專利名稱：活化的nk細胞的經(jīng)保存的組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性地涉及顯示出持久活化狀態(tài)的經(jīng)保存的天然殺傷細胞群、包含此類經(jīng)活化的NK細胞的藥物組合物，及它們的使用方法。
背景技術(shù)：
癌癥的過繼免疫療法考慮的是通過用特定的腫瘤細胞進行疫苗接種和/或施用更為一般性的免疫刺激物而直接刺激宿主對腫瘤的免疫應(yīng)答。然而，數(shù)種因素可妨礙充分的抗腫瘤免疫應(yīng)答，這包括缺乏合適的腫瘤相關(guān)抗原，有缺陷的抗原加工，由腫瘤產(chǎn)生免疫抑制性因子等。過繼免疫療法通過直接向攜帶腫瘤的宿主施用有免疫活性的細胞或抗體而試圖克服腫瘤介導(dǎo)的宿主免疫抑制。在過繼性細胞療法中，從攜帶腫瘤的宿主中分離免疫效應(yīng)子細胞并且在再輸注之前離體使其活化和/或擴增。例如，用重組的白介素_2(IL-2)離體活化了自體NK細胞以提高CD56+天然殺傷(NK)細胞的細胞毒性(Lanier et al. (1985) Journal of Immunology 134,794-801)并且產(chǎn)生經(jīng)淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞，其能夠在體外殺傷新鮮的自體和同種異基因性人腫瘤細胞(Rayner，et al. (1985)Cancer 55， 1327-1333)。施用LAK細胞(通常與全身性IL-2輸注相組合)已經(jīng)作為用于人類癌癥的過繼免疫療法經(jīng)過了反復(fù)地研究。然而，遺憾的是這些LAK細胞療法在臨床中僅遇到了有限的成功。首先必須從患者中獲得自體細胞并且使其成功地離體擴增至足以用于治療的細胞計數(shù)。此外，必須使 LAK細胞持續(xù)地暴露于IL-2，以維持其活化的狀態(tài)并且因此，有效的臨床方案通常要求全身性施用高劑量的IL-2與細胞療法相聯(lián)合。雖然在一些患者中獲得了一些抗腫瘤效果， 由共施用IL-2引起的毒性是顯著的問題(Vieweg et al. (1995)Cancer Investigation 13 :193-201),這包括發(fā)燒、發(fā)冷、全身乏力、關(guān)節(jié)痛、肌痛、和來自液潴的增重(Lotze，et al. (1985)J. Immunology 135 :2865-2875)。LAK細胞療法的成功實施還被不能在實時個體化方案之外采用活化的LAK細胞所妨礙。特別地，需要特殊的設(shè)備和專門的實驗室來分離、擴增和重輸注每個患者的細胞。此外，LAK細胞的活性在去除IL-2后12小時內(nèi)被顯著損害，因此，一旦被活化，LAK細胞必須在喪失活化狀態(tài)之前被迅速輸注。重要地，LAK細胞的保存使得需要通過以IL-2進行再刺激而制備用于施用的LAK細胞，來重建活化的狀態(tài)(Kawai et al. (1988)Transfusion 28: 531-5 ；Schiltz et al. (1998) J. Immunother. 20 :377-86)。因此，施用 LAK細胞用于癌癥的免疫療法具有有限的臨床影響和認可，需要昂貴的、個體化的和勞動密集性的分離及擴增方法，以及實時施用來避免喪失活化。
因此，所需的是具有更可靠且持久的活性的經(jīng)活化的免疫效應(yīng)子細胞群，其可更好地促進細胞療法與供體護理的協(xié)調(diào)。理想地，盡管保存，這些細胞仍可維持其活化狀態(tài)而不持續(xù)暴露于活化劑和/或共施用不希望的和/或臨床毒性試劑，從而使得更為一般性的臨床應(yīng)用可以是可能的。發(fā)明概述本發(fā)明提供經(jīng)保存的、具有顯著的抗腫瘤活性的活化的NK細胞群，盡管有之前的保存，其仍顯示出令人驚訝地持久的活化狀態(tài)，并且甚至在不存在活化劑時(例如，在結(jié)束與活化劑的接觸后和/或不持續(xù)暴露于活化劑或以其再活化)亦如此。重要地且與LAK細胞不同地，本發(fā)明的經(jīng)活化的NK細胞可在保存后直接被施用于患者而無需再活化并且也無需共施用活化劑本身，從而為醫(yī)師提供了可持續(xù)的且即用的細胞治療產(chǎn)品，其還避免了伴隨著共施用活化劑的潛在毒性。此外，可跨越同種異基因性障礙而有效地采用本發(fā)明的細胞群，并且重要地，過繼性轉(zhuǎn)移后，本發(fā)明的細胞群能夠?qū)⒛[瘤能力轉(zhuǎn)移至內(nèi)源性宿主NK細胞，從而在體內(nèi)產(chǎn)生 NK細胞活化級聯(lián)。因此，本申請所提供的經(jīng)活化的NK細胞群可被更一般性和更實際地用于主動和被動免疫療法設(shè)置中，而無需個體化的治療方案和/或?qū)崟r施用方案。因此，一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)活化的NK細胞的藥物組合物。所述組合物可適于直接施用于患者。所述組合物可基本上不含活化劑。經(jīng)活化的NK細胞可以是之前經(jīng)保存的。在使用中，經(jīng)活化的NK細胞可在任意保存后繼而被制備用于施用而不經(jīng)再活化或與活化劑相接觸。在實施方式中，所述組合物包含之前經(jīng)保存的活化的NK細胞、適于直接施用并且不含活化劑。所述組合物可以是(并且通常是)用于施用而不共施用(無論同時、 分別還是順次)活化劑。在其它方面，提供了⑴經(jīng)活化的NK細胞群用于治療性應(yīng)用(例如用于治療癌癥)，和(ii)經(jīng)活化的NK細胞群用于制備藥物的用途，所述藥物例如用于治療癌癥。所述細胞群可以是經(jīng)保存的。所述細胞群可以不含活化劑。所述細胞群可包括藥學上可接受的介質(zhì)或載體。所述細胞群可以被重構(gòu)為藥物組合物，但是由保存狀態(tài)移除后， 其按照希望準備好用于施用(例如準備好用于輸注)。因此，本申請中對于本發(fā)明的藥物組合物的描述同樣適用于本發(fā)明的細胞群，例如可通過用CD15+LAK-抗性腫瘤細胞進行活化而獲得NK細胞。優(yōu)選地，與靜止的NK細胞相比，所述NK細胞過表達⑶69和/或⑶25， 并且盡管不存在活化劑其仍顯示出持久和延長的抗腫瘤活性。因此，在一個實施方式中，之前經(jīng)活化的NK細胞是CD69+和/或CD25+。在其它實施方式中，預(yù)期用于本申請中的經(jīng)活化的NK細胞在活化后也獲得⑶15的表達并喪失⑶16的表達。因此，本發(fā)明的NK細胞更優(yōu)選地也是⑶15+和⑶16 的。這些⑶69+⑶25+⑶16 ⑶15+NK細胞將通常包含至少約 50%的所述細胞群，更優(yōu)選地至少約60、70或80%的所述細胞群，且最優(yōu)選地至少約90、95 或98%的所述細胞群。在一個實施方式中，所公開的藥物組合物包含對于患者為自體的、經(jīng)活化的NK細胞。在另一個實施方式中，藥物組合物包含對于患者是自體的和對于患者是同種異基因性的經(jīng)活化的NK細胞。在另一個實施方式中，藥物組合物包含對于患者是同種異基因性的經(jīng)活化的NK細胞。在另一個實施方式中，藥物組合物包含對于彼此是同種異基因性的經(jīng)活化的NK細胞?？捎欣嘏c本發(fā)明聯(lián)合使用的合適的保存技術(shù)包括細胞培養(yǎng)、冷藏和冷凍保存。在優(yōu)選的實施方式中，經(jīng)活化的NK細胞經(jīng)冷凍保存(例如，在氮氣中)至少約1天、例如至少1周、例如至少約4周、例如至少約3個月，例如約6個月，例如至少約一年，例如至少約五年等。在一個實施方式中，經(jīng)活化的NK細胞在包含DMSO和HAS的培養(yǎng)基中以如下的細胞密度被保存在冷凍細胞袋中約IxlO6至切107細胞/mL，更優(yōu)選地約IxlO7至hlO7細胞/mL。在一個實施方式中，通過融化而制備將經(jīng)冷凍保存的NK細胞用于施用。在一個實施方式中，不存在活化劑而融化經(jīng)活化的NK細胞，并在融化后將其立即施用。因此，本發(fā)明包括用于制造可輸注制劑形式的即用藥物的方法，所述制劑不含或基本上不含用于活化NK 細胞的試劑，所述方法包括下述或由下述組成融化不含或基本上不含活化劑的、冷凍保存的活化NK細胞，所述制劑用于治療癌癥而不共施用(無論同時、分別還是順次)活化劑。此實施方式中的可輸注制劑準備好立即使用而不用任何進一步的加工。在一個實施方式中，通過在保存前用⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞孵育而活化NK細胞。在一個實施方式中，所述⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞選自CTV-I，MV4-11，SEM，其亞系及它們的組合。在一個實施方式中，⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞包括CTV-I細胞。在另一個實施方式中，⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞包括MV4-11細胞。在另一個實施方式中，⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞包括SEM細胞。本申請還提供了用于制備和施用本發(fā)明的組合物的方法，所述方法包括1)獲得自體和/或同種異基因性NK細胞，幻用包含CD15+LAK-抗性腫瘤細胞的活化劑激活所述NK 細胞，幻不存在活化劑而保存經(jīng)活化的NK細胞，4)保存后制備經(jīng)活化的NK細胞用于施用， 例如，冷凍保存之后在基本上不含活化劑的藥學上可接受的載體中融化，以及幻不共施用 (同時或順次地)活化劑本身而向有需要的患者施用經(jīng)活化的NK細胞。在優(yōu)選的實施方式中，至少約50 %，更優(yōu)選至少約60，70或80 %，以及最優(yōu)選至少約90，95或98 %的活化的NK細胞被表征為⑶69+⑶25+⑶16 ⑶15+。在一個實施方式中，所采用的保存技術(shù)是冷凍保存，進行或不進行重懸，而在融化后立即將經(jīng)活化的NK細胞施用給患者。在一個實施方式中，經(jīng)活化的NK細胞對于患者是自體。在另一個實施方式中，經(jīng)活化的NK細胞包含對于患者為自體的NK細胞和對于患者為同種異基因性的NK細胞。在另一個實施方式中，經(jīng)活化的NK細胞對于患者為同種異基因性的。在另一個實施方式中， 經(jīng)活化的NK細胞對于彼此是同種異基因性的。還提供了用于刺激有需要的患者(例如攜帶腫瘤的患者)中內(nèi)源性NK細胞活性(例如，內(nèi)源性抗腫瘤活性)的方法，所述方法包括向所述患者施用之前經(jīng)活化以過表達⑶69和/或⑶25 (相比于靜止的NK細胞)且優(yōu)選地降低⑶16的表達和獲得⑶15的表達的外源NK細胞，其中所述NK細胞在不存在活化劑時顯示出持久的活性。如本申請中所詳述的，本發(fā)明的組合物的⑶69+⑶25+⑶16 ⑶15+活化NK細胞可被直接施用給有需要的患者而不反復(fù)或持續(xù)與活化劑相接觸，并且此外也不向患者共施用活化劑，如用LAK細胞的情形。在一個實施方式中，通過用⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞(例如，CTV-I腫瘤細胞， MV4-11腫瘤細胞，SEM腫瘤細胞等)接觸NK細胞而活化外源NK細胞。在優(yōu)選的實施方式中，⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞為CTV-I細胞。在本申請中所公開的一種方法中，細胞群包含外源NK細胞，其對于患者是自體的。在另一種方法中，細胞群包含對于患者是自體的外源NK細胞以及對于患者為同種異基因性的外源NK細胞。在另一種方法中，細胞群包含外源NK細胞，其對于彼此是同種異基因性的。在另一種方法中，細胞群包含對于患者是同種異基因性的外源NK細胞和對于彼此是同種異基因性的NK細胞。在一個實施方式中，細胞群在活化后和向所述患者施用前被保存。在優(yōu)選的實施方式中，細胞群是冷凍保存的。在示例性的實施方式中，所述方法還包括在施用步驟之前融化所述細胞群的步驟。重要地，如本申請中所表明的，本發(fā)明不要求保存之后和向患者施用之前再活化，并且也不要求共施用活化劑。附圖簡述

圖1顯示了⑶15+NK-抗性腫瘤細胞引發(fā)靜止的NK細胞裂解NK-抗性腫瘤細胞。 圖IA顯示了由下述靜止的NK細胞對NK-抗性RAJI細胞的裂解(％特異性裂解；y軸)， 所述靜止的NK細胞是未經(jīng)刺激的(NK ;x-軸)，以三種NK抗性陽性⑶15+白血病細胞 (CTV-1 (NK+CTV1 ；χ 軸)，MV-411 (NK+MV411 ；χ 軸)或 SEM(NK+SEM ；χ 軸))之一孵育的 NK 細胞，或者以兩種 CD15_ve 腫瘤細胞(M0LT-16(NK+M0LT16 ；χ 軸)或 PF-382 (NK+PF-382))之一孵育的NK細胞。圖IB顯示了由靜止的NK細胞(+NK ；χ軸)或以CTV-I細胞(+NK/CTV-1 ； χ軸)引發(fā)的NK細胞對NK抗性RAJI細胞(RAJI ；χ軸)、ΝΚ抗性骨髓瘤(RPMI8226 ；χ軸)、 漿細胞瘤(ARH77 ；χ軸)或上皮腫瘤細胞系(DU145 ；χ軸)的裂解(％特異性裂解；y軸)。圖2顯示了通過抗⑶15阻礙NK細胞引發(fā)。圖2A顯示出當單獨地(NK ;x軸)或在不存在(NK/CTV-1 ；χ軸)或存在下述抗體時以CTV-I細胞過夜孵育來自健康志愿者供體(n = 4)的靜止的人NK細胞后，表達⑶25(%⑶25+細胞-黑柱；y軸)或⑶69(%⑶69+ 細胞-白柱；y軸)的人NK細胞的百分比抗⑶Ila抗體(抗⑶lla;x軸)，抗CD18抗體 (抗⑶18 ；χ軸)，抗⑶15抗體(抗⑶15 ；χ軸)，抗⑶38抗體(抗⑶38 ；χ軸)，抗⑶48抗體(抗CD48 ；χ軸)或抗CD58抗體(抗CD58 ；χ軸)。棒(bar)代表對于每個樣品三次重復(fù)的平均百分比士 SD。圖2B顯示了由經(jīng)單獨孵育20h(NK;x軸)或以下列孵育的來自正常志愿者供體(n-5)的NK細胞對NK抗性RAJI細胞的裂解(％裂解；y軸)未處理的CTV-I 細胞(NK/CTV-1 ；χ軸)，在飽和濃度下以飽和濃度的抗⑶15抗體(克隆MEM 158-Serotek UK Ltd)處理的CTV-I細胞(NK/CTV-1預(yù)處理的⑶15 ；χ軸)；以飽和濃度的抗⑶49f (克隆 4F10-Serotek UK Ltd)預(yù)處理的CTV-I細胞(NK/CTV-1預(yù)處理的CD49f ；χ軸)；或以飽和濃度的抗CD56 (克隆NCAM 16. 2-BDIS，UK)預(yù)處理的CTV-I細胞(NK/CTV-1預(yù)處理的CD56 ； χ軸)。棒代表對于每個樣品三次重復(fù)的平均百分比士SD。圖3顯示了用FUT4轉(zhuǎn)染NK抗性RAJI細胞使得細胞易受NK介導(dǎo)的裂解。圖3中的棒代表靜止的NK細胞對下列的平均百分比特異性裂解士SD(%特異性裂解；y軸)未修飾的RAJI細胞(RAJI ；χ軸)，CD15+RAJI細胞(RAJI T15 ；χ軸)；用抗CD15抗體預(yù)處理的 CD15+RAJI 細胞(RAJI T15+ 抗 CD15 ；χ 軸)；用抗 CD56 抗體預(yù)處理的 CD15+RAJI 細胞(RAJI T15+抗CD56)，K562細胞￠56 ；以及用抗CD15抗體預(yù)處理的K562細胞(K562+抗CD15)。 對于所有的實驗(n = 3)，效應(yīng)子靶的比率均為5:1。圖4顯示的是腫瘤介導(dǎo)的NK引發(fā)與喪失⑶16的表面表達相關(guān)。圖4顯示了不存在(NK ο/η ；χ軸)或存在CTV-I細胞(NK/CTV-1)時以2 1的刺激因子響應(yīng)子比率過夜孵育后，分離自9名健康患者的、表達⑶16 ⑶16陽性；y軸)的NK細胞的百分比。每個方形或三角形代表NK細胞從其中分離的9名健康供體之一。不存在腫瘤刺激時，CD16+NK 細胞的比例保持穩(wěn)定。相反，CTV-I介導(dǎo)的引發(fā)導(dǎo)致顯著喪失⑶16表達(ρ <0.01)。
圖5顯示了用CTV-I刺激之后的細胞內(nèi)磷酸化。圖5A顯示了具有磷酸化的 ⑶3 ζ (⑶3 zeta PE ；χ軸)的NK細胞數(shù)目(事件；y軸)，這是如用RAJI細胞(實心的直方圖)或CTV-I細胞(非實心的直方圖)刺激靜止的NK細胞10分鐘然后固定之后，通過流式細胞計數(shù)分析所測定的。圖5B顯示了如通過流式細胞計數(shù)分析(n = 3)所測定的、以 2 1的刺激因子響應(yīng)子比率用CTV-I細胞刺激后，具有磷酸化的LAT(pLAT;D)或磷酸化的ZAP70(pZAP70 ；▲)的人NK細胞在各時間點(分鐘；χ軸)的平均百分比士SD(%陽性；y軸)。圖5C顯示了在用CTV-I細胞刺激靜止的NK細胞0分鐘，5分鐘，10分鐘或20 分鐘后，具有磷酸化的STAT5 (pSTAT5 ；χ軸)的NK細胞的數(shù)目(y軸)。圖5C為3個實驗的代表性圖表。圖6表明了 CTV-I或IL-2刺激之后NK的活化。圖6A顯示出在不存在任何經(jīng)活化的試劑(NK ο/η ；χ軸)時、以1 2的比率存在CTV-I細胞(NK/CTV-1 ；χ軸)時、或存在IL-2 (100 . u. /mL) (LAK ；χ軸)時過夜孵育4 后，對于CD25的表達為陽性的NK細胞的百分比(％陽性；y軸)。對于表面表達的Cd69和細胞內(nèi)IFN-Y標記平行的培養(yǎng)物。圖6 和6G是直方圖，其顯示在不存在任何活化劑(圖6B和6E)、存在CTV-I細胞(圖6C和6F) 或存在IL-2(圖6D和圖6G)時過夜孵育后，表達細胞表面⑶69(圖6B，6C和6D)或細胞內(nèi)IFN-Y (圖6E，6F和6G)的NK細胞數(shù)目(y軸)。每個直方圖中的垂直棒代表特定同種型-匹配的陰性對照的最大熒光。圖7顯示出甚至在冷凍保存之后，經(jīng)CTV-I引發(fā)的NK細胞仍保持其經(jīng)引發(fā)的狀態(tài)。圖7A是在免疫磁性分選NK細胞之前，用CTV-I細胞裂解物刺激了 20個小時并用抗 ⑶56-FITC和抗⑶3-APC抗體孵育的外周血單核細胞的點圖。圖7B是在免疫磁性分選NK 細胞之后，用CTV-I細胞裂解物刺激了 20個小時、并用抗⑶56-FITC和抗⑶3-APC抗體孵育的外周血單核細胞的點圖。在每個點圖中，在標示為R2的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了 NK細胞，在標示為R3的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了 NKT細胞，在標示為R4的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了 CTV-I裂解物，以及在標示為 R5的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了 T細胞。圖7C顯示了用CTV-I裂解物新鮮引發(fā)的NK細胞(新鮮；χ軸) 和之前用CTV-I裂解物引發(fā)、被冷凍保存了 14天、并在用RAJI細胞孵育之前融化的NK細胞(融化后；χ軸)對RAJI細胞的裂解(％特異性裂解；y軸)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及下列出乎意料的發(fā)現(xiàn)與LAK細胞相反，本申請所提供的活化的NK細胞群甚至在不存在活化劑時仍顯示出持久的活性，并且重要地，盡管有延長時間段的中間的保存，其仍保留抗腫瘤活性。本申請中所描述的之前經(jīng)活化的NK細胞的經(jīng)保存的細胞群可跨越同種異基因性障礙而被有效地使用并且，同樣是令人驚訝地，其能夠在過繼性轉(zhuǎn)移到攜帶腫瘤的宿主中后將殺腫瘤能力轉(zhuǎn)移至內(nèi)源性宿主NK細胞，從而在體內(nèi)產(chǎn)生NK活化級聯(lián)。因此，可在主動和被動免疫療法設(shè)置中均更為一般性和更為實際地采用本申請所提供的活化的NK細胞群，而無需個體化的治療方案、實時施用方案和/或共施用否則不希望的和/或有毒的活化劑。根據(jù)本發(fā)明，包含以⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞活化的NK細胞的、之前經(jīng)保存的細胞群顯示出持久的和延長的活性，甚至在不存在活化劑而保存后、以及保存后沒有用活化劑再活化或與活化劑相接觸時亦是如此。因此，可采用例如細胞培養(yǎng)、冷藏、冷凍保存等保存方法而不顯著喪失活性且經(jīng)活化的細胞可在保存后被立即施用于患者，例如制備所述細胞用于施用不需要包括使細胞暴露于活化劑而使細胞為治療性的，并且經(jīng)活化的細胞無需聯(lián)合活化劑本身而被共施用。本申請中所公開的是包含在保存后被制備用于施用的、經(jīng)活化的NK細胞的藥物組合物，以及相應(yīng)的使用方法。如本申請中所使用的，“之前經(jīng)活化的”是指在接觸和/或暴露于(例如，以其孵育)活化劑(例如CD15+LAK-抗性腫瘤細胞，和優(yōu)選地為CD15+LAK-抗性腫瘤細胞制備物)
> . 、r -如本申請中所使用的，“持久的”在NK細胞活化的情境中是指之前經(jīng)活化的NK細胞在不持續(xù)或重復(fù)接觸活化劑時，在延長的時間段中(例如至少約6-8小時、更優(yōu)選地至少約10-12小時，仍然更優(yōu)選地至少約12至14小時)維持裂解活性(例如抗腫瘤活性)的能力。天然殺傷(NK)細胞NK細胞是通過表達⑶56或⑶16和不存在T細胞受體(⑶幻而定義的外周血淋巴細胞的亞群。它們以MHC-不受限的方式不進行引發(fā)而識別和殺傷經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞系。NK細胞在同種異基因性或自體干細胞移植后許多月中代表外周血中主要的淋巴細胞，并且它們在這一時期中在對病原體的免疫性方面具有主要作用(Reittie et al (1989)Blood 73 :1351-1358 ；Lowdell et al (1998)Bone Marrow Transplant 21: 679-686)。NK細胞在移植、移植物-相對-宿主疾病、抗白血病活性和移植后感染中的作用被綜述于 Lowdell Q003)Transfusion Medicine 13 :399-404 中。人NK細胞通過天然細胞毒性和抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)介導(dǎo)腫瘤細胞和病毒感染的細胞的裂解。人NK被陽性和陰性細胞裂解信號控制。陰性(抑制性)信號是通過含有受體 ⑶94/NKG2A的C-凝集素結(jié)構(gòu)域以及通過一些殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)轉(zhuǎn)導(dǎo)的。通過抑制信號來調(diào)節(jié)NK裂解已知為“失去自我”假設(shè)，其中在靶細胞表面上表達的特定HLA-I類等位基因連接NK細胞上的抑制性受體。腫瘤細胞和一些經(jīng)病毒感染的細胞(例如CMV)上 HLA分子的下調(diào)使這一抑制下降到靶標閾值之下，并且如果靶細胞也攜帶NK引發(fā)和激活分子，則靶細胞可變得易受NK細胞介導(dǎo)的裂解。抑制性受體分為兩組，即Ig超家族的那些(稱為殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)) 和凝集素家族的那些(NKG2)，其在細胞表面與CD94形成二聚體。IQR具有2-結(jié)構(gòu)域或3-結(jié)構(gòu)域細胞外結(jié)構(gòu)并結(jié)合HLA-A，HLA-B或HLA-C。NKG2/CD94復(fù)合體連接HLA-E。抑制性KIR具有最多4個細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其含有ITIM并且被最好地表征的是 KIR2DLUKIR2DL2 和 KIR2DL3，其已知結(jié)合 HLA-C 分子。KIR2DL2 和 KIR2DL3 結(jié)合組 IHLA-C 等位基因而KIR2DL1結(jié)合組2等位基因。某些白血病/淋巴瘤細胞表達組1和組2HLA-C 等位基因并且已知對于NK介導(dǎo)的細胞裂解有抗性。關(guān)于陽性活化信號，ADCC被認為是通過⑶16介導(dǎo)的，并且已鑒別了許多促成天然細胞毒性的觸發(fā)受體，這包括 CD2，CD38，CD69，NKRP-I，CD40，B7-2, NK-TR, NKp46, NKp30 和NKp44。此外，數(shù)種具有短的胞質(zhì)內(nèi)尾部的MR分子也是刺激性的。這些KIR(KIR2DS1， KIR2DS2和KIR2DS4)已知結(jié)合HLA-C ；它們的細胞外結(jié)構(gòu)域與它們的相關(guān)抑制性MR是相同的?；罨訩IR缺乏ITIM卻與DAP12相締合，從而引起NK細胞活化。控制抑制性MR 相對于活化性KIR的表達的機制仍然未知。
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本發(fā)明的NK細胞可以是自體的或同種異基因性NK細胞?！白泽w”NK細胞是源自患者(例如帶有腫瘤的宿主)的細胞。“同種異基因性”NK 細胞源自另一個、非遺傳上相同的個體。如果NK細胞源自同卵雙胞胎，則它們可被稱為是 “同基因的”。供體NK細胞可以是HLA-IQR匹配的或不匹配的。當前的發(fā)明者顯示了 NK細胞與靶腫瘤細胞之間的匹配程度是不重要的。活化劑本申請中所公開的是之前經(jīng)活化的NK細胞的經(jīng)保存的細胞群，其顯示出持久的活性，即其在保存后或在不存在活化劑時保持活化的狀態(tài)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認可， 如本申請中所使用的，活化劑指任何下列試劑其激活NK細胞(例如，增加NK細胞的裂解活性)以過表達⑶69和/或⑶25 (與靜止的NK細胞相比)，且更優(yōu)選地還獲得⑶15表達并喪失CD16表達。如本申請中所表明的，根據(jù)本發(fā)明活化的NK細胞在終止與活化劑的接觸后(例如，在不存在活化劑的保存過程中)維持其活化狀態(tài)。在本部分以及整個文件中，術(shù)語“活化”與術(shù)語“刺激”同義地使用。本發(fā)明還提供用于確定試劑是否是本申請中所公開的活化劑的方法，所述方法具有下列步驟(i)使所述試劑與NK細胞接觸以活化所述NK細胞；(ii)保存經(jīng)活化的NK細胞；(iii)使來自步驟(ii)的經(jīng)活化的NK細胞與對由非活化的NK細胞的裂解有抗性的靶細胞接觸；(iv)確定靶細胞是否被來自步驟(ii)的NK細胞所裂解；其中經(jīng)活化的NK細胞在保存中或保存后的任何時間未與所述活化劑相接觸或未暴露于所述活化劑(例如，在保存中和/或保存后保持基本上不含活化劑)。任選地，可以分析來自上面的步驟(i)或步驟(iv)的活化的NK細胞以確定CD69、 ⑶25、⑶16和⑶15的表達，其中合適的活化劑將產(chǎn)生這樣的NK細胞其在活化后過表達 ⑶69和⑶25 (與靜止的NK細胞相比)、喪失⑶16的表達并獲得⑶15的表達。因此，技術(shù)人員可容易地判定以確立給定的試劑是否具有作為如本申請中所描述的活化劑的能力。如實施例中所描述的，某些腫瘤細胞(例如CD15+LAK-抗性腫瘤細胞)具有下述能力刺激NK細胞以增加其裂解腫瘤細胞的能力。已顯示經(jīng)刺激的NK細胞能夠裂解“NK 抗性”腫瘤細胞(即對用未經(jīng)刺激的NK細胞進行的裂解有抗性的腫瘤細胞)。此外，此類經(jīng)刺激的NK細胞在不存在CD15+LAK-抗性腫瘤細胞時于保存后維持其活化的狀態(tài)，并且因此，其無需在保存后通過隨后與CD15+LAK-抗性腫瘤細胞接觸而再活化。因此，在一個實施方式中，如本申請中所公開的活化劑為CD15+LAK-抗性腫瘤細胞。如本申請中所使用的，“⑶15”是指⑶2的配體，其在結(jié)構(gòu)上與⑶15相關(guān)并且對于引發(fā)靜止的NK細胞是關(guān)鍵的。如本申請中所使用的，“⑶15”也可指GeneID :2526的產(chǎn)物，其官方名稱是FUT4，并且其也已知為ELFT，F(xiàn)CT3A, FUTIV和FUC-TIV。GeneID :2526的產(chǎn)物將巖藻糖轉(zhuǎn)移至N-乙酰乳糖胺多糖以生成巖藻糖化的糖結(jié)構(gòu)。其還催化非唾液酸化抗原Lewisx (CD15)的合成。因此，為“⑶15+”的細胞表達⑶2的配體。
腫瘤細胞系通常被LAK細胞殺傷。然而，LAK抗性腫瘤細胞顯著地避免LAK細胞的裂解。LAK抗性腫瘤細胞的非限制性實例包括CTV-I細胞、MH13M細胞、OKM-M細胞、 MV4-11細胞、SEM細胞等。能夠活化NK細胞從而使得所述NK細胞甚至在不存在活化腫瘤細胞時在保存之后仍保持其活化狀態(tài)的CD15+LAK-抗性腫瘤細胞包括CTV-I細胞、MV4-11細胞、SEM細胞、其亞系或其組合。因此，在一個實施方式中，所述活化劑為CTV-I細胞。此細胞系是商業(yè)上可得的，例如來自德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)。在一個實施方式中，活化細胞是從CTV-I亞系獲得的。在另一個實施方式中，所述活化劑為MV4-11細胞。此細胞系也是商業(yè)上可得的，例如來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC號CRL-9591) (Lange，et al. (1987) Blood 70 :192-199 ；Santoli，et al. (1987) J. Immunol. 139 :3348-3354) 在另一個實施方式中，活化劑為SEM細胞。這一細胞系也是商業(yè)上可得的，例如來自DSMZ (DSMZ No. ACC456) (Grei 1, et al. (1994)Br. J. Haemotol. 86 :275-83 ；Reichel, et al. (1998)Oncogene 17: 3035-44 ；Drexler，et al. (2004)Leukemia 18 :227-232)。還預(yù)期的是其它的腫瘤細胞也將具有活化NK細胞從而使得所述NK細胞在不存在 CD 15+LAK-抗性腫瘤細胞時在保存之后仍保持其活化狀態(tài)的能力。本發(fā)明還提供用于確定腫瘤細胞制備物是否是如本申請中所公開的活化劑的方法，所述方法包括下列步驟(i)使所述腫瘤細胞制備物與NK細胞接觸；(ii)儲存所述NK細胞；(iii)使來自步驟(ii)的NK細胞與對由非活化的NK細胞的裂解有抗性的靶細胞接觸；(iv)確定靶細胞是否被來自步驟(ii)的NK細胞所裂解；其中經(jīng)活化的NK細胞在保存后的任何時間未與所述腫瘤細胞制備物相接觸或未暴露于所述腫瘤細胞制備物(例如，在保存中和保存后保持基本上不含活化劑)。因此，技術(shù)人員有可能確立給定的腫瘤細胞制備物是否具有作為活化劑的能力并且就此活性篩選已知的腫瘤細胞。在一個實施方式中，所述活化腫瘤細胞制備物可以是腫瘤細胞系，例如可以由下列組成或包含下列完整的腫瘤細胞群，例如CTV-I細胞、SEM細胞、MV-411細胞或其組合， 優(yōu)選地使其不可成活(例如通過固定或輻射)。在一個實施方式中，腫瘤細胞制備物可由腫瘤細胞裂解制備物組成或包含腫瘤細胞裂解制備物。例如，細胞裂解制備物可通過標準的固定技術(shù)(例如使用多聚甲醛)制成。 固定具有下述優(yōu)勢制備物被穩(wěn)定化、具有長得多的“存架期”并且更易于儲存。合適的細胞裂解制備物也可通過冷凍-融化的重復(fù)循環(huán)，與DNA酶處理相結(jié)合而制作。此類制備物可被認為具有增加的安全性，因為其降低了與朊病毒等相關(guān)的污染可能性?？稍谑褂弥?，通過標準的技術(shù)輻射⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞。裂解制備物與包含完整腫瘤細胞的制備物相比具有優(yōu)勢，因為其避免了將潛在的惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)移至患者的風險。在一個實施方式中，活化腫瘤細胞制備物由CTV-I裂解物組成或包含CTV-I裂解物。CD15+LAK-抗性腫瘤細胞可以是或可包含源自腫瘤細胞的實體(例如蛋白質(zhì))。 ⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞可以，例如包含重組蛋白。所述蛋白可源自CTV-I細胞、MV4-11細胞、SEM細胞、其亞系、或它們的組合?？赏ㄟ^例如共培養(yǎng)(其中使用完整的腫瘤細胞)而使⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞與NK細胞制備物在一起?！盎罨瘯r間”將取決于細胞制備物的性質(zhì)和接觸條件，但可通常為 12-24小時，也可為20小時。當前的發(fā)明人顯示了用⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞(例如CTV-I細胞、MV4-11細胞、 SEM細胞、其組合、其亞系等)預(yù)孵育NK細胞引起NK細胞上⑶69的快速上調(diào)。他們還顯示了(使用經(jīng)標記的CD69)通過活化的NK細胞可裂解的腫瘤細胞表達CD69配體(CD69L)，但是這一表達不存在于未被裂解的細胞(例如B細胞)上。重組CD69的存在抑制活化的NK 細胞裂解腫瘤細胞的能力，可能是因為其阻礙了在腫瘤細胞上與CD69L的相互作用。與CTV-I接觸后，除⑶69之外，IL-2受體⑶25也在NK細胞上被上調(diào)。相反，⑶25 與通過IL-2的NK活化相聯(lián)合而被下調(diào)。因此，在一個實施方式中預(yù)期用于本申請中的活化劑也產(chǎn)生⑶69+和/或⑶25+的活化的NK細胞群。在其它實施方式中，與CTV-I接觸引起CD15轉(zhuǎn)移至活化的NK細胞(例如，獲得 ⑶15的NK細胞)，以及活化后NK細胞上⑶16表達的減少。因此，在其它的實施方式中，預(yù)期用于本申請的活化劑也產(chǎn)生也為CD15+和/或CD16 的活化的NK細胞群。保存如本申請中所使用的，術(shù)語“保存”和“保存的”通常指使細胞組合物以可成活的形式持續(xù)保存，從而所述細胞組合物在所述保存后可被制備用于向受試者(例如人患者)施用。如本申請中所公開的，活化的NK細胞群通常在不存在活化劑時被保存并顯示出持久的活性，即無需用活化劑再刺激來提供治療益處。雖然對于使活化的NK細胞顯示出持久的活性而言不是必需的，并且是較不優(yōu)選的，活化的NK細胞群也可在活化劑的存在下被保存。如本申請中所描述的，活化的NK細胞群可根據(jù)任何熟知的方法被保存，見例如美國專利號7，270，946 ；7，150，991 ；6，921，633 ；Kanias and Acker (2006)Cell Preservation Technology 4 :253-277等，其中的每一篇都在此以其全部通過引用而并入。在一個實施方式中，本申請中所描述的活化的NK細胞群是通過選自下列的方法被保存的細胞培養(yǎng)、冷藏和冷凍保存。在優(yōu)選的實施方式中，本申請中所描述的NK細胞群是通過冷凍保存被保存的。在保存過程中、并且最優(yōu)選地在保存之后，活化的NK細胞群優(yōu)選基本上不含活化劑。可使用熟知的方法來獲得基本上不含活化劑的活化的NK細胞群。例如，可通過密度梯度分離和清洗、或通過免疫磁性選擇CD56+NK細胞及隨后的清洗、或上述的組合，而從活化劑中分離活化的NK細胞。獲得基本上不含活化劑的活化的NK細胞群后，活化的NK細胞可通過細胞培養(yǎng)、冷藏或冷凍保存而被保存。在一個實施方式中，活化的NK細胞是通過細胞培養(yǎng)而被保存的。 通常，通過細胞培養(yǎng)的保存包括將之前經(jīng)活化的NK細胞懸浮于適于維持活化的NK細胞的存活的培養(yǎng)基中，以及在生理學上相關(guān)的環(huán)境(例如，371和約7%0)2)中孵育懸浮物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認可，許多不同的公知培養(yǎng)基適于維持活化的NK細胞的存活。在一個實施方式中，在化學上確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化的NK細胞群。如本申請中所使用的，“化學上確定的”是指已知化學組成(定量及定性地)而無有意添加的未經(jīng)表征的補充物的培養(yǎng)基，雖然此種培養(yǎng)基在其組分中可含有痕量的污染物?；瘜W上確定的培養(yǎng)基必須缺少動物血清、飼養(yǎng)細胞(例如基質(zhì)細胞)和基于細胞的細胞外基質(zhì)，其源自例如成纖維細胞等。通過細胞培養(yǎng)而保存后，活化的NK細胞可被制備用于施用而不使所述細胞暴露于活化劑。通常，通過冷藏保存包括使活化的NK細胞懸浮在適于維持細胞存活的培養(yǎng)基 (例如，化學上確定的培養(yǎng)基)中，以及在約4°C孵育懸浮物。通過冷藏而保存后，活化的NK 細胞可被制備用于施用而不使所述細胞暴露于活化劑。各種用于冷凍保存細胞的介質(zhì)和方案(包括玻璃化)是本領(lǐng)域中已知的。見例如，Strong DM et al. (1982) J. Clin. Immunol. 2 :214-221。通常細胞可被濃縮、懸浮在包含冷凍保護劑和/或穩(wěn)定劑的冷凍介質(zhì)中、分配到適當?shù)睦鋬鋈萜髦小⒁允箤鋬龅募毎膿p傷最小化和使恢復(fù)最大化的速率冷卻、以及在液氮或汽相的液氮中在例如-70°C或更低 (例如，-80°C或更低，例如_135°C或更低)中冷凍保存。在獲得基本上不含活化劑的活化的NK細胞后，可將NK細胞重懸于冷凍保護劑或冷凍介質(zhì)中。通常以與其所被培養(yǎng)的密度不同的細胞密度冷凍保存所述細胞。在一個實施方式中，以約5X106細胞/mL冷凍介質(zhì)至約2X107細胞/mL冷凍介質(zhì)的細胞密度冷凍保存之前經(jīng)活化的NK細胞。在優(yōu)選的實施方式中，以IOXlO6細胞/mL冷凍介質(zhì)冷凍保存之前經(jīng)活化的NK細胞。冷凍介質(zhì)通常包含培養(yǎng)基、冷凍保護劑、血清和任選地包含穩(wěn)定劑。細胞可被保存在任何本領(lǐng)域中已知的冷凍保護劑中。例如，所述冷凍保護劑可以是二甲亞砜(DMSO)或甘油。在一些實施方式中，所述冷凍介質(zhì)包含約5-10 %的DMS0、10-90 %的血清白蛋白和 50-90%的培養(yǎng)基。在一些實施方式中，冷凍保存介質(zhì)將包含約7. 5%的DMSOj^ 42. 5%的血清白蛋白和約50%的培養(yǎng)基。細胞還可被保存在任何本領(lǐng)域已知的穩(wěn)定劑中。例如，所述穩(wěn)定劑可以是甲基纖維素或血清。其它可用于保存細胞的添加劑包括(通過例舉而非限制的方式)二糖例如海藻糖(Scheinkonig, C. et al.，Bone Marrow Transplant. 34(6) 531-6 (2004))，或血漿容量擴增劑，例如羥乙基淀粉(即羥基乙基淀粉)。在一些實施方式中，可使用等張緩沖溶液，例如磷酸鹽緩沖液。示例性的冷凍保存組合物具有含4% HSA、 7. 5%二甲亞砜(DMSO)和2%羥乙基淀粉的細胞培養(yǎng)基。用于冷凍保存的其它組合物和方法是本領(lǐng)域熟知的和在本領(lǐng)域中被描述過的(見例如，Broxmeyer，H. E. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci USA 100(2) :645-650 (2003)) 在冷凍之前，可將活化的NK細胞分配到數(shù)個單獨的容器中以創(chuàng)建細胞庫。細胞可被保存在例如玻璃或塑料的小瓶、管或袋子等中。當需要將細胞用于將來使用時，可從細胞庫中選擇一部分經(jīng)冷凍保存的細胞(來自一個或多個容器)，并將其制備用于施用。這可有利地以主動和全身性的方式對多個供體進行，以創(chuàng)建用于隨后使用的活化的NK細胞庫。在優(yōu)選的實施方式中，如本申請中所描述的，供體細胞在冷凍保存之前被活化，然后可用于根據(jù)本申請所提供的教導(dǎo)來治療供體、供體家庭的成員和/或其它不相關(guān)的第三方。在一個實施方式中，保存后制備活化的NK細胞用于施用不包括使細胞暴露于活化劑。通常公知的是，不同細胞類型的冷凍保存可能受到冷卻速度的影響。例如，過快的冷卻速度可引起致命的細胞內(nèi)冰晶的形成。相反，過慢的冷卻速度可對細胞造成滲透沖擊損傷。研究已顯示，對于大多數(shù)生物學細胞，存在可被認為對于所述細胞類型是最佳的特定冷卻速度。用于確定活化的NK細胞的最佳冷卻速度的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。見例如，F(xiàn)ujiwara et al. (1986) J. Immunol. Methods 90:265—73。
在一個實施方式中，本申請的活化的NK細胞群是以約-1°C /分鐘至約_3°C /分鐘，優(yōu)選-l°c / 分鐘的速度冷凍的。見例如，Locke et al. (1984)Psychosomatic Med. 46 441-453。在另一個實施方式中，如本申請所描述的活化的NK細胞群在不同的相中以不同的速度被冷卻，例如在液相中的速度是-1°C /分鐘至_2°C，在相變化過程中的速度是約-5°C而在固相中的速度是_2°C /分鐘至_3°C。見例如，F(xiàn)ujiwara S. et al. (1986) J. Immunol. Methods 90:265-273。在另一個實施方式中，可以_1°C /分鐘的速度將細胞冷卻至_4°C，然后以-25°C /分鐘的速度至-40°C，然后以15°C /分鐘的速度加溫到-12°C， 然后以-1°C /分鐘的速度冷卻到-40°C，并且然后以-10°C /分鐘冷卻到-70°C。見例
Schmidt-Wolf et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:185-189。在優(yōu)選的實施方式中，以-1°C /分鐘的速度將細胞從4°C冷卻到-30°C，并且隨后以_2°C /分鐘的速度冷卻到-100°C?？墒褂帽绢I(lǐng)域中熟知的設(shè)備(例如，可編程的控速冷凍系統(tǒng))來實現(xiàn)以特定的冷卻速度冷凍之前經(jīng)活化的NK細胞。例如，冷卻細胞用于冷凍保存的商業(yè)設(shè)備可通過向設(shè)備中注射液氮汽而實現(xiàn)受控的溫度改變。隨著設(shè)備內(nèi)的溫度增加或降低，可注射另外的液氮以保持所希望的冷卻速度。備選地，可在機械冷凍機中冷凍活化的NK細胞?？扇绫旧暾堉兴枋龅幕蚋鶕?jù)普通技術(shù)人員已知的任何方案來冷凍活化的NK細胞，例如-135°C、液氮汽寸。在一個實施方式中，活化的NK細胞群可被冷凍保存在冷凍細胞袋(例如，可以1-2X107細胞/mL的細胞密度冷凍活化的NK細胞群)中、在介質(zhì)(例如，包含比例為 45 (X-vivo) 10 (DMSO) 45 (HSA)的 X-vivolO (VWR，West Chester，PA)、二甲亞砜(DMSO) 和人血清白蛋白(HSA)的介質(zhì))中，以及經(jīng)真空包裹于-135°C或低于-135°C的氮氣中在受監(jiān)控的氮冷藏箱中。與LAK細胞相反(其通常在不存在IL-2時在保存約12小時后喪失其活化的狀態(tài))，本發(fā)明的活化的NK細胞的保存令人驚訝地不影響細胞的活化狀態(tài)，即使是在不存在活化劑時進行所述保存亦是如此。在一個實施方式中，保存可發(fā)生超過12個小時，更一般性地超過12至18個小時，并且優(yōu)選地超過M至36個小時。在一個實施方式中，本申請中所描述的活化的NK細胞群可被冷凍保存(例如在氮氣中)至少約1天，例如至少約1周， 例如至少約4周，例如至少約3個月，例如至少約6個月，例如至少約1年，例如至少約5年寸。保存之后，細胞群可被制備用于向患者施用?？筛鶕?jù)熟知的方法實現(xiàn)冷凍細胞的融化。一般的融化程序包括將冷凍的細胞快速轉(zhuǎn)移至37°C的水浴以及提供輕柔的攪拌直至活化的NK細胞完全融化。融化之后，可通過如下而將融化的NK細胞制備用于向患者中施用在室溫下加入(優(yōu)選以逐滴的方式)藥學上可接受的載體，例如以稀釋冷凍介質(zhì)的濃度和/或清洗之前經(jīng)活化的NK細胞。如本申請中所表明的，本發(fā)明的細胞群在此種保存后沒有持續(xù)地和/或隨后暴露于活化劑而維持其活化狀態(tài)。如此，在一個實施方式中，細胞在不存在活化劑時被制備用于施用。保存后用于施用的細胞的制備取決于保存方法。例如， 可通過細胞培養(yǎng)和/或冷藏而在保存后制備細胞用于施用，所述制備可通過下列的一步或多步清洗細胞、使細胞重懸于藥學上可接受的載體中和/或使細胞包含在合適的遞送設(shè)備(例如，注射器)中。在一個實施方式中，通過融化而在冷凍保存后制備細胞用于施用，例如通過在37°C水浴中輕柔的攪拌以及然后使細胞包含在合適的遞送設(shè)備(例如注射器) 中。這些融化的細胞群令人驚訝地可基于需要幾乎立即被用于臨床中，例如在沒有再活化或其它大量和/或費時的操作的情況下。因此，雖然不是必須的，可通過在室溫下加入(優(yōu)選以逐滴的方式)藥學上可接受的載體以例如稀釋不含冷凍介質(zhì)的細胞的濃度和/或清洗不含冷凍介質(zhì)的細胞，而進一步制備冷凍保存后用于施用而制備的細胞。在一個實施方式中，所述藥學上可接受的載體基本上不含活化劑。組合物因此，本申請中所公開的是包含活化的NK細胞和基本上不含活化劑的藥學上可接受的載體或介質(zhì)的藥物組合物?；罨腘K細胞顯示出持久的和延長的活性，并且甚至在保存之后保持其活化狀態(tài)?；罨腘K細胞可以是之前經(jīng)保存的活化的NK細胞。在優(yōu)選的實施方式中，與靜止的NK細胞相比，本申請的活化的NK細胞過表達⑶69和/或⑶25以及更優(yōu)選地，作為活化的結(jié)果，其喪失⑶16的表達并獲得⑶15的表達。還包括在本發(fā)明中的是不含或基本上不含用于活化NK細胞的試劑的即用性可輸注制劑，所述制劑用于不共施用(無論是同時、分別還是順次)活化劑而治療癌癥。本發(fā)明的實施方式在于用于制造不含或基本上不含用于活化NK細胞的試劑的即用可輸注制劑的方法，所述方法包括下述或由下述組成融化經(jīng)冷凍保存的、不含或基本上不含活化劑的活化的NK細胞，所述制劑用于不共施用(無論是同時、分別還是順次)活化劑而進行的治療性應(yīng)用。此實施方式中的可輸注制劑準備好用于立即應(yīng)用而沒有任何進一步的加工。所述可輸注制劑可被用于治療癌癥。如本申請中所描述的，本發(fā)明的經(jīng)活化的⑶69+⑶25+CD16 ⑶15+NK細胞(與LAK 細胞相反)可在保存后立即被制備用于施用，即不需要再活化且不需要同時或順次地共施用活化劑。因此，在一個實施方式中，藥物組合物包含基本上不含活化劑的、藥學上可接受的載體或介質(zhì)中的被制備用于施用的活化的NK細胞。在一個實施方式中，活化的NK細胞可包含關(guān)于接受者為自體的和/或同種異基因性的NK細胞，或基本上由其組成。換言之，自體NK細胞可從接受者的外周血獲得。同種異基因性NK細胞可以是部分或完全HLA不匹配的，并且可以從來自供體個體或多個供體的外周血獲得?？赏ㄟ^標準技術(shù)(例如常規(guī)的成分輸血)來收集外周血單核細胞。為了使得移植物相對宿主疾病和免疫介導(dǎo)的發(fā)育不全的可能性最小化，可耗盡同種異基因性細胞的T細胞。例如，可使用與單克隆小鼠抗人CD3抗體相綴合的微珠和細胞選擇設(shè)備(例如Miltenyi Biotec CliniMACS. RTM.細胞選擇設(shè)備)來耗盡細胞制備物的CD3+T-細胞。然而，單獨通過此類“陰性選擇”過程而產(chǎn)生的NK細胞不具有高純度并且可被T 和B細胞污染。雖然在自體設(shè)置中不是必需的，去除此類細胞在本申請中所涉及的同種異基因性設(shè)置中是有利的。為了減少污染，有可能通過直接的免疫磁性分離(例如基于CD56 的表達)來獲得NK細胞制備物。為了進一步減少T細胞污染，可耗盡產(chǎn)物中的CD3+細胞 (例如使用CD3 FITC和抗FITC珠子)。在用活化劑活化之前，NK細胞制備物可包含至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的⑶56+細胞。在另一個實施方式中，在通過活化劑活化之前，NK細胞制備物可包含少于15%、少于10%、少于5%或少于3%的⑶3+細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認可，在自體設(shè)置中，T細胞含量是無關(guān)的，并且由此，可使用非選擇的NK細胞。本發(fā)明的⑶69+⑶25+⑶16 ⑶15+活化的NK細胞令人驚訝地在不存在活化劑時、 甚至在保存后仍保持其活化狀態(tài)，并且因此不需要在醫(yī)療應(yīng)用之前或之中再活化和/或隨后與活化劑相接觸。因此，本申請所公開的藥物組合物包含基本上不含活化劑的、在藥學上可接受的載體中的此類之前經(jīng)活化的NK細胞。本發(fā)明的NK細胞即使通過例如細胞培養(yǎng)、 冷凍保存、冷藏等保存，仍顯示出延長的活性(即在不存在活化劑時，在保存后保持其活化的狀態(tài))。在一個實施方式中，本申請中所公開的藥物組合物包含融化的細胞群，其含有在不存在活化劑時在保存后保持其活化狀態(tài)的活化的NK細胞，和藥學上可接受的載體，其中融化的細胞群包含用于治療癌癥的藥學上有效量的活化的NK細胞。實現(xiàn)治療效果所需的細胞的量可根據(jù)用于特定目的的常規(guī)程序依經(jīng)驗確定。通常，對于施用細胞用于治療目的，以藥學上有效的劑量給予所述細胞?！八帉W上有效量”或 “藥學上有效的劑量”是足以產(chǎn)生所希望的生理學效果的量或能夠?qū)崿F(xiàn)所希望的結(jié)果的量， 特別是用于治療病癥或疾病狀況、包括降低或消除病癥或疾病的一種或多種癥狀或表現(xiàn)的量。作為闡示，不僅當潛在的病況被清除或緩解時，也當患者報告與疾病相關(guān)的癥狀的嚴重性或持續(xù)時期減少時，向患有癌癥的患者施用所述細胞提供了治療性益處。治療性益處也包括停止或減緩潛在疾病或病癥的進展，無論是否實現(xiàn)了改善。藥學上有效的劑量(如上文所定義的)也將適用于與所述細胞相組合使用的治療性化合物，如下文中所進一步描述的。藥物組合物通常將包含藥學上可接受的載體和藥學上有效量的本發(fā)明的 ⑶69+⑶25+⑶16 ⑶15+NK細胞。藥物組合物通?？杀慌渲茷槿芤骸腋∥?、氣霧劑和其它本領(lǐng)域已知的制劑。如本申請中所使用的，“藥學上可接受的載體”包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的用于配制藥物組合物的任何標準的藥學上可接受的載體。因此，可在藥學上可接受的稀釋劑中將活化的NK細胞配制為制劑，所述稀釋劑為例如鹽水，磷酸鹽緩沖液(PBS)，含水乙醇， 或葡萄糖、甘露醇、右旋糖酐、丙二醇、油(例如，植物油，動物油，合成的油等)、微晶纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸鈣、明膠、聚山梨糖醇80等的溶液， 或在合適的賦形劑中被配制為固體制劑。藥物組合物將通常還酌情包含一種或多種緩沖劑(例如，中性的緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖液)，糖類(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐)，甘露醇，蛋白質(zhì)，多肽或氨基酸 (例如甘氨酸)，抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉、丁羥甲苯、丁羥茴醚等)，抑菌劑， 螯合劑(例如EDTA或谷胱甘肽)，使得制劑與接受者的血液等張、低滲或微弱高滲的溶質(zhì)， 懸浮劑，增稠劑，防腐劑，調(diào)味劑，甜味劑，和著色化合物。雖然所述組合物中可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何合適的載體，載體的類型通常將根據(jù)施用模式而變化。治療組合物可為了任何合適的施用方式而配制，所述施用方式包括例如口服施用、經(jīng)鼻施用、粘膜施用、直腸施用、陰道施用、表面施用、靜脈內(nèi)施用、 腹膜內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、皮下施用和肌內(nèi)施用。對于腸胃外施用，所述組合物可被制備而用于作為含有藥學載體的生理學上可接受的稀釋劑中的、可注射劑量的物質(zhì)溶液或懸浮液施用，所述藥學載體可以是無菌的液體，例如無菌無致熱原水，油，鹽水，甘油，聚乙二醇或乙醇。此外，組合物中可存在輔助性物質(zhì)， 例如濕潤劑或乳化劑、表面活性劑、PH緩沖物質(zhì)等。藥物組合物的其它組分是石油、動物、 植物或合成來源的，例如花生油、豆油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯的非水性溶液。本申請中所描述的藥物組合物可以單位劑量或多劑量容器呈遞，例如密封的輸注袋、安瓿瓶或小瓶。此類容器通常被密封以保存制劑的無菌性和穩(wěn)定性直至使用。通常，如上文所示，制劑可作為油性或水性媒介中的懸浮液、溶液或乳劑而被保存。備選地，藥物組合物可被保存在冷凍干燥的條件下，僅要求在即將使用之前加入無菌液體載體。在優(yōu)選的實施方式中，所提供的藥物組合物包含冷凍保存在合適的冷凍保存介質(zhì)中的活化的NK細胞，然后可將其融化并按照需要制備用于向患者施用。施用于宿主的量將根據(jù)被施用的是什么、施用目的(例如預(yù)防或治療)、宿主的狀態(tài)、施用的方式、施用的數(shù)目、施用之間的間隔等而變化。這些可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗確定并且可針對治療性應(yīng)答的程度而進行調(diào)整。在確定適當?shù)膭┝繒r要考慮的因素包括但不限于受試者的尺寸和重量、受試者的年齡和性別、癥狀的嚴重性、疾病的階段、遞送試劑的方法、試劑的半衰期和試劑的效力。要考慮的疾病階段包括疾病是急性的還是慢性的、復(fù)發(fā)或緩解時期以及疾病的進行性。對于治療有效量確定施用的劑量和次數(shù)在本領(lǐng)域普通人員的技能范圍內(nèi)。例如， 可由細胞培養(yǎng)或其它體外測定來估算起初的有效劑量。然后可在動物模型中配制劑量以產(chǎn)生循環(huán)濃度或組織濃度，包括如由細胞培養(yǎng)測定所確定的IC5tlt5此外，一般通過細胞培養(yǎng)測定和/或使用實驗動物來確定毒性和治療效力，通常是通過測定LD5tl(至50%測試群體的致死劑量)和ED5tl(在50%的測試群體中的治療有效性)。在標準的參考作品中(例如 Goodman & Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Ed. (Hardman，J. G. et al.，eds.)McGraw-Hill，New York, N. Y. (2001)) 找到了指引。對于本發(fā)明的目的，根據(jù)被治療的病況和藥物組合物的形式而選擇施用方法?？梢愿鞣N方式進行治療性化合物的施用，所述方式包括但不限于皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、以及可能地直接注射到特定的器官(例如脾或骨髓)，雖然優(yōu)選的是全身性施用。藥物組合物的施用可通過單一途徑或同時通過數(shù)個途徑。所述組合物可每天一次、每天幾次或數(shù)次或甚至每天多次被施用，這特別取決于被治療的適應(yīng)癥和主治醫(yī)師的判斷。在優(yōu)選的實施方式中，所述細胞在保存后立即被施用。在用組合物進行治療之前，患者可接受一些預(yù)處理，例如，使腫瘤縮小體積 (de-bulk)和/或免疫抑制患者。這可例如通過化學療法實現(xiàn)。有可能在診斷時從患者中獲得原發(fā)性腫瘤細胞并且冷凍保存這些作為可存活的單細胞懸浮物。因此，有可能針對患者的胚細胞(blasts)體外測試根據(jù)本發(fā)明的組合物。 這可在著手實施治療方案之前進行，以估量方法的適合性。也可調(diào)查體外研究的結(jié)果與對治療的相應(yīng)臨床應(yīng)答的關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的藥物組合物可被用于醫(yī)藥中，例如，用于治療或預(yù)防疾病(例如癌癥)的藥物中。在用所述組合物進行治療之前，患者可接受一些預(yù)處理，例如通過化學療法來例如使癌癥縮小體積(de-bulk)和/或免疫抑制患者。
此外，在不存在活化劑時，被制備而用于施用的活化的NK細胞可用于制備藥物， 所述藥物用于治療此類疾病。疾病本發(fā)明還基于下述出乎意料的發(fā)現(xiàn)由本申請中所公開的活化劑(例如 CD15+LAK-抗性腫瘤細胞)所活化的外源NK細胞可賦予內(nèi)源性NK細胞類似的細胞裂解活性。因此，本申請還描述了刺激有需要的患者中內(nèi)源性NK細胞活性的方法，所述方法包括向所述患者施用之前經(jīng)活化的NK細胞群，所述NK細胞群即使保存仍顯示出持久和延長的抗腫瘤活性，并且有利地，無需用共施用活化劑本身來進行再活化，所述活化劑升高潛在的毒性和/或免疫原性問題。在優(yōu)選的實施方式中，活化的NK細胞為CD69+和/或CD25+，且更優(yōu)選地還是⑶15+和⑶16低的。在一個實施方式中，內(nèi)源性NK細胞活性是抗腫瘤活性。在另一個實施方式中，細胞裂解活性被賦予攜帶腫瘤的宿主中的內(nèi)源性NK細胞。在另一系列的實施方式中，細胞裂解活性在腫瘤細胞(包括腫瘤細胞片段)的存在下被賦予內(nèi)源性NK細胞。此類腫瘤細胞 (包括腫瘤細胞片段)可源自原發(fā)性腫瘤、轉(zhuǎn)移、或來自離體來源。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認可，可使用如本申請中所描述的經(jīng)保存的群體以及刺激內(nèi)源性NK細胞活性的方法來治療或預(yù)防疾病或醫(yī)學病況，特別是癌癥。有大約200種不同的癌癥類型。癌癥類型的列表是公知的并可獲得的(例如，見癌癥在線資源協(xié)會的網(wǎng)址或癌癥研究UK的網(wǎng)址)。一些更為常見的癌癥包括白血病(急性和慢性的)、膀胱癌、骨癌(骨肉瘤)、腸 (結(jié)腸直腸癌)、腦癌、乳腺癌、宮頸癌、食管癌、霍奇金氏淋巴瘤、腎癌、肝癌、肺癌、間皮瘤、 多發(fā)性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、陰莖癌、前列腺癌、皮膚癌(黑色素瘤和非黑色素瘤)、軟組織癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌和子宮內(nèi)膜癌。特別地，本申請中所公開的組合物可被用于治療NK細胞可接觸到的任何癌癥。在一個實施方式中，所述癌癥可以是血液惡性腫瘤，例如白血病(AML)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；淋巴瘤。骨髓瘤是不可治愈且致命的惡性腫瘤。有文件記載了在體外抵抗骨髓瘤漿細胞的NK活性，并且已顯示抗自體骨髓瘤細胞的增強的NK活性與對用薩力多胺衍生物進行的治療的應(yīng)答相關(guān)。骨髓瘤患者通常足夠年輕和健康以進行自體血液干細胞移植并且可單獨地、或在自體血液干細胞移植之后容易地進行侵入性更小的程序(例如由本發(fā)明所提供的程序)。移植后淋巴增殖疾病(PTLD)是固體器官移植后嚴重的且相對常見的并發(fā)癥，T 細胞免疫療法目前在實驗中有良好的成功但是極其昂貴且技術(shù)上是困難的，因而其應(yīng)用有限。使用根據(jù)本發(fā)明的療法活化的NK細胞的療法在此組患者中將是簡單和安全的。此外，所述組合物可被用于治療固體腫瘤，例如乳腺癌。所述程序特別適于治療“NK抗性”腫瘤。正常的、非⑶15+LAK-抗性腫瘤細胞刺激的NK細胞可自發(fā)地裂解一些人腫瘤，但是許多其它的腫瘤是NK抗性的。因此，如本申請中所使用的，“NK抗性”是指對于正常的、非CD15+LAK-抗性腫瘤細胞刺激的NK細胞的裂解有抗性的腫瘤細胞。如上文中所解釋的，通過在靶細胞表面上表達特定的MHC I類分子(特別是
18HLA-C)而控制對NK介導(dǎo)的裂解的抑制。關(guān)于NK細胞識別，有兩組不同的HLA-C等位基因。 一些腫瘤表達兩種類型的HLA-C等位基因，這被認為使得它們對于NK介導(dǎo)的裂解有抗性。 因此，“NK抗性”細胞可表達兩組I類等位基因。一些源自白血病/淋巴瘤的細胞系(例如 Raji和Daudi)表達兩類HLA-C等位基因，使得它們是體內(nèi)NK抗性腫瘤細胞的有用模型。被施以如本申請中所公開的藥物組合物的患者也可用其它的治療劑來進行治療。 優(yōu)選的治療劑包括增強NK活性的試劑。此類增強劑是本領(lǐng)域中熟知的。此類增強劑的非限制性實例包括薩力多胺及其免疫調(diào)節(jié)(IMid)類似物(例如，來那度胺，雷利米得，CC-5013， CC-4047，ACTIMID ；見例如，Wu et al. (2008) Cl in. Cancer Res. 14 :4650-7)，細胞因子(例如，IL-2，IL-12，IL-15，IL-18，CCL5)等。所述的其它治療劑可與如本申請中所公開的經(jīng)活化以顯示持久活性的NK細胞同時或順次施用。現(xiàn)在將通過下面的非限制性實施例來進一步描述本發(fā)明，所述實施例進一步闡釋了本發(fā)明而不意在(也不應(yīng)被解釋為)限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1 白血病細胞上的Lewis X(⑶15)表達介導(dǎo)持續(xù)的天然殺傷細胞引發(fā)和腫瘤裂解NK細胞的CTV-1，SEM和MV-411引發(fā)引起持續(xù)且持久的活化狀態(tài)，其中活化的NK 細胞甚至在保存后仍保持裂解NK抗性腫瘤的能力。此類在保存后被制備而用于施用的活化的NK細胞提供容易的臨床應(yīng)用，因為此類制備不要求暴露于活化劑或用活化劑進行再活化。實施例1.1材料和方法實施例1. 1. 1 細胞系和細胞培養(yǎng)試劑所有的細胞系均獲自DSMZ，Braunsctiweig，德國或者來自LGC，倫敦，UK并按照保藏庫所推薦的進行培養(yǎng)。CTV-I系原本被報道是骨髓來源的，但是最近被顯示是表達CD15 的、具有骨髓特征的急性幼成淋巴細胞性白血病(ALL)。SEM系是具有W4 ;11)移位的另一個CD15+ALL系。MV-411是雙表型的CD15+W4 ；11)急性髓單核細胞性白血病。M0LT-16和PF-382都是CD15-ve ALL系。RAJI系是源自非霍奇金氏淋巴瘤的 B細胞系并且是原型NK抗性系。K562細胞是原型NK-敏感性的并且源自成紅血細胞樣 (erythroblastoid)白血病。DU145細胞源自前列腺腫瘤上皮細胞，其作為粘附細胞被培養(yǎng)并通過在匯聚時進行胰蛋白酶消化而被收獲。RPMI82^細胞源自具有骨髓瘤的患者。ARH77 細胞源自患有漿細胞白血病的患者的外周血。將所有的細胞培養(yǎng)物都維持在由補充了 10% FCS、青霉素(lOOi.u.)和鏈霉素 (lOOi.u.)的 RPMI 1640 組成的完全培養(yǎng)基(CM)中(都由 Invitrogen, Paisley, Scotland 供應(yīng))。所有的細胞都保持在連續(xù)懸浮培養(yǎng)物中并在使用刺激劑或靶細胞之前在指數(shù)生長期收獲。實施例1.1. 2:抗體抗CD15抗體(克隆MEM 158)、抗CD49f抗體(克隆4F10)和抗CD56抗體(克隆 NCAM 16.2)是從 krotec UK Ltd (Oxford, UK)獲得的。
實施例1. 1. 3 免疫表型為了分析細胞表面抗原表達，在室溫下用綴合了熒光染料的單克隆抗體、以制造商推薦的濃度孵育100 μ 1 HBSS中的IO5細胞15min。清洗之后，通過流式細胞計數(shù) (FACSCalibur with CellQuest software,Becton Dickinson，UK)分析細胞。在從每個樣品中獲取至少10，000個細胞之前，使用向前和側(cè)面的光散射特征來門控(gate)可存活的淋巴細胞群。所有綴合了熒光染料的mAbs都購自BDIS(Cowley，UK)或Beckman Coulter (High Wycombe, UK)。實施例1. 1. 4 人NK細胞的分離和腫瘤特異性活化所有的樣品都是有知情同意而獲得的而用于對白血病的先天免疫的研究。從正常的健康志愿者供體獲得新鮮的肝素化的外周血樣品。外周血單核細胞(PBMCs)是通過不連續(xù)密度梯度分離(Lymphopr印，Nycomed, UK)從靜脈血分離的并以IXlO6細胞/mL的濃度懸浮在CM中。在37°C和5% CO2的氣氛下，以2 1的刺激劑應(yīng)答劑比例用經(jīng)輻射的 (30Gy)刺激劑細胞孵育PBMC至多20小時。通過用CD56 Multisort試劑盒(Miltenyi Biotec，德國)進行直接免疫磁性分離，伴有或不伴有隨后用CD3 FITC和抗FITC珠進行的耗竭，而從PBMC或PBMC:刺激劑細胞共培養(yǎng)物純化⑶56+或^56+^3—細胞。所有所選擇的細胞均被證實為> 98%⑶56+并且，當進行了⑶3耗竭時，被證實為< 3%⑶3+且重懸于CM中。用抗⑶56微珠進行的免疫選擇以及隨后的清洗從最終產(chǎn)品中去除了所有可檢測的刺激劑細胞。實施例1. 1. 5 =NK細胞的IL-2活化以IxlO6細胞/mL的密度將新鮮分離的NK細胞懸浮于含有IOOi. u. IL-2 (Invitrogen, Paisley, UK)的 CM 中，并在 37°C下和 5% CO2 的氣氛中孵育 48 小時。實施例1. 1. 6 通過流式細胞計數(shù)分析細胞內(nèi)蛋白磷酸化用綴合了熒光染料的抗⑶3和抗⑶56預(yù)標記經(jīng)純化的NK細胞，以允許當隨后與經(jīng)輻射的刺激劑細胞相混合時，鑒別所述NK細胞。在37°C下，將刺激劑響應(yīng)劑細胞混合物孵育所規(guī)定的時間段并通過加入Cytofix緩沖劑(BDIS，Oxford，且孵育10分鐘而停止NK細胞活化。通過用冰冷的Perm緩沖液III (BDIS，Oxford,UK)進行滲透30分鐘，隨后在染色緩沖液(BDIS，Oxford，UK)中清洗并重懸于相同的緩沖液中。然后在室溫下用對經(jīng)磷酸化的目的蛋白有特異性的抗體孵育樣品30min，清洗兩次并通過流式細胞計數(shù)進行分析(FACS Aria, BDIS, Oxford, UK)。使用“簇分析”來確定表達每種抗原的細胞的百分比， 并且作為單變量“陽性”群體的中值通道log熒光而計算相對熒光強度。實施例1. 1. 7 細胞毒性測定細胞毒性測定中的靶細胞包括NK抗性RAJI細胞系和NK-敏感性K562細胞系 (從LGC細胞庫獲得)。從懸浮培養(yǎng)物中回收靶細胞并在HBSS中清洗，然后以^lO6Ail的濃度重懸于1. Oml的PHK-沈標記稀釋液中。將4 μ 1的ΡΚΗ46等份加入1. Oml標記稀釋液中，然后在室溫下將其加至細胞懸浮液2分鐘。通過加入1. Oml胎牛血清Imin而終止標記反應(yīng)。最后在CM中將經(jīng)標記的細胞清洗兩次并以106/ml重懸于CM中。將100 μ 1 RPMI 1640(10% FCS)中的五萬個PKH-沈標記的靶細胞加入400 μ 1效應(yīng)子細胞中(Ε T比率為1 1或5 1，如圖標中所示，因為這些是不依靠離體繁殖而可在臨床治療設(shè)置中獲得的比率)并以200Χ g沉淀1分鐘。頁利用4-hr細胞毒性測定，于37°C、在一式三份的樣品中測量細胞毒性。在孵育階段之后，將細胞重懸于PBS中的To-Pro-3碘化物溶液中(1 μ M) (Invitrogen，Paisely Scotland)并通過流式細胞計數(shù)進行分析。在對紅色熒光進行電子門控之后，以IOM通道分辨率獲得了至少IXlO4個靶細胞，并且確定了來自一式三份的樣品的To-Pro碘化物陽性細胞的平均比例。由不存在效應(yīng)子細胞而孵育的細胞確定了背景靶細胞死亡。細胞介導(dǎo)的細胞毒性被報道為由三個樣品平均而得到的相對于背景細胞死亡的殺傷百分比(特異性裂解)平均值(％測試中的細胞裂解自發(fā)裂解)。在這些實驗中觀察到了少于5%的靶細胞自發(fā)裂解。在一些實驗中，顛倒了標記策略，其中用PKH16標記效應(yīng)子細胞，并且將細胞裂解分析限于PKH-ve部分。這種顛倒證實了起初的發(fā)現(xiàn)不是由于細胞標記的假相。實施例1. 1. 8 產(chǎn)生CD15-轉(zhuǎn)導(dǎo)的RAJI細胞使用正向引物5' ATG GGG GCA CCG TGG GGC TCG CCG AC3' (SEQ ID NO 1)和 5' AGT GGC GAG CTT GGT CGA CCG GTT 3' (SEQ ID NO :2)，從淋巴細胞 cDNA(Dr. Steve Hart的禮物)中將編碼人α 1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV(FUT4)的cDNA(其促成⑶15的表達(Nakayama, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 :16100-106))平末端 PCR 克隆到 pLenti6/ V5 (Invitrogen, Paisley, UK)中并通過測序進行了驗證以給出pLenti6/CD15。使用磷酸鈣、以3. 5 1.75 5 的比例用 pCMVDR8. 91 (Zufferey et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15 :871-75)pVSV-G(Chan, et al. (2006)Mol. Therapy 11:120-31)和 pLenti6/CD15進行轉(zhuǎn)導(dǎo)后，由四31~細胞產(chǎn)生了 VSV-G假型病毒。轉(zhuǎn)染后M小時用不含血清的培養(yǎng)基替代補充了血清的培養(yǎng)基，并且48小時后通過鈣沉淀收獲和濃縮病毒。將病毒上清液濃縮為粒狀沉淀并重懸于Iml的緩沖液(IOOmM EDTA, 50mM NaCl, 0. 2% BSA, pH 6. 5) 中。以^clO5Pfu培養(yǎng)IO6RAJI細胞6小時，然后將其匯集、清洗并以5X105/ml在燒瓶中重懸于新鮮的RPMI+10% FCS中。轉(zhuǎn)染后4 通過流式細胞計數(shù)評估⑶15表達。實施例1. 1. 9 統(tǒng)計學分析就歸一性(高斯分布)以及通過F-檢驗就相當?shù)姆讲?使用GraphPad Prism v4.0)來評估比較統(tǒng)計學分析的數(shù)據(jù)。通過Mudent t_檢驗就其平均值的顯著差異測試具有相等方差的分布。通過Snedecor的經(jīng)修飾的t-檢驗來測試具有顯著不同的方差的那些，所述Snedecor的經(jīng)修飾的t_檢驗補償不等的方差。沒有數(shù)據(jù)組是非高斯的。實施例1.2:結(jié)果對人NK介導(dǎo)的腫瘤細胞的裂解的調(diào)控涉及NK和腫瘤細胞上的繁多細胞表面受體，這提供了抑制性和活化的信號。當靶細胞上由配體提供的活化信號的組合克服任何抑制性信號時，發(fā)生裂解。抑制性分子的主要配體似乎是HLAI類抗原，并且已顯示腫瘤對NK 介導(dǎo)的裂解的敏感性與這些分子的表達程度相關(guān)(CiCCOne，et al. (1992) J. Exp. Med. 176 963-71)。相反，B淋巴瘤細胞系RAJI對于NK介導(dǎo)的裂解的非敏感性被歸因于其表達NK抑制性分子的所有已知類別的配體。盡管如此，RAJI細胞易受由IL-2或IL-15活化的NK細胞的裂解，這表示如果可以克服抑制性信號，則NK活性的觸發(fā)配體以足夠的水平存在。Bryceson和同事^)06)使用了鼠類肥大細胞瘤細胞系P815來在反向細胞毒性測定中測試NK活化配體，其中使用靜止的、新鮮分離的人NK細胞，而非NK系或克隆(Blood 107 :159-66)。這些數(shù)據(jù)證實了缺乏通過HLA的NK抑制不足以觸發(fā)裂解(Warren et al. (1996) J. Immunol. 156 =2866-73) ；P815細胞不表達HLA，但是對于人NK裂解有抗性。 此外，除了 CD16，其它已知的NK觸發(fā)配體要求至少一個共連接事件來觸發(fā)細胞因子分泌和 /或裂解。小組沒有研究所需的兩種信號需要被同時遞送還是可以順次提供。之前的工作顯示出也對由IL-2活化的NK細胞的裂解有抗性的NK抗性細胞系能夠引發(fā)靜止的NK細胞來裂解 RAJI 細胞(North, et al. (2007) J. Immunol. 178 :85-94)。NK細胞是人對抗腫瘤生成的防御的及其重要的部分并且似乎在健康個體內(nèi)進行著的腫瘤監(jiān)控中起關(guān)鍵作用(Imai，et al. (2000)Lancet 365:1795-99)。它們在種系發(fā)生方面是高度保守的，這在于表達穿孔素、顆粒酶以及甚至⑶16、⑶56、⑶57和⑶158b的細胞毒性細胞已在無脊椎動物的血腔中被報導(dǎo)(Lin, et al. (2001) J. Exp. Zoology 290 741-50 ；de Eguileor,et al (2002) Curr. Pharmaceutical Design 8:99-110)；所述生物體不表達作為抑制性分子(例如CD158b)的配體的HLA分子。這表示NK細胞的最根本的控制機制可能不是通過自身MHC的抑制，而可能是通過要求類似于高等脊椎動物中T細胞的共刺激和觸發(fā)的順次或同時的活化信號。來自Bryceson等人Q006)和North等人Q007) 的數(shù)據(jù)支持這一假設(shè)，且此處所呈現(xiàn)的結(jié)果首次表明了配體的表達在裂解的起始中對于腫瘤細胞上NK共刺激的關(guān)鍵重要性。通過靜止的NK細胞對NK敏感性K562成紅血細胞樣白血病細胞進行NK介導(dǎo)的裂解需要與⑶15締合的⑶2L，但是其本身不足以引發(fā)NK細胞活性，因為表達⑶15的靜止的正常人單核細胞不能刺激NK活性。因此，必須在共刺激的存在下向靜止的NK細胞遞送一些形式的腫瘤限制的信號，以引發(fā)其裂解呈遞適當?shù)挠|發(fā)配體的腫瘤細胞。之前已提出了許多用于提供腫瘤限制的信號的候選分子，包括熱激蛋白、凝集素和復(fù)合糖類，但是關(guān)鍵的配體仍然難以捉摸。在對于這些配體的進一步剖析中，CTV-I細胞似乎是有價值的工具，因為清楚的是僅僅是缺乏抑制性受體的配體和存在合適的粘附分子對于腫瘤細胞的NK細胞細胞毒性是不充分的。移除引發(fā)腫瘤細胞系之后，在NK細胞中維持被引發(fā)的狀態(tài)是獨特的發(fā)現(xiàn)，這與要求持續(xù)的細胞因子暴露以產(chǎn)生和維持淋巴因子活化的NK細胞形成鮮明的對比。在此表明了，可通過用相關(guān)的NK抗性腫瘤細胞進行短期的共孵育來引發(fā)NK細胞，然后可移除所述腫瘤細胞而不影響被引發(fā)的狀態(tài)。這些經(jīng)引發(fā)的NK細胞在冷凍保存和融化之后保持裂解NK 抗性腫瘤的能力，這允許容易地轉(zhuǎn)換至臨床應(yīng)用，因為可遠程制備細胞并在投放前確保質(zhì)量。實施例1. 2. 1 ⑶15+白血病細胞引發(fā)NK抗性腫瘤細胞的裂解以NK抗性CD15+腫瘤細胞(CTV_1、MV_411、SEM)共孵育的靜止的NK細胞裂解RAJI 細胞(圖1A)并且能夠裂解不同種系的各種NK抗性腫瘤細胞，這包括RPMI8226，ARH77和 DU145(圖1B)。相反，靜止的NK細胞或以CD15_ve細胞(M0LT-16、PF-382)孵育的NK細胞不能夠裂解RAJI細胞(圖1A)。此外，靜止的NK細胞不能夠裂解ARH77和DU145細胞 (圖IB)。CTV-I活化的NK細胞也能夠裂解同種異基因性原發(fā)腫瘤細胞，所述原發(fā)性腫瘤細胞分離自從患有乳腺癌的患者切除的組織和來自患有卵巢癌的患者的腹水(數(shù)據(jù)未顯示； North et al. (2007)J. Immunol. 178 :85-94)。實施例1. 2. 2 抗CD15阻礙NK引發(fā)
假設(shè)的是靜止的NK細胞需要兩種信號來起始裂解，并且這些信號可順次被遞送， 因為NK:RAJI共培養(yǎng)物中不存在引發(fā)腫瘤細胞。用58種不同的單克隆抗體就潛在的NK活化配體篩選了 CTV-I細胞(數(shù)據(jù)未顯示)并且鑒別出了 5種候選分子⑶58，⑶48，⑶38， ⑶15和⑶Ila/⑶18復(fù)合物。其中僅⑶15在CTV-I共孵育后顯著地(ρ < 0. 01)抑制NK細胞的活化(圖2Α)，如通過⑶25和⑶69的表達所測量的。在對NK細胞上的引發(fā)信號受體的搜索中，將CD2鑒別為了潛在的候選者，雖然阻礙引發(fā)細胞上其共同的配體⑶58沒有顯著地抑制裂解。然而，超過十年之前，Warren和同事(1996)描述了 Lewisx的⑶15表位之內(nèi)的部分，其是⑶2的配體并且存在于原型NK靶細胞Κ562上(J. Immunol. 156 =2866-73)。此外，他們發(fā)現(xiàn)NK介導(dǎo)的裂解需要其在K562上的表達；不存在HLA I類的表達不足以觸發(fā)裂解。CD2是靜止的NK細胞上已知的共刺激性引發(fā)分子。NK-引發(fā)細胞系CTV-I表達高水平的⑶15，并且用CTV-I共孵育NK細胞導(dǎo)致 ⑶15被轉(zhuǎn)移到NK細胞上(數(shù)據(jù)未顯示)，這類似于已被報導(dǎo)的MICA的轉(zhuǎn)移(McCarm，et al. (2007) J. Immunol. 178 :3418- )，這表示其為NK:CTV-1免疫突觸的重要組成。在細胞毒性測定中測試了抗CD15阻礙NK引發(fā)的能力。在通過與CTV-I接觸的引發(fā)之后，原型 NK抗性RAJI細胞對于NK介導(dǎo)的裂解是敏感的。在存在或不存在阻礙性抗體的情況下，用 CTV-I共孵育靜止的人NK細胞20小時，并在4小時的殺傷測定中進行針對RAJI細胞靶標的測試。使用了兩種抗 CD15mAb，克隆 LeuMl (BDIS，Oxford, UK)和克隆 MEM158 (Serotec， Oxford, UK)，前者被報導(dǎo)結(jié)合CD15內(nèi)排除CD2-L位點的位點(Warren, et al. (1996) J. Immunol. 156 =2866-73)。抗CD15克隆MEM 158顯著降低NK活性(圖2b)，的確，降低至低于陽性抑制性對照抗 CD49f(Lowdell，et al. (1994)Exp. Hematol. 23 1530-34)的水平。 極其有趣地注意到，裂解原型NK敏感性細胞系K562也需要CD15-NK相互作用。K562細胞表達高水平的⑶15，并且用MEM158阻礙此抗原基本上抑制了通過靜止的NK細胞的裂解(圖 3)，這進一步支持了其在NK細胞引發(fā)中的中心作用，并證實了單獨的“失去自我”不足以誘導(dǎo)通過靜止的人NK細胞的裂解。實施例1.2.3 將⑶15轉(zhuǎn)導(dǎo)到NK抗性細胞中提供了引發(fā)信號通過用FUT4的cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)RAJI細胞實現(xiàn)了對CD15的作用的證實。將FUT4轉(zhuǎn)導(dǎo)到RAJI細胞中在48小時內(nèi)引起了 CD15的表達，并使得細胞易受靜止的NK細胞的裂解(圖 3)。這通過在細胞毒性測定過程中加入飽和濃度的抗⑶15而被有效地阻礙(圖幻。加入抗⑶2mAbs既未阻礙也未增強效果，表示這些mAbs未結(jié)合適當?shù)谋砦?數(shù)據(jù)未顯示)。實施例1. 2. 4 通過⑶15相關(guān)配體的⑶2連接通過LAT-STAT信號傳導(dǎo)級聯(lián)而誘導(dǎo)、干擾素的合成通過抗體阻礙實驗以及表明⑶3 ζ的磷酸化提供了支持⑶15參與⑶2的連接這一假設(shè)的證據(jù)。與T細胞上的⑶2相反，NK細胞上的⑶2不是組成型地與⑶3 ζ締合。 在 NK 細胞中，胞質(zhì) CD3 ζ 結(jié)合 CD16(Moingeon，et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 89 1492-96)，這大概解釋了 CD16活化和觸發(fā)靜止的人NK細胞的獨特能力(Bryceson，et al. (2006)，見上)。將靜止的NK與CTV-I相綴合引起細胞外CD16的快速脫落(圖4 ;North， et al. (2007)，見上)并且假設(shè)的是這可促進胞質(zhì)⑶16/⑶3 ζ復(fù)合物與⑶2的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相締合的相互作用(Moingeon, et al. (1992)，見上)。如圖5A中所顯示的，將CTV-I細胞與靜止的NK細胞共孵育誘導(dǎo)了 CD3 ζ的快速磷酸化。已顯示CD2連接引起LAT的磷酸化(Inoue，et al. (2000)Eur. J. Immunol. 32 :2188-98)，并且對 LAT 和 ZAP-70 的細胞內(nèi)磷酸化的流式細胞計數(shù)分析顯示了在不存在ZAP-70磷酸化時LAT的快速磷酸化(圖5B)，這證實了在CTV-I細胞上、在⑶15內(nèi)通過⑶2L連接⑶2。LAT的磷酸化被認為是通過ZAP70 的磷酸化，但是在CTV-I共培養(yǎng)之后或用可得的抗CD2抗體交聯(lián)之后，并不能顯示一貫的 pZAP70(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，T細胞上CD3的交聯(lián)引起快速和持續(xù)的pZAP70(數(shù)據(jù)未顯示)。這表示NK細胞中⑶2介導(dǎo)的LAT磷酸化可能不依賴于pZAP70。⑶2信號傳導(dǎo)的已知結(jié)果之一是STAT5的磷酸化，其可引起NK細胞中干擾素、的合成(Gonsky，et al. (2004) J. Immunol. 173 :6241-47)。的確，使靜止的 NK 細胞與 CTV-I 細胞裂解物共孵育，在5分鐘內(nèi)可檢測到pSTAT5并且持續(xù)至少20分鐘(圖5C)，并且這與在4h之內(nèi)CD25(圖6A)和CD69(圖6C)的上調(diào)、及干擾素Y的增加的合成(圖6F)相聯(lián)合。用SEM或MV4-11細胞活化NK細胞也引起通過活化的NK細胞快速上調(diào)細胞表面表達的⑶25和⑶69 (數(shù)據(jù)未顯示)。由靜止的NK細胞對NK-敏感性成紅血細胞樣白血病K562 進行NK-介導(dǎo)的裂解需要CD15-締合的CD2L，但其本身不足以引發(fā)NK細胞活性，因為表達 CD15的靜止的正常人單核細胞不能夠刺激NK活性。因此，必須在共刺激的存在下向靜止的 NK細胞遞送一些形式的腫瘤限制的信號以引發(fā)它們裂解呈遞適當?shù)挠|發(fā)配體的腫瘤細胞。 之前已提出了許多候選分子，這包括熱激蛋白、凝集素和復(fù)合物糖類。在對于這些配體的進一步剖析中，CTV-I細胞似乎是有價值的工具，因為清楚的是僅僅是缺乏抑制性受體的配體對于腫瘤細胞的NK細胞細胞毒性是不充分的。實施例1. 2. 5 ⑶2-介導(dǎo)的和IL-2介導(dǎo)的靜止的NK細胞的活化通過不同的路徑操控且具有不同的生理學結(jié)果與由CD2連接活化的CD3 ζ -LAT-Stat路徑相反，已知IL-2通過MKK1/1/ERK活化 NK細胞(Yu, et al. (2000) J. Immunol. 164 :6244-51)，并且CD69的上調(diào)和干擾素合成花費至少48小時(分別為圖6D和圖6G)。與通過CTV-I的⑶2連接所誘導(dǎo)的相比，在IL-2刺激之后⑶25表達的上調(diào)也顯著更慢，并且活化NK細胞的比例一貫性地更低(圖6A)。實施例1. 2. 6 在去除引發(fā)信號之后，CD2介導(dǎo)的NK細胞引發(fā)是穩(wěn)定的在去除IL-2之后，IL-2活化的NK細胞快速回復(fù)到非活化的狀態(tài)和/或在保存后喪失活性，特別是在不存在IL-2時。以2 1的額定CTV-I NK細胞比率，用CTV-I細胞的裂解物刺激來自10個正常供體的淋巴細胞20小時。然后通過用抗⑶56微珠(Miltenyi Biotec, Oxford, UK)進行的免疫磁性選擇直接分離NK細胞。已顯示，經(jīng)引發(fā)的NK細胞制備物不含CTV-I污染(圖7A和7B)。與在氮氣中冷凍保存了 14天的匹配的細胞相比，由新鮮分離的、腫瘤引發(fā)的NK細胞介導(dǎo)的RAJI細胞裂解的程度沒有顯著不同(圖7C)。實施例2 由腫瘤細胞系引發(fā)的人NK細胞群可在保存后立即被制備用于施用并且被安全地移植到患有AML的單倍體相同患者并引起可表明的GvL和長期NK嵌合開始了在患有AML的患者中的臨床試驗，所述患者在完全緩解(CR)或具有少于 25%的胚細胞的部分緩解(PR)中，但不是使用同胞或備選供體的常規(guī)移植的候選對象。實施例2.1:材料和方法實施例2. 1. 1 分離和活化人NK細胞通過以2 1的額定刺激劑靶標比率用CTV-I腫瘤細胞的裂解物過夜共孵育CD56+NK細胞(CliniMACS，使用抗CD56微珠)，由來自單倍體相同家族供體的非流通外周血的單一成分輸血產(chǎn)生了顯示出持久活化狀態(tài)的NK細胞。然后通過密度梯度分離和清洗從裂解物中純化所述NK細胞。產(chǎn)品投放標準包括無菌性、規(guī)定劑量的5%之內(nèi)的CD56+/ ⑶3-NK細胞劑量和< 104/kg的總⑶3+/⑶56—T細胞劑量。實施例2. 1. 2 冷凍介質(zhì)的制備制備了活化的NK細胞的單一劑量等份，將其冷凍保存并儲存在臍帶血儲存裝置中直至使用。將單一劑量等份(例如，劑量1 =IXlO6⑶56+NK細胞/kg)冷凍保存在DMS0/HSA 混合物中。通過將600mL轉(zhuǎn)移包的尖刺和兩個空氣入口插入人白蛋白血清(HSA)4.5%溶 it (ZENALB 4. 5 ；Bio Products Laboratory, Hertfordshire, UK)的)的^ ! 中胃備DMS0/HSA混合物。在允許150mL的HSA 4. 5%進入所述600mL轉(zhuǎn)移包中之后，將轉(zhuǎn)移包的線夾住、熱封三次并在中間的密封處斷開。將調(diào)速型偶合器適配器裝置(coupler Ieur adaptor set)的尖刺與含有HSA 4. 5%的轉(zhuǎn)移包的口及三路活塞相連之后，通過置于預(yù)冷的冰包上而冷卻含有HSA 4. 5%的轉(zhuǎn)移包。使用無菌技術(shù)，使用與50mL注射器相連的16G 針頭來吸出37. 5mL DMSO0去除所述16G針頭后，將所述50mL注射器連至三路活塞，所述三路活塞與含有HSA 4. 5%的轉(zhuǎn)移包相連。將37. 5mL DMSO轉(zhuǎn)移至含有HSA 4. 5%的轉(zhuǎn)移包， 以獲得含有終濃度為20%的DMS0/HSA的冷凍介質(zhì)。在冷凍保存程序中，20% DMS0/HSA冷凍介質(zhì)在預(yù)冷的冰包上保持冷卻。實施例2. 1. 3 活化的NK細胞的冷凍保存將如實施例2. 1. 2中所制備的冷凍介質(zhì)加入所需劑量的NK細胞中，以使細胞體積為17mL，并將NK劑量/冷凍介質(zhì)混合物轉(zhuǎn)移到一個或多個冷凍細胞袋中(目錄號 200-074-401 ；Miltenyi Biotec，Surrey，UK)。將冷凍細胞歧管組 4S-4M60 (Origen，Austin TX)的尖刺插入DMS0/HSA制備物袋中，而將冷凍細胞歧管組的調(diào)速適配器與含有NK細胞的冷凍細胞袋相連。將等量的DMS0/HSA冷凍介質(zhì)加入NK冷凍細胞袋中并輕柔地混合，從冷凍細胞袋中去除空氣。使用與5mL注射器相連的19G針頭來吸出4. 3mL的細胞懸浮液以用于細胞計數(shù)、細胞存活和無菌研究。將冷凍細胞袋雙重裝袋并置于Planer Kryo-560-16 控速冷凍器(Cryo Solutions;荷蘭)中，用于根據(jù)冷凍程序冷卻。大約65分鐘的冷凍程序?qū)⒓毎?°C保持5分鐘，然后以-1°C /分鐘的速度將細胞冷卻至-30°C，此后以-2°C / 分鐘的速度冷卻至_100°C。在完成冷凍程序之后，將冷凍保存的NK細胞置于液氮存儲杜瓦瓶中-135°C的氣象液氮中。實施例2. 1. 5 患者特征在此描述的是以第一劑量水平(IxlO6NK細胞/kg)處理的六名患者的特征?；颊?是56歲大的女性，其呈現(xiàn)出AML。用化學療法和吉妥珠單抗奧唑米星將所述患者置于完全緩解(CR)中。發(fā)生了第一次復(fù)發(fā)并用化學療法將患者置于CR2 中，在不成功地搜索同種異基因性供體后，使用就骨髓移植調(diào)節(jié)的白消安IV/環(huán)磷酰胺使所述患者接受了自體移植?；颊唠S后復(fù)發(fā)并被介紹到這一臨床實驗中。使用高劑量阿糖孢苷(cytaribine)進行的救助療法將患者置于CR3中。患者1接受了來自她女兒的IO6個活化的NK細胞/kg?；颊?是72歲大的男性，其呈現(xiàn)出AML。在用低劑量阿糖孢苷和4個療程的5_氮胞啶進行化學治療之后，患者處于冊，在骨髓抽出物中具有19%的胚細胞。未給予鞏固或救助療法并且他不是骨髓治療的候選者。此患者接受了 IO6個活化的NK細胞/kg。
患者3是52歲大的男性，其被診斷患有AML(t9 :11)。用化學療法將其置于CRl 中，但是在一年之內(nèi)復(fù)發(fā)了。用伊達比星卡鉬和依托泊苷進行的救助療法將其置于形態(tài)學而非細胞遺傳學的CR中。在白消安IV/環(huán)磷酰胺調(diào)節(jié)之后，他接受了 HLA-相同的同胞骨髓治療，但是在八個月之后再次復(fù)發(fā)了。他接受了伊達比星卡鉬和依托泊苷的救助療法并被置于CR3中，然后他接受了來自不同的同胞的IO6個活化的NK/kg。在輸注活化的NK細胞之前，每名患者都經(jīng)調(diào)節(jié)。如下對患者進行調(diào)節(jié)用氟達拉濱05mg/m2/天)進行3天，加上第4天的一份(2Gy)總身體輻射(TBI)。在NK細胞輸注的當天(第0天)，制備經(jīng)冷凍保存的NK細胞用于在患者的床邊施用。簡要地，用液氮相的運送器，在約_135°C至-190°C的溫度下運輸經(jīng)冷凍保存的NK細胞。在設(shè)置為37°C的無菌鹽水的水浴中伴隨輕柔攪動而融化雙重袋裝的NK細胞。在顯示了袋子的完整性之后，移除外部的冷凍細胞袋以通過將注射位點偶合器連接至內(nèi)袋中的口和16G針頭而允許NK細胞轉(zhuǎn)移到注射器中。移除小等份的細胞并將其置于冰上用于輸注之后的細胞計數(shù)。在融化的 10分鐘內(nèi)且不經(jīng)再刺激，通過緩慢推動而由IV施用剩余的NK細胞。就安全性緊密地監(jiān)測患者并通過頻繁的實驗室和臨床評價來進行評估。使用骨髓抽出物(BMA)來評估疾病狀態(tài)，并且周期性地進行專門的研究來評價嵌合性和NK細胞功能。在NK細胞輸注之后6個月時對于各個患者完成了臨床研究。實施例2. 2:結(jié)果沒觀察到輸注的毒性。所有的患者都經(jīng)受了一定程度的骨髓抑制，其要求患者內(nèi)的支持性護理，發(fā)育不全的范圍為3周直至100天。患者1在+16個月時保持在CR中，其具有穩(wěn)定的血液計數(shù)并已回歸到完全活躍的職業(yè)和個人生活中了。患者2實現(xiàn)了并保持在 CR中直至+11個月，其復(fù)發(fā)并用第二次的活化的NK輸注進行了治療?；颊?經(jīng)歷了延長的和嚴重的全血細胞減少癥，這需要CD34-選擇的干細胞拯救，其實現(xiàn)了并保持在CR中直至+11. 5個月。目前，患者3正在進行再誘導(dǎo)化學療法，從而用第二劑活化的NK細胞進行治療。沒有供體T細胞嵌合性時，在所有的患者中都見到了極度延長的NK嵌合性(直至+6 個月)。唯一接受了第二次NK細胞劑量的患者實現(xiàn)了供體NK移植而沒有其它的免疫抑制。表 權(quán)利要求
1.用于直接向有需要的患者施用的藥物組合物，其包含在基本上不含活化劑的、藥學上可接受的介質(zhì)中的之前經(jīng)保存的活化的NK細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中與靜止的NK細胞相比，所述活化的NK細胞過表達 CD69 和 CD25。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述活化的NK細胞為CD15+和CD16 。
4.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的藥物組合物，其中所述保存是冷凍保存。
5.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含對于患者為自體的 NK細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述藥物組合物還包含對于患者為同種異基因性的NK細胞。
7.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含對于患者為同種異基因性的外源NK細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含對于彼此為同種異基因性的外源NK細胞。
9.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的藥物組合物，其中所述活化劑為CD15+LAK-抗性腫瘤細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述腫瘤細胞選自CTV-I細胞、MV4-11細胞、 SEM細胞，其組合，以及其亞系。
11.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的藥物組合物，其中所述NK細胞在保存后且在不存在任何活化劑時顯示出持久的活性。
12.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的藥物組合物，其中所述活化的NK細胞被保存超過12小時。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述活化的NK細胞被保存超過M小時。
14.任意前述權(quán)利要求的藥物組合物，其用于不共施用(無論同時、分別還是順次)活化劑而施用。
15.用于刺激有需要的患者中內(nèi)源性NK細胞活性的方法，所述方法包括1)獲得包含自體和/或同種異基因性NK細胞的外源細胞群，2)用包含CD15+LAK-抗性腫瘤細胞的活化劑活化所述NK細胞，3)在基本上不含活化劑的藥學上可接受的介質(zhì)中制備活化的NK細胞用于施用，和4)向所述患者施用活化的NK細胞而不同時或順次施用活化劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述患者是攜帶腫瘤的患者，并且所述內(nèi)源性NK細胞活性是抗腫瘤活性。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述活化的NK細胞是在活化之后和向所述患者施用之前保存的。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述活化的NK細胞在保存之中和/或之后保持基本上不含活化劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述保存是冷凍保存。
20.根據(jù)權(quán)利要求15-19中任一項的方法，其中所述活化的NK細胞被進一步表征為 CD69+CD25+CD16 CD15+ 的 NK 細胞。
21.活化的NK細胞群，其基本上不含活化劑并用于治療性應(yīng)用而不共施用(無論同時、分別還是順次)活化劑。
22.權(quán)利要求21的細胞群，其是經(jīng)保存的，例如經(jīng)冷凍保存的。
23.權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的細胞群，其中所述細胞具有權(quán)利要求2中或權(quán)利要求2與權(quán)利要求3的組合中所述的特征；和/或所述細胞群包含如權(quán)利要求5-8之一或其組合中所定義的NK細胞；和/或經(jīng)保存的活化的NK細胞可通過使用權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的活化劑而獲得。
24.權(quán)利要求21-23中任一項的細胞群，用于治療癌癥。
25.用于制造可輸注制劑形式的即用藥物的方法，其中所述制劑基本上不含用于活化 NK細胞的試劑，所述方法包括融化基本上不含活化劑的、冷凍保存的活化的NK細胞，所述制劑用于不共施用(無論同時、分別還是順次)活化劑而治療癌癥。
全文摘要
本申請公開了在不存在活化劑時顯示出持久且延長的活性的活化的NK細胞，并且所述細胞在保存后保持其活化的狀態(tài)。向患者施用所述NK細胞的方法不需要共施用活化劑，并且因此，包含所述NK細胞的藥物組合物可保持基本上不含活化劑，例如CD15+LAK_抗性腫瘤細胞。
文檔編號C12N5/0783GK102575230SQ201080035955
公開日2012年7月11日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日
發(fā)明者馬克·洛戴爾 申請人:馬克·洛戴爾