專利名稱：基因序列分析的方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸分析和基因的堿基序列分析的方法，具體涉及基因序列分析、基因多型分析、基因變異分析和基因表達(dá)分析的方法。
背景技術(shù)：
在DNA的堿基序列的確定中，使用凝膠電泳和熒光檢測的方法被廣泛應(yīng)用。在該方法中，首先制備許多想要進(jìn)行序列分析的DNA片段的拷貝。以DNA的5'末端作為起點(diǎn)制備各種長度的熒光標(biāo)記片段。此外，預(yù)先加入根據(jù)這些DNA片段的3'末端的堿基種類而波長不同的熒光標(biāo)記。通過凝膠電泳識別1個堿基差異的長度差，檢測每個片段組產(chǎn)生的發(fā)光。由發(fā)光波長顏色而獲知測定中的DNA片段組的DNA末端堿基種類。由于DNA從短的片段組開始依次通過熒光檢測部，所以可以通過測量熒光顏色而自短的DNA開始依次獲知末端堿基種類。由此進(jìn)行序列確定。這樣的熒光式DNA序列測定儀正在廣泛地普及，另外，在人類基因組的分析中也非?；钴S。在該方法中，公開了使用許多根內(nèi)徑50 μ m左右的玻璃細(xì)管，進(jìn)一步利用末端檢測等方法，增加每臺的分析處理數(shù)的技術(shù)。另一方面，利用以焦磷酸測序法為代表的分步的化學(xué)反應(yīng)的序列確定法(例如專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)幻，由于處理的簡便性而受到關(guān)注。

圖13(1)是表示其工序的例子。 概要如下。使引物雜交至作為靶物質(zhì)的DNA鏈，順次將四種互補(bǔ)鏈合成核酸底物(dATP、 dCTP、dTTP、dGTP) —種一種地加入到反應(yīng)液中，進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)。圖13(1)中，連接于引物的3'末端的核酸底物是與靶物質(zhì)上的堿基C131互補(bǔ)的dGTP。由此，在其他的核酸底物(dATP、dCTP、dTTP)中不發(fā)生延長。加入到反應(yīng)溶液中、沒用于延長的核酸底物，經(jīng)以腺苷三磷酸雙磷酸酶為代表的核酸底物分解酶而被分解。如圖13(1)的dGTP注入時那樣，如果發(fā)生互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)則DNA互補(bǔ)鏈延長，生成作為副產(chǎn)物的焦磷酸(PPi)。此時的反應(yīng)式示于圖130)。焦磷酸通過共存的酶的作用而轉(zhuǎn)化為ATP，在熒光素和熒光素酶的共存下反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光(生物發(fā)光)。如果圖示每次各底物注入的發(fā)光，以圖14作為例子。通常，使用該發(fā)光曲線，通過分析每次加入的核酸底物時產(chǎn)生的發(fā)光，獲知加入的互補(bǔ)鏈合成底物是否被并入DNA鏈， 并且獲知互補(bǔ)鏈的序列信息并因此獲知成為靶物質(zhì)的DNA鏈的序列信息。已知作為1種互補(bǔ)鏈合成核酸底物，dATP與作為生物發(fā)光底物的ATP具有類似的結(jié)構(gòu)，因此作為熒光素酶的底物而起作用。這成為背景發(fā)光信號，使得檢測靈敏度降低。 作為對策，Nyren等人公開了利用dATP的類似物、具體為dATP α S來代替dATP (專利文獻(xiàn) 1)。上述Nyren等人的方法減少了焦磷酸測序法中的背景發(fā)光，為提高分析時的發(fā)光檢測性能做出了貢獻(xiàn)。但是，使用含有dATP α S的核苷酸α -硫代三磷酸類似物的方法也有缺點(diǎn)。缺點(diǎn)之一是磷酸基部分的Rp異構(gòu)體引起的酶活性抑制。Nyren等人對此進(jìn)行了詳細(xì)地公開(專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)2)，Rp異構(gòu)體可能抑制聚合酶活性，并且Rp異構(gòu)體不能被腺苷三磷酸雙磷酸酶分解。作為對策，Nyren等人公開了首先僅對Sp異構(gòu)體進(jìn)行精制而利用的技術(shù)。另外，剩余的Sp異構(gòu)體被腺苷三磷酸雙磷酸酶分解為核苷酸α-硫代一磷酸類似物，此后，當(dāng)其中的一部分通過酶被再合成為核苷酸α -硫代三磷酸類似物時， Sp/Rp異構(gòu)體的合成確定是各50%，因此針對Rp異構(gòu)體合成累積的問題，通過堿性磷酸酶分解Rp異構(gòu)體并除去。Nyren等人公開了可以通過該方法避免由于Rp異構(gòu)體引起的聚合酶延長抑制。進(jìn)一步地，Eriksson等人公開了作為用于代替dATP的核酸底物，使用7-脫氮-2-脫氧腺苷三磷酸(C7dATP)的方法(非專利文獻(xiàn)幻。C7dATP是將腺嘌呤基的7位氮替換為碳后的物質(zhì)。因此，三磷酸結(jié)構(gòu)與dATP相同，容易被腺苷三磷酸雙磷酸酶分解。艮口， 與作為現(xiàn)有技術(shù)的核苷酸α -硫代三磷酸類似物不同，不存在被考慮為酶抑制的主要因素的光學(xué)異構(gòu)體。由此，Eriksson等人公開了可以沒有酶抑制的核酸序列分析。另一方面，雖然在由焦磷酸生成ATP的反應(yīng)中使用APS，但這也成為熒光素酶反應(yīng)的底物，產(chǎn)生背景發(fā)光。因此，為了高靈敏度地實(shí)施堿基序列確定，期望不使用APS的方法。 作為使之成為可能的方法，公開了使用酶丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)的逆反應(yīng)，利用AMP和 PPi合成ATP的反應(yīng)的堿基序列確定法(專利文獻(xiàn)4)。由于沒有使用在現(xiàn)有技術(shù)中被指出作為背景發(fā)光成分的APS，該方法可以顯著地減少背景發(fā)光，實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 國際公開小冊子第98/13523號專利文獻(xiàn)2 國際公開小冊子第98/28440號專利文獻(xiàn)3 日本特表2004-5080M號專利文獻(xiàn)4 日本特開2007-97471號非專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 =Anal. Chem. 72 15，3423-3430，2000專利文獻(xiàn)2 :Anal. Biochem. 301，82-90，2002專利文獻(xiàn) 3 :Nucleosides，Nucleotides & Nucleic Acids, 23 10，1583—1594， 2004。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的技術(shù)問題如上所述，在現(xiàn)有的焦磷酸測序法中，實(shí)質(zhì)上必須使用含有dATP α S的核苷酸 α -硫代三磷酸類似物。但是，使用含有dATPa S的核苷酸α _硫代三磷酸類似物的缺點(diǎn)也逐漸變得明了。如上所述，其中之一是核苷酸α -硫代三磷酸類似物的Rp異構(gòu)體抑制聚合酶活性，Nyren等人提出了對策。其中，僅精制Sp異構(gòu)體而利用dATPa S(以下，Sp-dATP a S)。另一方面，來自于本發(fā)明人等的研究表明在使用Sp-dATP a S的核酸延長反應(yīng)中，核酸底物向DNA的3'末端并入的效率差，本來應(yīng)該并入的核酸底物沒有并入，在互補(bǔ)鏈合成中，產(chǎn)生了一部分DNA互補(bǔ)鏈分子沒有延長(延長未完)這樣的問題。這一部分DNA 分子的未延長的發(fā)生，特別是在分析對象中含有T的連續(xù)堿基即Poly (T)區(qū)域的情況下，導(dǎo)致讀取堿基長度的縮短等分析準(zhǔn)確度的降低。由此可知，必須降低未延長率。
此外，關(guān)于使用C7dATP的技術(shù)，本發(fā)明人等的研究確認(rèn)由于C7dATP和ATP的相似性高，C7dATP作為熒光素酶的底物而起作用。因此可以確定，將C7dATP應(yīng)用于焦磷酸測序法中時，使堿基延長反應(yīng)的檢測靈敏度大大降低。因此，本發(fā)明的技術(shù)問題是提供一種核酸底物，其具有與dATP相當(dāng)?shù)暮怂岬孜锾匦?，對于熒光素酶的底物性低，對于互補(bǔ)鏈合成等酶反應(yīng)沒有不良影響，特別適用于焦磷酸測序法。用于解決技術(shù)問題的手段本發(fā)明人等不使用dATP的類似物(含有dATP α S的核苷酸α -硫代三磷酸類似物)，而新合成將dATP的腺嘌呤替換為其它的嘌呤異構(gòu)體后的物質(zhì)來使用。即，在保留有利于形成氫鍵的6位氨基結(jié)合的結(jié)構(gòu)的條件下，新合成替換為其它的嘌呤異構(gòu)體的物質(zhì)， 選定不容易成為熒光素酶的底物，可以用于序列分析的物質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為對應(yīng)于模板核酸試樣的堿基T (胸腺嘧啶)的互補(bǔ)核酸底物，通過使用嘌呤基的7位被取代基修飾后的 7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸，可以解決上述技術(shù)問題。即，本發(fā)明包含以下技術(shù)方案。(1) 一種核酸分析方法，其包含如下工序?qū)⒑怂嵩嚇幼鳛槟０?，加入對?yīng)于堿基 AGTC的互補(bǔ)核酸底物進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成的工序；由在該互補(bǔ)鏈合成中生成的焦磷酸借助酶而生成ATP的工序；以及檢測由熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光來判斷互補(bǔ)鏈合成的有無的工序；作為對應(yīng)于堿基T的互補(bǔ)核酸底物，使用嘌呤基的7位被取代基修飾后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸。(2)根據(jù)(1)記載的核酸分析方法，其中，作為對應(yīng)于堿基T的互補(bǔ)核酸底物，使用經(jīng)由亞乙烯基(ethenyl) (C-C雙鍵)、亞乙基(ethylene) (C-C單鍵)或亞乙炔基(ethynyl) (C-C三鍵)以取代基修飾嘌呤基的7位后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸。(3)根據(jù)( 記載的核酸分析方法，其中，作為對應(yīng)于堿基T的互補(bǔ)核酸底物，使用經(jīng)由亞乙烯基(C-C雙鍵)以取代基修飾嘌呤基的7位后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸。(4)根據(jù)(1) (3)中任意一項(xiàng)記載的核酸分析方法，其中，嘌呤基的7位的取代基是含有芳香族基團(tuán)的取代基。(5)根據(jù)(4)記載的核酸分析方法，其中，芳香族基團(tuán)是堿性芳香族基團(tuán)。(6) 一種對應(yīng)于堿基T的互補(bǔ)核酸底物試劑，其含有嘌呤基的7位被取代基修飾后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸。(7)根據(jù)(6)記載的試劑，其中，含有經(jīng)由亞乙烯基(C-C雙鍵)、亞乙基(C-C單鍵)或亞乙炔基(C-C三鍵)以取代基修飾嘌呤基的7位后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸
三磷酸。(8)根據(jù)(7)記載的試劑，其中，含有經(jīng)由亞乙烯基(C-C雙鍵)以取代基修飾嘌呤基的7位后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸。(9)根據(jù)(6) ⑶中任意一項(xiàng)記載的試劑，其中，嘌呤基的7位的取代基是含有芳香族基團(tuán)的取代基。(10)根據(jù)(9)記載的試劑，其中，芳香族基團(tuán)是堿性芳香族基團(tuán)。(11)選自以下式子表示的化合物的化合物
權(quán)利要求
1.一種核酸分析方法，其包含如下工序?qū)⒑怂嵩嚇幼鳛槟０?，加入對?yīng)于堿基AGTC的互補(bǔ)核酸底物進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成的工序，由在該互補(bǔ)鏈合成中生成的焦磷酸通過酶而生成ATP的工序，以及檢測由熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光來判斷互補(bǔ)鏈合成的有無的工序；作為對應(yīng)于堿基T的互補(bǔ)核酸底物，使用嘌呤基的7位被取代基修飾后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸分析方法，其中，作為對應(yīng)于堿基T的互補(bǔ)核酸底物，使用經(jīng)由亞乙烯基(C-C雙鍵)、亞乙基(C-C單鍵)或亞乙炔基(C-C三鍵)以取代基修飾嘌呤基的7位后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2記載的核酸分析方法，其中，作為對應(yīng)于堿基T的互補(bǔ)核酸底物，使用經(jīng)由亞乙烯基(C-C雙鍵)以取代基修飾嘌呤基的7位后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任意一項(xiàng)記載的核酸分析方法，其中，嘌呤基的7位的取代基是含有芳香族基團(tuán)的取代基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4記載的核酸分析方法，其中，芳香族基團(tuán)是堿性芳香族基團(tuán)。
6.一種對應(yīng)于堿基T的互補(bǔ)核酸底物試劑，其含有嘌呤基的7位被取代基修飾后的 7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6記載的試劑，其中，含有經(jīng)由亞乙烯基(C-C雙鍵)、亞乙基(C-C單鍵)或亞乙炔基(C-C三鍵)以取代基修飾嘌呤基的7位后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7記載的試劑，其中，含有經(jīng)由亞乙烯基(C-C雙鍵)以取代基修飾嘌呤基的7位后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 8中任意一項(xiàng)記載的試劑，其中，嘌呤基的7位的取代基是含有芳香族基團(tuán)的取代基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9記載的試劑，其中，芳香族基團(tuán)是堿性芳香族基團(tuán)。
11.選自以下式子所示化合物的化合物
12.以下式子表示的化合物
13.用于焦磷酸測序法中的權(quán)利要求6 10中任意一項(xiàng)記載的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種核酸底物，其具有與dATP相當(dāng)?shù)暮怂岬孜锾匦?，對于熒光素酶的底物性低，對于互補(bǔ)鏈合成等酶反應(yīng)沒有不良影響，特別適用于焦磷酸測序法。作為與堿基T互補(bǔ)核酸底物，使用嘌呤基的7位被取代基修飾后的7-取代基-脫氧核糖核苷酸三磷酸代替核苷酸α-硫代三磷酸的類似物。
文檔編號C12Q1/68GK102471364SQ201080035929
公開日2012年5月23日 申請日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日
發(fā)明者桑原正靖, 梶山智晴, 神原秀記 申請人:國立大學(xué)法人群馬大學(xué), 株式會社日立制作所