專利名稱：一種三七為原料制作適宜惡疫霉菌產(chǎn)生游動(dòng)孢子的液體培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域中ー種植物病原菌惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)產(chǎn)生游動(dòng)孢子的液體培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
惡疫霉(Phytophthora cactorum Schroet),屬卵菌門疫霉屬病原菌,是全世界范圍內(nèi)廣泛分布的重要植物病原菌，能侵染約60個(gè)科、50個(gè)屬中的約200種植物。惡疫霉菌通常以菌絲體和卵孢子在病殘?bào)w和土壌中越冬。翌年條件適宜時(shí)菌絲直接侵染寄主，或形成大量游動(dòng)孢子囊傳播到地上部侵染莖葉。孢子囊在該病的傳播和蔓延中起著非常重要的 作用。通常，在室內(nèi)進(jìn)行致病力測(cè)定或其它相關(guān)生物學(xué)特性研究時(shí)均需要制備孢子囊懸浮液。目前，誘導(dǎo)惡疫霉產(chǎn)生孢子囊的方法主要采用菌絲水培法，主要方式有(I)將培養(yǎng)好的菌絲體置于裝有消毒土壌浸出液或滅菌蒸餾水的皮氏培養(yǎng)液中，再將培養(yǎng)皿置于熒光燈下照射3天，每天振蕩皿液3次，第三次補(bǔ)充液體，并在8°C下培養(yǎng)2小時(shí)使游動(dòng)孢子釋放。(2)從菌落邊緣切取菌絲塊放入15ml 10% V6培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置于25°C、黑暗中培養(yǎng)3d，然后將菌絲挑入倒有15ml滅菌蒸餾水的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于25°C下光照3d，每天換水I次。孢子囊產(chǎn)生后將盛有大量孢子囊的培養(yǎng)皿放入4°C冰箱中15min后，移至25°C下靜置20min，誘使大量游動(dòng)孢子產(chǎn)生。各種水培法在實(shí)施過程中所用試驗(yàn)材料繁多，試驗(yàn)步驟較多，操作復(fù)雜，且在有些供試液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生的孢子囊不容易釋放出游動(dòng)孢子，嚴(yán)重影響下ー步試驗(yàn)的開展。因此，迫切需要一種篩選出ー種原料簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便的液體培養(yǎng)基，使惡疫霉能在該液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子用于相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種使惡疫霉菌產(chǎn)生游動(dòng)孢子的液體培養(yǎng)基。本發(fā)明克服了目前利用惡疫霉菌菌絲水培法誘導(dǎo)產(chǎn)生游動(dòng)孢子原料繁多、操作復(fù)雜、游動(dòng)孢子釋放難的缺點(diǎn)，提供了一種簡(jiǎn)便易行的在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)大量產(chǎn)生游動(dòng)孢子的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用三七(Panax Notoginseng(Burk. )F. H. Chen)為原料制作液體培養(yǎng)基用于惡疫霉菌產(chǎn)生游動(dòng)孢子。以三七為原料制作適宜惡疫霉菌產(chǎn)生游動(dòng)孢子的液體培養(yǎng)基，具體制作方法為，一年生三七整株洗凈切碎后按w/v為I : 2的比例加入去離子水于榨汁機(jī)中榨汁，將所得三七汁用四層紗布過濾后用含O. 02% (w/v)CaCO3去離子水稀釋至含三七汁10% 50%(v/v)，分裝后以O(shè). 103MPa、121°C、高壓蒸氣滅菌20min。將滅菌液體培養(yǎng)基倒入滅菌的9cm直徑培養(yǎng)皿中，每皿倒15ml。培養(yǎng)液冷卻后用直徑5mm的打孔器在已培養(yǎng)3d的菌落邊緣打取菌塊接種于液體培養(yǎng)基中，每皿放入5個(gè)菌絲塊。將接種后的培養(yǎng)皿置于25°C下黑暗培養(yǎng)5d后，將液體培養(yǎng)基倒掉，用無菌水繼續(xù)培養(yǎng)2d后，更換一次無菌水，再培養(yǎng)5d后便產(chǎn)生大量孢子嚢。隨后將培養(yǎng)皿置于4°C冰箱中處理30-60min，再置于25°C下培養(yǎng)l_2h，孢子囊開始大量釋放出游動(dòng)孢子。本發(fā)明的有益效果是利用三七這ー惡疫霉菌的自然寄主為原料制作的液體培養(yǎng)基就能產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子，克服了以往采用2種或多種蔬菜不同比例混合才能獲取大量游動(dòng)孢子的繁雜操作。另外，該培養(yǎng)基原材料較易獲取，培養(yǎng)基的制作和游動(dòng)孢子產(chǎn)生的程序簡(jiǎn)單易學(xué)，且這種方法可以用于孢子囊形態(tài)的鑒定、惡疫霉菌致病 力測(cè)定中游動(dòng)孢子懸浮液的制備等相關(guān)的研究，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例三七液體培養(yǎng)基與其它液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢子囊能力及游動(dòng)孢子釋放能力差異比較I、液體培養(yǎng)基制作(I)萵苣培養(yǎng)基(10% ):萵苣洗凈切碎后于榨汁機(jī)中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : 9比例混勻。(2)萵苣培養(yǎng)基(50% ):萵苣洗凈切碎后于榨汁機(jī)中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : I比例混勻。(3)番茄培養(yǎng)基(10% ):番茄洗凈切碎后于榨汁機(jī)中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : 9比例混勻。(4)番茄培養(yǎng)基(50% ):番茄洗凈切碎后于榨汁機(jī)中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : I比例混勻。(5)三七培養(yǎng)基(10% ):三七洗凈切碎后于榨汁機(jī)中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : 9比例混勻。(6)三七培養(yǎng)基(25% ):三七洗凈切碎后于榨汁機(jī)中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : 3比例混勻。(7)三七培養(yǎng)基(50% ):三七洗凈切碎后于榨汁機(jī)中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾后與含O. 02% CaCO3去離子水按體積比I : I比例混勻。(8)番茄萵苣培養(yǎng)基(10% ):將番茄和萵苣洗凈切碎后于榨汁機(jī)中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾，按番茄與萵苣體積比I : 2的比例混合，再將混合液用含O. 02% CaCO3去離子水稀釋至10%。(9)番茄萵苣培養(yǎng)基(50% ):將番茄和萵苣洗凈切碎后于榨汁機(jī)中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾，按番茄與萵苣體積比I : 2的比例混合，再將混合液用去含O. 02%CaCO3尚子水稀釋至50%。(10)番茄三七培養(yǎng)基(10% ):將番茄和三七洗凈切碎后于榨汁機(jī)中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾，按番茄與三七體積比I : 2的比例混合，再將混合液用含O. 02%CaCO3去離子水稀釋至10%。(11)番茄三七培養(yǎng)基(50% ):將番茄和三七洗凈切碎后于榨汁機(jī)中榨汁，所得汁液用四層紗布過濾，按番茄與三七體積比I : 2的比例混合，再將混合液用含O. 02%CaCO3去尚子水稀釋至50%。將上述培養(yǎng)基分別分裝后于O. 103MPa, 121 °C，高壓蒸氣滅菌20min。冷卻至40°C左右制作液體培養(yǎng)基。2、不同培養(yǎng)基產(chǎn)生游動(dòng)孢子能力差異測(cè)定用直徑5mm的打孔器在已培養(yǎng)3d的菌落邊緣打取菌塊，置于上述11種不同液體培養(yǎng)基中，每皿放入5個(gè)菌絲塊。將接種后的培養(yǎng)皿置于25°C下黑暗培養(yǎng)5d，將液體培養(yǎng)基倒棹，用無菌水繼續(xù)培養(yǎng)2d后，更換一次無菌水，再培養(yǎng)5d后調(diào)查液體培養(yǎng)基中孢子囊產(chǎn)生量。每個(gè)培養(yǎng)基重復(fù)3次。每次調(diào)查從培養(yǎng)皿中用五點(diǎn)法取五塊Icm2大小的菌絲塊，顯微鏡10倍目鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野菌絲塊上產(chǎn)生的孢子囊數(shù)量，統(tǒng)計(jì)分析不同液體培養(yǎng)基產(chǎn)生孢子囊能力的差異。 待不同液體培養(yǎng)基中惡疫霉菌大量產(chǎn)生孢子囊后，將培養(yǎng)皿置于4°C冰箱中30-60min，再取出置于25°C下培養(yǎng)，觀察計(jì)數(shù)不同液體培養(yǎng)基中游動(dòng)孢子釋放的比例，統(tǒng)計(jì)分析不同液體培養(yǎng)基中游動(dòng)孢子釋放能力的差異。惡疫霉菌在三七液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生孢子囊及游動(dòng)孢子釋放的能力明顯高于其它供試培養(yǎng)基(表I)。另外，三七液體培養(yǎng)基中三七汁的濃度不同對(duì)產(chǎn)孢量和游動(dòng)孢子釋放量也有影響，三七培養(yǎng)基(10% ) >三七培養(yǎng)基(25% ) >三七培養(yǎng)基(50% )。表I三七培養(yǎng)基與其他培養(yǎng)基產(chǎn)孢子囊及游動(dòng)孢子能力差異比較

權(quán)利要求
1.ー種以三七為原料制作適宜惡疫霉菌產(chǎn)生游動(dòng)孢子的液體培養(yǎng)基，其特征在于，具體制作方法為，一年生三七整株洗凈切碎后按w/v為I : 2的比例加入去離子水于榨汁機(jī)中榨汁，將所得汁液用四層紗布過濾后用含O. 02% (w/v) CaCO3的去離子水稀釋至含三七汁10% 50% (v/v)，分裝后以O(shè). 103MPa、121°C、高壓蒸氣滅菌20min ;將滅菌培養(yǎng)基倒入滅菌的培養(yǎng)皿中制成液體培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以三七為原料制作適宜惡疫霉菌產(chǎn)生游動(dòng)孢子的液體培養(yǎng)基，具體制作方法為，一年生三七整株洗凈切碎后按w/v為1∶2的比例加入去離子水于榨汁機(jī)中榨汁，將所得三七汁液用四層紗布過濾后用含0.02％CaCO3的去離子水稀釋至含三七汁10％～50％(v/v)，分裝后以0.103MPa、121℃、高壓蒸氣滅菌20min。該培養(yǎng)基原材料容易獲取，培養(yǎng)基的制作和游動(dòng)孢子產(chǎn)生的程序簡(jiǎn)單易學(xué)，大大提高了惡疫霉菌游動(dòng)孢子產(chǎn)生的效率，為病原菌接種體的制備提供了極大的便利。
文檔編號(hào)C12N3/00GK102839147SQ201210323189
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者楊敏, 朱書生, 朱貴李, 梅馨月, 何霞紅, 李成云, 朱有勇 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)