一株具有抗甜瓜枯萎菌和抗甜瓜疫霉菌活性的植物乳桿菌ab-4及其應用
【專利說明】一株具有抗甜瓜枯萎菌和抗甜瓜疫霉菌活性的植物乳桿菌 AB-4及其應用 【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，特別涉及一株分離自蒙古國酸駝奶的植物乳桿菌菌株 (LactobacillusplantarumAB-4)，以及所述植物乳桿菌在發(fā)酵制品、生物農(nóng)藥或果蔬保 鮮劑中的應用。 【技術(shù)背景】
[0002] 植物的所有侵染性病害中，真菌性病害數(shù)量最為繁多，約占所有病害數(shù)量的70% 以上。甜瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌甜瓜?；停‵usariumoxysporumf.sp.Melonis)引起 的病害，從苗期到生長發(fā)育期均可染病，常造成大片瓜田植株枯萎死亡，是危害甜瓜種植業(yè) 的重要土傳病害。目前，化學防治是控制甜瓜枯萎病的主要措施，但是長期使用化學農(nóng)藥會 使病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且其化學殘留和污染環(huán)境等弊端不符合現(xiàn)代社會所提倡的綠色無 公害廣品。
[0003] 甜瓜疫霉病是由甜瓜疫霉菌（PhytophthoradrechsleriTucker)感染甜瓜植株 引起的真菌病害，甜瓜疫霉病是甜瓜生產(chǎn)上重要病害，一旦發(fā)病則難于控制。葉、莖和果實 均可被侵染。同樣地，化學防治是目前控制甜瓜疫霉病的主要措施。因此，現(xiàn)有技術(shù)中缺乏 綠色、無公害的真菌病害防治方法。
[0004] 乳酸菌的抑菌機理主要表現(xiàn)在以下五個方面：一是乳酸菌產(chǎn)生乙酸、丙酸、乳酸和 苯乳酸等有機酸，使環(huán)境中的pH值顯著降低且保持酸性，抑制不耐酸有害菌的生長繁殖； 二是乳酸菌產(chǎn)生抗生素或細菌素的蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)，對有害菌有抑制或殺滅作用；三是 乳酸菌產(chǎn)生的過氧化氫能激活過氧化氫酶一硫氰酸系統(tǒng)，抑制或殺滅有害菌；四是乳酸菌 產(chǎn)生的二氧化碳可抑制部分霉菌和革蘭氏陰性菌；五是乳酸菌通過拮抗作用與有害菌競爭 營養(yǎng)物質(zhì)，從而達到抑菌作用。
[0005] 然而，現(xiàn)有的乳酸菌大多只對大腸桿菌等常見致病菌具有抑制作用。《來源于酸馬 奶的植物乳桿菌BX6-2抑制甜瓜疫霉菌的研宄》（《天津科技大學學報》25卷1期）公開了 一株具有抗甜瓜疫霉活性的植物乳桿菌Bx6-2,并公開了其對甜瓜疫霉抑制率達58%。然 而，并沒有公開該菌株對于其他致病菌是否同樣具有抑制活性。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一株對多種病菌具有抑制活性的植物 乳桿菌，能夠應用于多種作物病害的防治中，實現(xiàn)綠色、無公害的真菌病害防治，即生物防 治技術(shù)，具有無殘留、無污染、成本低、兼防兼治、增產(chǎn)增收、保持生態(tài)平衡、能起到長效的效 果。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一株具有抗菌活性的植物乳桿菌（Lactobaci1lus plantarum)AB-4,已于2014年9月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物菌種保藏中心，保藏號為CGMCCNo. 9656。
[0008] 本發(fā)明還提供上述植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)AB_4在抗甜瓜枯萎和 甜瓜疫霉菌的應用。
[0009] 本發(fā)明還提供上述植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)AB_4在農(nóng)藥和果蔬保 鮮劑中的應用。
[0010] 本發(fā)明還提供上述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)AB_4在發(fā)酵制品中的 應用。
[0011] 以下將更詳細地說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0012] 在本發(fā)明中，將用到以下培養(yǎng)基：
[0013]MRS瓊脂培養(yǎng)基的組成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、 Tweeen801ml、磷酸二氫鈉2g、無水乙酸鈉5g、梓檬酸三胺2g、硫酸猛0. 02g、硫酸鎂0.lg， 蒸餾水1L，調(diào)節(jié)pH至6. 2左右，瓊脂15g，121°C、15min滅菌后倒到培養(yǎng)皿形成平板。
[0014]MRS液體培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、Tweeen 801ml、磷酸二氫鈉2g、無水乙酸鈉5g、梓檬酸三胺2g、硫酸猛0. 02g、硫酸鎂0.lg，蒸餾水 1L，調(diào)節(jié)pH至6. 2左右，121°C、15min滅菌。
[0015]M17培養(yǎng)基的組成是：胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、肉蛋白胨5g、酵母粉2. 5g、抗 壞血酸0. 5g、硫酸鎂0. 25g、二鈉甘油19g、瓊脂llg、蒸餾水1L。
[0016]TPY增菌培養(yǎng)液的組成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋 白胨5g、磷酸氫二鉀2. 5g、磷酸二氫鉀2. 5g、硫酸鎂0.lg、吐溫800. 25g、L-半胱氨酸鹽酸 鹽 〇? 5g、蒸餾水 1L，121°C、15min滅菌。
[0017] 本發(fā)明的植物乳桿菌（L.plantarum)AB_4 是從酸蛇奶（fermentedCamelmilk) 中分離的新型植物乳桿菌，將采集的乳制品樣品（酸駝奶）做梯度稀釋后（10_4，10_ 5，10_6) 涂布于含有放線菌酮（〇?lwt%，0XID公司）和硫酸粘菌素（0?lwt%，0XID公司）的MRS瓊 脂培養(yǎng)基或者M17瓊脂培養(yǎng)基（0XID公司）上，30°C厭氧培養(yǎng)48h~72h，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接 于TPY增菌培養(yǎng)液中，30°C培養(yǎng)24h~48h，劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24h~ 48h，觀察記錄菌落形態(tài)和革蘭氏染色細胞形態(tài)特征，并同時進行過氧化氫酶試驗。將革蘭 氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌，暫定為乳酸菌。將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中， 37°C培養(yǎng)24h~48h后備用。
[0018] 觀察所得備用菌株形態(tài)學特性：細胞呈直桿狀，有圓形末端，長3. 0-8. 0ym，寬 0. 9-1. 2ym，呈單個、成對，或短鏈狀出現(xiàn)（見圖1)，有些菌能減少硝酸鹽，偶爾有些菌株表 現(xiàn)出擬過氧化氫酶活性。
[0019] 觀察所得備用菌株的菌落形態(tài)特性：在MRS瓊脂培養(yǎng)基上生長形成乳白色菌落， 不透明，圓形，表面光滑，中央凸起，直徑約為1. 2-1. 5mm(見圖2)。
[0020] 所得備用菌株的分子生物學鑒定：將冷凍保存的備用菌株接種于TPY增菌培養(yǎng)液 中，30°C恒溫培養(yǎng)24h，經(jīng)TPY增菌培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)2~3代后，取2mL對數(shù)生長末期的菌體 培養(yǎng)物置于無菌EP管內(nèi)離心，經(jīng)8000Xg離心3min(4°C)后收集菌體，棄上清，采用乳酸菌 專用CTAB凍融法提取菌株的基因組DNA。
[0021] 采用通用引物，正向引物是27f(對應于Escherichia coil8-27位堿基）： 5' -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3 反向引物是1495r(對應于Escherichia coil 1495-1515位堿基）：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'，以菌體DNA為擴增模板PCR擴增16S rRNA基因區(qū)域，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后進行16SrRNA基因序列測定，然后通過基因序列比對和 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研宄進行種屬鑒定，得到待篩選的菌株，其系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖（見圖3)。
[0022] 制備植物乳桿菌上清液：
[0023] 把凍存的待篩選的菌株接種到5mL的MRS液體培養(yǎng)基中，震蕩混勻，37°C恒溫培養(yǎng) 24h，以2%的接種量連續(xù)活化三代，取第三代的發(fā)酵液以4000Xg離心lOmin，取上清，上清 液經(jīng)0? 22um微膜過濾，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0024] 利用打孔法測定待復篩的植物乳桿菌的抗甜瓜枯萎活性：
[0025] 將在PDA(PotatoDextroseAgar)培養(yǎng)基（OXID公司）上活化好的甜瓜枯萎菌用 PBS緩沖液洗下來制成105的孢子菌懸液，把菌懸液按1% (V/V)接入PDA培養(yǎng)基中，震蕩 混勻，然后把含菌培養(yǎng)基倒到培養(yǎng)皿中，制成含菌平板。
[0026] 在每個平板上用8_打孔器均勻打出2個小孔并標注植物乳桿菌的測試編號，每 孔加入100yL相對應植物乳桿菌MRS發(fā)酵上清液，于4°C冰箱中擴散12h后37°C培養(yǎng)恒溫 48h，觀測抑菌圈的大小。選取小孔周圍有明顯和較大抑菌圈（抑菌圈>30. 00