)方法：提取待檢微生物的DNA，取1 μ L DNA溶液， 加入23 μ L LAMP試劑盒中的檢測(cè)溶液和1 μ L滅菌去離子水進(jìn)行LAMP，LAMP反應(yīng)程序?yàn)椋?60°C?65°C,60 ?80min。
[0025] 本發(fā)明的檢測(cè)樟疫霉菌的方法，包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模 板，利用所述的LAMP引物組合物進(jìn)行LAMP ;輕基萘酚藍(lán)（hydroxylnaphthol blue，HNB)屬 于金屬離子指示劑的一種。HNB是Mg2+的滴定劑，其顏色隨溶液PH變化而改變，因此可以 通過(guò)監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)體系中Mg 2+濃度的變化及溶液PH而起到顏色指示劑的作用。反應(yīng)前 將HNB加入到反應(yīng)液中，反應(yīng)體系呈紫色，反應(yīng)過(guò)程中Mg2+與LAMP反應(yīng)的副產(chǎn)物P2O廣結(jié)合 產(chǎn)生大量沉淀，溶液中Mg2+濃度降低，pH發(fā)生變化，從而使HNB的顏色由紫色變?yōu)樘焖{(lán)色。 因此，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)反應(yīng)體系的顏色變化，來(lái)判斷樟疫霉菌的有無(wú)：天藍(lán)色表示檢測(cè)為陽(yáng) 性，存在樟疫霉菌；紫色表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，不存在樟疫霉菌。
[0026] 本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)之一是樟疫霉菌的高效特異擴(kuò)增的引物序列及其擴(kuò)增方法。 為了驗(yàn)證樟疫霉菌的特異性引物序列，本發(fā)明以10株樟疫霉菌菌株和14種其它卵菌以及 17種病原真菌為供試材料（表1)，采用CTAB法提取發(fā)病組織中樟疫霉菌的DNA。具體方法 如下：取少量菌絲粉，加900 μ L 2% CTAB提取液和90 μ L 10% SDS，漩渦混勻，于55°C水浴 lh，中間每IOmin上下顛倒幾次。12000rpm離心lOmin，取上清加等體積酚/氯仿/異戊醇 (25 :24 :1)，顛倒混勻，12000rpm離心IOmin ;將上清轉(zhuǎn)移至新管，加等體積氯仿，輕輕顛倒 混勻，12000rpm離心5min。上清轉(zhuǎn)移至新管中，加2倍體積的無(wú)水乙醇和1/10體積的3M 似八(：(?!15.2)，-201：沉淀（>111)。12000印111離心101^11，傾去上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩 次，室溫晾干。加適量滅菌超純水或TE (pH 8.0)溶解沉淀（含20 μ g/mL RNase)，37°C處理 Ih后，-20°C保存?zhèn)溆?。所有的土壤樣品采用FastDNAK SPIN試劑盒（Q-Biogene Ltd，USA) 進(jìn)行DNA的提取。土壤DNA提取步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。這一商用土壤微生物DNA提取試 劑盒可以在〇. 5h內(nèi)提取到土壤中的微生物。
[0027] 表1用于檢測(cè)樟疫霉菌特異性的真菌和卵菌菌株
[0028]
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)樟疫霉菌的LAMP引物組合物，其特征在于：由正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi) 引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環(huán)引物L(fēng)F和反向環(huán)引物L(fēng)B組成；各引物序 列具體如下： FIP^' - CAGTCAGCTCCACGAAC-AGCTCCAGATTGTACGTCCTTCGC -3'； BIP^' - AGGAGCGTTTCCGCACGATC-CGTGACGTCGTACACCAC -3'； F3:5， -ACGGCAAGACCATCAAGC-3，； B3:5' -ACGTTGTTGAACGACTCCTG-3'; LF# -TCCAACAGGCGAATAGGACC-3，； LB:5' - ACTAGCAGCTACTACCGCG -3'。
2. 權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物在檢測(cè)樟疫霉菌中的應(yīng)用。
3. -種檢測(cè)樟疫霉菌的LAMP試劑盒，其特征在于：包含lmL檢測(cè)溶液，所述的檢測(cè)溶 液包括：32mM正向內(nèi)引物FIP、32mM反向內(nèi)引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物 B3、8mM 正向環(huán)引物 LF、8mM 環(huán)引物 LB、48mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM (NH4)2S04、0.24mM MgS04、4%Triton X-100、Bst DNA polymerase 320 單位，200mM羥基萘酚藍(lán)；其 中，各引物序列具體如下： FIP^' - CAGTCAGCTCCACGAAC-AGCTCCAGATTGTACGTCCTTCGC -3'； BIP^' - AGGAGCGTTTCCGCACGATC-CGTGACGTCGTACACCAC -3'； F3:5， -ACGGCAAGACCATCAAGC-3，； B3:5' -ACGTTGTTGAACGACTCCTG-3'; LF# -TCCAACAGGCGAATAGGACC-3，； LB:5' - ACTAGCAGCTACTACCGCG -3'。
4. 權(quán)利要求3所述的檢測(cè)樟疫霉菌的LAMP試劑盒在檢測(cè)樟疫霉菌中的應(yīng)用。
5. -種檢測(cè)樟疫霉菌的方法，其特征在于：包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA 為模板，利用LAMP引物組合物或LAMP試劑盒進(jìn)行LAMP ;觀(guān)察LAMP反應(yīng)溶液顏色變化，天 藍(lán)色表示檢測(cè)為陽(yáng)性，存在樟疫霉菌；紫色表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，不存在樟疫霉菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)樟疫霉菌的方法，其特征在于：提取待檢微生物的DNA， 取2 ii L DNA溶液，加入23 ii L LAMP試劑盒中的檢測(cè)溶液進(jìn)行LAMP，LAMP反應(yīng)程序?yàn)椋?60°C?65°C，60-80 min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀(guān)察。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104372104SQ201410742299
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】戴婷婷, 葉建仁, 吳小芹, 李明杰, 付歡 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)