專(zhuān)利名稱(chēng)：神經(jīng)干細(xì)胞的傳代分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)，涉及一種傳代分離神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展是由于神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少或功能改變?cè)斐傻摹Ｍㄟ^(guò)移植神經(jīng)前體細(xì)胞可治療相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其機(jī)制是替代減少和病變的神經(jīng)細(xì)胞、分泌神經(jīng)保護(hù)因子和調(diào)節(jié)局部免疫學(xué)反應(yīng)。神經(jīng)前體細(xì)胞可通過(guò)神經(jīng)干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞獲得。神經(jīng)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞，在相關(guān)細(xì)胞因子刺激下，可在體外增殖并形成特殊的球狀結(jié)構(gòu)，此球狀結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為神經(jīng)球。神經(jīng)球具有特殊的微環(huán)境，可保持球內(nèi)干細(xì)胞的存活和增殖，并賦予神經(jīng)干細(xì)胞向外胚層細(xì)胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)分化的潛能。神經(jīng)球的制備是神經(jīng)干細(xì)胞治療的關(guān)鍵步驟，它們的質(zhì)量直接影響到神經(jīng)干細(xì)胞治療的臨床療效。分離神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球，制備單細(xì)胞化方法，是影響高質(zhì)量神經(jīng)球制備的關(guān)鍵技術(shù)，目前常用的方法包括酶消化法或機(jī)械吹打法。酶消化法是利用單獨(dú)胰酶或胰酶與EDTA 合用的方法消化神經(jīng)球。研究顯示酶消化法可導(dǎo)致干細(xì)胞發(fā)生突變，也存在操作時(shí)間長(zhǎng)和細(xì)胞損傷大等缺點(diǎn)。機(jī)械吹打法采用滴管或移液管對(duì)組織進(jìn)行反復(fù)吹打，盡管操作時(shí)間短， 但同樣對(duì)細(xì)胞損傷大。并且所得到的細(xì)胞團(tuán)塊大小不均，導(dǎo)致部分神經(jīng)球體積過(guò)大，影響神經(jīng)干細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)和分化。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速、無(wú)誘發(fā)基因突變、對(duì)細(xì)胞損傷較小以及可制備大小均勻的神經(jīng)球的制備方法，是目前亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，解決神經(jīng)干細(xì)胞傳代過(guò)程導(dǎo)致的神經(jīng)干細(xì)胞易發(fā)生突變、細(xì)胞損傷大以及操作時(shí)間長(zhǎng)和神經(jīng)球大小不均一等問(wèn)題，提供一種具有簡(jiǎn)便、快速、無(wú)誘發(fā)基因突變、對(duì)細(xì)胞損傷較小的神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球傳代分離方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種神經(jīng)干細(xì)胞的傳代分離方法，其步驟如下a.將神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球經(jīng)過(guò)離心后，用毛玻璃擠壓研磨神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球，再經(jīng)不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾；b.將過(guò)濾后的細(xì)胞稀釋到！父^^個(gè)/！^，置于日^ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)1-2天，得到新生的神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球。如上所述的方法，優(yōu)選地，所述毛玻璃片為將玻璃平板通過(guò)金剛砂研磨和氫氟酸溶蝕制備而成的毛玻璃片。如上所述的方法，優(yōu)選地，所述不銹鋼網(wǎng)的目數(shù)為80目-200目。如上所述的方法，優(yōu)選地，所述毛玻璃片的制備方法為
a.取2塊玻璃板，將其中一塊玻璃板平放在容器中，在其上表面均勻涂布金剛砂砂粒；b.于玻璃板的上表面滴加氫氟酸，使沙粒間充滿液體；c.取另一塊玻璃板壓在金剛砂粒層上面，用手按壓上層玻璃板并作環(huán)形研磨；d.研磨數(shù)分鐘后，將兩塊磨好的毛玻璃板用清水沖洗，用玻璃刀分別從兩塊毛玻璃板的未研磨面切下，將毛玻璃板切割成所述的毛玻璃片。如上所述的方法，優(yōu)選地，所述砂粒的粒徑大小為0. 1 1毫米。如上所述的方法，優(yōu)選地，所述毛玻璃片的尺寸為3厘米X 10厘米。本發(fā)明的有益效果在于采用毛玻璃和不銹鋼網(wǎng)聯(lián)合進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球傳代分離培養(yǎng)，替代以往的胰酶或機(jī)械吹打方法，克服了以往方法所帶來(lái)的細(xì)胞易發(fā)生突變以及細(xì)胞損傷大、操作時(shí)間長(zhǎng)等不足。通過(guò)本方法的傳代分離，獲得的子代神經(jīng)球團(tuán)塊大小均勻，并且研磨后平均可獲得2-8個(gè)子代神經(jīng)球。對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和前體細(xì)胞損傷小，神經(jīng)干細(xì)胞在體外保持旺盛生長(zhǎng)傳代時(shí)間長(zhǎng)，沒(méi)有發(fā)生基因突變或貼壁分化現(xiàn)象發(fā)生。


圖1為玻片研磨法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞的照片，放大4倍。圖加為玻片研磨法制備的神經(jīng)球的照片，放大4倍，圖2b為移液管吹打法制備的神經(jīng)球的照片，放大4倍。圖3為玻片研磨法制備的神經(jīng)球內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白nestin免疫熒光檢測(cè)的照片，放大200倍。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖，通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明中所述的含有神經(jīng)球的細(xì)胞培養(yǎng)液，可采用現(xiàn)有技術(shù)中常用的方法，例如酶消化法或機(jī)械吹打法，由合法取得的流產(chǎn)胎兒或其他胚胎的腦組織中制備并培養(yǎng)得到。(1)毛玻璃片的制備取2塊各長(zhǎng)15厘米，寬15厘米、厚為0. 5厘米的玻璃板，置于大號(hào)瓷盤(pán)內(nèi)，將1 塊玻璃板擺平在盤(pán)中央，在上面均勻涂布顏色為黑紅色的金剛砂砂粒，砂粒的粒徑大小為 10 20目，或0. 1 1毫米，再滴加氫氟酸，使沙粒間充滿液體。取另外一塊玻璃板壓在金剛砂粒層上面，用手按壓上層玻璃板并作環(huán)形研磨。數(shù)分鐘后，將兩塊磨好的毛玻璃用清水沖洗，用玻璃刀從玻璃的未研磨面切下，將毛玻璃切成3厘米X 10厘米大小的玻璃條，選擇研磨均勻的玻璃條用于實(shí)驗(yàn)。(2)神經(jīng)球研磨采用本發(fā)明的毛玻璃片研磨法研磨神經(jīng)球時(shí)，將含有神經(jīng)球的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)離心后，取其下部液體滴在普通玻片一端，用毛玻璃片與普通玻片輕輕研磨1次，將細(xì)胞經(jīng) 80-200目的無(wú)菌金屬網(wǎng)過(guò)濾，用冷DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到IOmL離心管中。結(jié)果如圖1所示，圖1為采用本發(fā)明的毛玻璃片研磨法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞的照片， 是經(jīng)4倍放大后，采用DMOS相機(jī)拍攝的照片。從圖中可見(jiàn)，采用玻片研磨法制備的神經(jīng)組織呈均勻分散的小細(xì)胞團(tuán)，有利于小神經(jīng)球的形成。(3)離心將上述細(xì)胞經(jīng)200g離心，并用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌一次。(4)培養(yǎng)在IOmL的DMEM/F12培養(yǎng)基中補(bǔ)加20ng/mL EGF和bFGF、B27，將細(xì)胞用該培養(yǎng)基懸浮并稀釋到1 X IO7個(gè)/mL，后將細(xì)胞置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天鏡下觀察和計(jì)數(shù)。為鑒定本發(fā)明的毛玻璃片研磨法制備神經(jīng)球的效果，以現(xiàn)有技術(shù)中的移液管吹打法作為對(duì)照。采用移液管吹打法處理神經(jīng)球時(shí)，采用電動(dòng)移液器和IOmL移液管，快速吹打 10次。將得到的細(xì)胞200g離心并用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌一次，在IOmL的DMEM/F12培養(yǎng)基中補(bǔ)加20ng/mL EGF和bFGF、B27，將細(xì)胞用該培養(yǎng)基懸浮。后將細(xì)胞置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天鏡下觀察和計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖2所示，圖2中，圖加為采用毛玻璃片研磨法制備的神經(jīng)球，圖2b為移液管吹打法制備的神經(jīng)球，均是在4倍放大下的照片。從圖中可見(jiàn)，與吹打法相比，研磨法獲得的神經(jīng)球數(shù)量多、體積小、并且時(shí)間短。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了本發(fā)明的玻片研磨法操作簡(jiǎn)單、對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的損傷較小，以及獲得的原代神經(jīng)球質(zhì)量較好。(5)神經(jīng)元干細(xì)胞的表面標(biāo)志檢測(cè)將上述通過(guò)毛玻璃片研磨法獲得的神經(jīng)球連續(xù)傳代培養(yǎng)50天，即連續(xù)傳代培養(yǎng)7 代。將多聚賴氨酸涂布在載玻片上，晾干后，在載玻片上滴加神經(jīng)球，制備貼壁神經(jīng)球。 貼壁神經(jīng)球經(jīng)過(guò)4 %多聚甲醛固定、過(guò)氧化物酶透化和山羊血清封閉，室溫下封閉30分鐘； 分別與兔抗人nestinfcestin為神經(jīng)元干細(xì)胞標(biāo)志蛋白)第一抗體，37°C下反應(yīng)1小時(shí)；用 IX磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5分鐘；再加入熒光標(biāo)記山羊抗兔第二抗體，室溫避光反應(yīng)30分鐘，用IX磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5分鐘；在共聚焦顯微鏡下檢測(cè)其結(jié)果。結(jié)果如圖3所示，圖3為玻片研磨法制備的神經(jīng)球內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)分析的放大200倍的照片。圖3中(請(qǐng)參見(jiàn)申請(qǐng)日提交的供審查員參考用的彩圖)，藍(lán)色為神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞核，綠色為神經(jīng)元干細(xì)胞標(biāo)志蛋白nestin。從圖中可見(jiàn)，神經(jīng)球內(nèi)高表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白nestin，表明經(jīng)玻片研磨法制備的神經(jīng)球，其球內(nèi)有大量存活的神經(jīng)干細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)干細(xì)胞的傳代分離方法，其特征在于，步驟如下a.將神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球經(jīng)過(guò)離心后，用毛玻璃擠壓研磨神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球，再經(jīng)不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾；b.將過(guò)濾后的細(xì)胞稀釋到1X IO7個(gè)/mL，置于5 % CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)1_2 天，得到新生的神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述毛玻璃片為將玻璃平板通過(guò)金剛砂研磨和氫氟酸溶蝕制備而成的毛玻璃片。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述不銹鋼網(wǎng)的目數(shù)為80目-200目。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述毛玻璃片的制備方法為a.取2塊玻璃板，將其中一塊玻璃板平放在容器中，在其上表面均勻涂布金剛砂砂粒；b.于玻璃板的上表面滴加氫氟酸，使沙粒間充滿液體；c.取另一塊玻璃板壓在金剛砂粒層上面，用手按壓上層玻璃板并作環(huán)形研磨；d.研磨數(shù)分鐘后，將兩塊磨好的毛玻璃板用清水沖洗，用玻璃刀分別從兩塊毛玻璃板的未研磨面切下，將毛玻璃板切割成所述的毛玻璃片。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述砂粒的粒徑大小為0.1 1毫米。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述毛玻璃片的尺寸為3厘米X10厘米。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種神經(jīng)干細(xì)胞的傳代分離方法，其步驟為a.在含有DMEM/F 12培養(yǎng)基無(wú)菌平皿中生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球，經(jīng)過(guò)1000rpm離心后，用毛玻璃擠壓研磨后，將細(xì)胞用無(wú)菌不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾；b.將細(xì)胞稀釋到1×107個(gè)/mL，置于5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)1-2天，得到新生的神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球。通過(guò)本發(fā)明的傳代分離方法，獲得的小神經(jīng)球大小均勻。對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞損傷小，體外傳代時(shí)間長(zhǎng)，并且無(wú)貼壁分化的神經(jīng)細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/0797GK102399747SQ20111037865
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者尹曉光 申請(qǐng)人:吉林省拓華生物科技有限公司