專利名稱：女性生殖器癌癥相關(guān)snp位點(diǎn)多重檢測方法的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及正常體檢人群的全血和口腔拭子等標(biāo)本的6個女性生殖器癌癥相關(guān) SNP 位點(diǎn)(包括 rs4784227、rsl2196489、rs3803662、rs889312、rs750749 和 rs749292)的同時檢測和分型。具體在 http: IIwm. ncbi. nlm. nih. gov/snp/ 下載 SNP 位點(diǎn) rs4784227 (C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和rs749292 (G > A)側(cè)翼的核苷酸序列，設(shè)計(jì)各位點(diǎn)適用于T-ARMS-PCR技術(shù)的內(nèi)外特異性引物，對6個SNP位點(diǎn)進(jìn)行單管多重PCR分型。本專利通過多重嵌合引物PCR技術(shù)和毛細(xì)管電泳兩項(xiàng)改進(jìn)，克服了常規(guī)單管四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR不能多重檢測的缺點(diǎn)，其高通量、簡易快速的特點(diǎn)為女性生殖器癌癥相關(guān)SNP位點(diǎn)的快速分型提供了新的手段，對研究我國女性生殖器癌癥相關(guān)SNP位點(diǎn)的基因型分布和女性生殖器癌癥的預(yù)防有重要意義。
背景技術(shù)：
在人類基因組序列中，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymerphisms,SNPs)是最常見的變異。已有研究表明，SNP位點(diǎn)rs4784227(C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662(T > C)和rs889312(C > A)與亞裔女性的乳腺癌易感性相關(guān)，rs750749 (T >C)是子宮頸癌易感性相關(guān)位點(diǎn)，rs749292(G > A)是卵巢癌易感性相關(guān)位點(diǎn)。對這6個位點(diǎn)快速準(zhǔn)確的分型有助于女性生殖器癌癥的預(yù)防。在近年來發(fā)展出的多種SNP檢測技術(shù)中，四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, T-ARMS-PCR),或兩對交叉引物 PCR(PCR with confronting two-pair primers, PCR-CTPP)因其操作簡便、分型快速、費(fèi)用低廉已被廣泛應(yīng)用。其原理為針對已知的突變，在突變點(diǎn)的兩側(cè)分別設(shè)計(jì)一對外引物和一對特異性內(nèi)引物，特異性內(nèi)引物用來檢測突變是否發(fā)生，外引物在PCR反應(yīng)中和特異性內(nèi)引物分別配對有選擇性地?cái)U(kuò)增突變型與野生型個體基因；通過使外引物距突變點(diǎn)長度不同可以得到不同長度的特異性擴(kuò)增片段，根據(jù)電泳圖譜中片段大小和有無，可以判斷突變是否發(fā)生以及個體的基因型。目前，T-ARMS-PCR仍以單重檢測為主，少數(shù)實(shí)驗(yàn)室也能實(shí)現(xiàn)多重檢測(Multiplex-T-ARMS-PCR, M-T-ARMS-PCR)，但其可同時檢測的位點(diǎn)數(shù)量難以進(jìn)一步提高，主要受到兩個限制多重?cái)U(kuò)增的偏向性及瓊脂糖電泳的分辨率。本實(shí)驗(yàn)通過引入多重嵌合引物PCR技術(shù)對T-ARMS-PCR進(jìn)行了改進(jìn)，在擴(kuò)增初期使用特異性嵌合引物(即在特異性引物5’端引入通用序列)擴(kuò)增，而擴(kuò)增末期由通用引物引發(fā)擴(kuò)增，從而在保證反應(yīng)特異性的同時，降低了多重PCR的偏向性。此外應(yīng)用分辨率較高的毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis, CE)替代瓊脂糖電泳，建立了單管多重PCR同時檢測女性生殖器癌癥相關(guān)位點(diǎn) rs4784227 (OT), rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和rs749292 (G > A)的六位點(diǎn)檢測方法
發(fā)明內(nèi)容
I.在 http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/snp/ 下載 SNP 位點(diǎn) rs4784227 (C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G
>A)側(cè)翼的核苷酸序列，設(shè)計(jì)適用于T-ARMS-PCR技術(shù)的引物。在內(nèi)引物的3 ’端倒數(shù)第二位(-2位)引入一個人為錯配堿基來提高延伸反應(yīng)的特異性，并在全部正向引物和反向引物的5’端分別加入一段非同源性序列作為通用引物(Tag-F和Tag-R)。使用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)的引物序列如表I :表I表I多重T-ARMS-PCR分型所使用的引物信息

觸齡弓丨物名稱_序歹U (5，-3，)_IT￡
rs47S4 .77 Forward mner Pnmer (T 型〉A(chǔ)rTGTGACACTATArTAATAAAAAGTCCCAATTTGTAGTGTTTGaT50322
rs4784227-476T-2A-tagF -
tagR^) GTACGACTCACTATAGGGAATGGGAGTATTTACATCACAATAATgG30297
Forward outer primer:AGGTGACACTATAGAAIACTGACCCCTTTAGACACGG5
rs4784227-268-tagF-
Reverse outer primer:GTACGACTCACTATAGGGAGGGCTTCAACACAGTCAGTTC9
rs4784227-760-tagR-
rs 17.19648 Forward inner pnmer (G 型〕OTACGACTCACTATAGGGACACGCCTATTTTACTTGACACAaG50 269
rsl219648-278G-2A-tagR-4---
Reverse mneT pnmer (A^);GTACGACTCACTATAOGGACCArGCTCCATCCTTOAAGAaT40197
rs 1219648-321 T-2A-tagR-
F^^d uierPnm7,erGTACGACTCACTATAGGGACACAATGGCGCAGAATTA7
rsl219648-l62-tagR-*--
Revere outer primer:GTACG^CTCACTATAGGGACTGGACAGGTCArTGTGGTG7.5
rs!219648-509-tagR-
r^S0^662 Forward inner Primertc 型):AGGTGACACTATAGAAIACTCTCCTTAATGCCTCTATAGCTGTaC30259
rs3803662-275C-2A-tagF-
Reverse inner primer (T 型)AGGTGACACTATAGAATACCACAGTTTTAITCl I CGl I AacA75357
rs3803662-324A-2C-tagF-
Forw^d. ut_er prImerAGGTGACACTATAGAAI'AGTCCTTGGCTGTTCTGTGA10
rs3803662o-tagF--
Reverrse 0utfrr pnm^rAGGTGACACTATArrAATATCCCCAAGGAGACAAAGGTA7
rs3 803662-496-tagF-
rs889312 Forward inner Pnmer 巧型)AGGTGACACTATAGAATATGCCCCTGCTGGAGAAAGtA60213
rs889312-382A-2T_tagl
Reverse innerPnmer CC 型〕:GTACGACTCACTATAGGGATGATTTGTAGTCTCTTAATTTGCACAaG85340
rs889312^28G-2A-tagR-
Forward outer primer:AGGTGACACTATAGAATACCIGGGTCCTTAGCATTCC13
rs8 89312-126-tagF-
Reverse outer pnmerGTACGACTCACTATAGGGAATCTGTGCCCTGAAGTGAGTAG9
rs889312-557-tagR-
r=；7S0749 Forward inner primer CC 型)aOGTGACACTATAGAATAGAGGCTGAGAACTAATAATAATTTTcC50371
rs750749-275C-2C-tagF-
Reverse inner primer (T 型)CjTACGACTCACTATAGGGACTTCAGATGAAAACTGCTGTGTAAria、75226
rs750749-327A-2A-tagR-
pnTer:AGGTGACACTATA(]AATACCCACAGAGTTGGAATGCTT12
rs750749-139-tagF-
Reverse outer pnmer:GTACGACTCACTATAGGGATGCATAAAGTGGGTCCTGC7.5
rs750749-608-tagR--
rs749 .97 Forward mner pnmer (G 型)AGGTGACACTATAGAATACCTTCTTCAAACCTCGGAGTaG3 5282
rs749292-429G-2A-tagF-
Reverse inner primer (AM)OTACGACTCACTATAGGGAGATAGAAATTGTGCAGGAATCCaT25330
rs749292-472T-2A-tagR-
Fo^Hr pn^ier:AGGTGACACTATAGAATATCCACGGACAGAGCAGG4.5
rs749292-180-tagF-
^749292°673 亡__GTACGACTCACTATAGGGAGATTAGGGGACCTCCGTGA_7_注下劃線處為通用引物標(biāo)簽序列(Tag);陰影部分的是為保證擴(kuò)增特異性而特別設(shè)計(jì)的喊基，3’末端是多態(tài)位點(diǎn)，~2位是人為錯配。2.建立了如下的檢測過程，詳見如下(I)合成引物特異性嵌合引物及上下游通用引物標(biāo)簽(Tag-F和Tag-R)由北京六合華大基因科技股份公司合成，PAGE純化。(2)外周靜脈血標(biāo)本，采用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化)提?。豢谇皇米覦NA，采用口腔拭子基因組DNA提取試劑盒(天根生化)提取。(3)建立同時檢測6個SNP位點(diǎn)的多重T-ARMS-PCR反應(yīng)體系，并對其特異性進(jìn)行驗(yàn)證。
具體實(shí)施例方式實(shí)施方案I :多重PCR擴(kuò)增使用Multiplex PCR Kit(QIAGEN)試劑盒。PCR反應(yīng)體系為20 yl，其中全血DNA模板0. 5 ill，口腔拭子DNA模板2 ill，通用引物500nM，其余引物濃度見表I。PCR反應(yīng)分6步擴(kuò)增目的片段第I步95°C預(yù)變性IOmin ;第2步95°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸45s，循環(huán)3次；第3步95°C變性30s，58°C復(fù)性30s，72°C延伸45s，循環(huán)10次；第4步95°C變性 30s，68°C 復(fù)性 30s，72°C延伸 45s，循環(huán) 20 次；第 5 步95°C變性 30s, 55°CM 性30s，72°C延伸45s，循環(huán)12次；第6步72°C延伸5min，4°C保存。每份標(biāo)本做2個重復(fù)。實(shí)施方案2 :毛細(xì)管電泳分離米用QIAxcel system(Qiagen)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，QIAxcel DNA high-resolutioncartridge (Qiagen)及 0H700 方法作為分離條件，與 QX Alignment Marker 15bp/500bp、QXDNA Size Marker 25_450bp 配合使用，經(jīng) Biocalculator software (Qiagen)軟件分析，以對應(yīng)長度的產(chǎn)物是否存在進(jìn)行SNP分型。實(shí)施方案3 :測序驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系25 u I，其中全血DNA模板0. 5 iU，口腔拭子DNA模板2 iU，PremixEx Taq Version 2. 0 (TakKaRa) 12. 5 U 1，各位點(diǎn)取不帶 Tag 的外引物各 500nM。PCR 反應(yīng)為95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s，58°C復(fù)性 30s，72°C延伸 45s，循環(huán) 45 次；72°C延伸 5min，4°C保存。將產(chǎn)物進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與M-T-ARMS-PCR電泳結(jié)果進(jìn)行對照。
權(quán)利要求
1.一種用于同時檢測女性生殖器官癌癥相關(guān)SNP位點(diǎn)rs4784227 (C>T),rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G>A)的多重PCR技術(shù)，其中包括用于檢測的rs4784227(C > T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G > A)的型特異性內(nèi)、外引物。
2.權(quán)力要求I所述的多重PCR技術(shù)的引物和通用引物包括表I所列的基因序列及其每種序列的互補(bǔ)序列或變體。
3.權(quán)力要求I所述的多重PCR檢測技術(shù)用于檢測包括女性生殖器官癌癥相關(guān)SNP位點(diǎn)rs4784227(C > T)、rsl2196489(G > A)、rs3803662(T > C)、rs889312(C > A)、rs750749(T>C)和 rs749292 (G > A)。
4.權(quán)力要求3所述的本發(fā)明的應(yīng)用范圍包括正常體檢人群的全血和口腔拭子等標(biāo)本的6個女性生殖器癌癥相關(guān)SNP位點(diǎn)(包括rs4784227、rsl2196489、rs3803662、rs889312、rs750749和rs749292)的同時檢測和分型。
5.權(quán)力要求I所述的同時檢測女性生殖器官癌癥相關(guān)SNP位點(diǎn)rs4784227(C> T)、rsl2196489 (G > A)、rs3803662 (T > C)、rs889312 (C > A)、rs750749 (T > C)和 rs749292 (G>A)的多重PCR技術(shù)的反應(yīng)程序和檢測程序。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及正常體檢人群的全血和口腔拭子等標(biāo)本的6個女性生殖器癌癥相關(guān)SNP位點(diǎn)(包括rs4784227、rs12196489、rs3803662、rs889312、rs750749和rs749292)的同時檢測和分型。具體在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/下載SNP位點(diǎn)rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)側(cè)翼的核苷酸序列，設(shè)計(jì)各位點(diǎn)適用于T-ARMS-PCR技術(shù)的內(nèi)外特異性引物，對6個SNP位點(diǎn)進(jìn)行單管多重PCR分型。本發(fā)明通過多重嵌合引物PCR技術(shù)和毛細(xì)管電泳兩項(xiàng)改進(jìn)，克服了常規(guī)單管四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR不能多重檢測的缺點(diǎn)，其高通量、簡易快速的特點(diǎn)為女性生殖器癌癥相關(guān)SNP位點(diǎn)的快速分型提供了新的手段，對研究我國女性生殖器癌癥相關(guān)SNP位點(diǎn)的基因型分布和女性生殖器癌癥的預(yù)防有重要意義。
文檔編號C12N15/11GK102965427SQ20111025778
公開日2013年3月13日 申請日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者馬學(xué)軍, 劉穎, 張晨 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所