專利名稱：從臍帶血產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的制作方法
從臍帶血產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2009年6月19日提交的美國臨時(shí)申請第61/218，611號(hào)的權(quán)益，其全部內(nèi)容在此援弓丨加入，并用于所有目的。
背景技術(shù)：
利用整合病毒法使多能性因子和癌基因異位表達(dá)足以誘導(dǎo)小鼠和人類成纖維細(xì)胞的多能性3_9。然而，該過程緩慢、效率低下，并且載 體被永久整合入基因組限制了 iPS細(xì)胞在治療應(yīng)用中的使用^進(jìn)一步的研究證實(shí)，老化程度、來源和所用的細(xì)胞類型對重新編程效率具有重要影響，最終需要表達(dá)較少的因子和/或減少整個(gè)過程的時(shí)間。最近證實(shí)，人類角質(zhì)細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致重新編程而具有多能性，效率比成纖維細(xì)胞高100倍，并且速率比成纖維細(xì)胞快2倍。據(jù)推測，這些差異是可能是由于起始角質(zhì)細(xì)胞群體中KLF4和c-MYC的內(nèi)源表達(dá)和/或存在未分化的祖細(xì)胞庫，所述未分化的祖細(xì)胞呈現(xiàn)出更易于重新編程的表觀遺傳狀態(tài) ' 小鼠中的其它研究進(jìn)一步支持后一推測n’12。然而，干細(xì)胞通常是稀有的，并且難以大量獲取和分離(例如，神經(jīng)干細(xì)胞13’14)。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS)已引起了再生醫(yī)學(xué)的關(guān)注，因?yàn)槠湓试S體外產(chǎn)生患者特異性的祖細(xì)胞，對細(xì)胞治療具有潛在價(jià)值^然而，在很多情況下，現(xiàn)成的方法可能是理想的，例如對于急性疾病狀態(tài)的細(xì)胞治療，或當(dāng)患者的體細(xì)胞由于慢性病或衰老而改變時(shí)。臍帶血(CB)干細(xì)胞正適合于此目的，因?yàn)樗鼈兪切律?、免疫未成熟的?xì)胞，具有最小的基因和表觀遺傳學(xué)改變，并且通過CB庫的世界網(wǎng)絡(luò)可容易地獲得成幾十萬的免疫分型的CB單位2。CB細(xì)胞被認(rèn)為是能替代骨髓(BM)作為用于造血移植的干細(xì)胞來源，并且可以收集足夠量的CB細(xì)胞而不會(huì)為供體帶來任何風(fēng)險(xiǎn)15。除了易于獲取之外，CB細(xì)胞結(jié)合了年輕細(xì)胞具有最小體細(xì)胞突變的性質(zhì)和新生細(xì)胞的免疫學(xué)未成熟性所提供的優(yōu)勢15。這些性質(zhì)允許較寬松的HLA供體-受體選擇標(biāo)準(zhǔn)，為移植提供了決定性的益處。此外，臍帶血庫的世界性綜合網(wǎng)絡(luò)確保能快速且有效地搜索CB干細(xì)胞的相容供體2。最后，已證實(shí)CB⑶133+干細(xì)胞能表達(dá)0CT4、S0X2、NAN0G、REX1和其它多能性相關(guān)標(biāo)志物16_18，并因此原則上可能更易于重新編程。本文首次描述了包括以下的實(shí)施方案通過4種(OSKM)、3種(OSK)以及少至2種(OS)轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而無需2種強(qiáng)的癌基因(c-MYC和KLF4)或其它化合物，使CB干細(xì)胞快速且有效重新編程而具有多能性。利用本文所述的某些方法和組合物，能在非常有效且快速的過程中通過0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而將CB干細(xì)胞重新編程而具有多能性。得到的CB來源的iPS(CBiPS)細(xì)胞在表型和分子學(xué)上不同于人胚胎干細(xì)胞(hES)。此外，無需使用c-MYC和KLF4癌基因并僅通過0CT4和S0X2的過表達(dá)即可有效實(shí)現(xiàn)臍帶血iPS的產(chǎn)生。本文所述的方法和組合物克服了本領(lǐng)域中的問題，并且可以為創(chuàng)建用于現(xiàn)成應(yīng)用的HLA匹配的CBiPS細(xì)胞的綜合庫奠定基礎(chǔ)。發(fā)明概述本文特別提供了用于從臍帶血產(chǎn)生和使用誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的高效方法和組合物。
一方面，提供了制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法。所述方法包括用編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。另一方面，提供了制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法。所述方法包括用編碼0CT4蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。另一方面，提供了按照本文的方法制備的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。一方面，提供了包含編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸的臍帶血干細(xì)胞。 另一方面，提供了包含編碼0CT4蛋白的核酸的臍帶血干細(xì)胞。一方面，提供了產(chǎn)生人類體細(xì)胞的方法。所述方法包括使誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞與細(xì)胞生長因子接觸。允許所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述人類體細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，通過包括以下步驟的過程制備所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞用編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，通過包括以下步驟的過程制備所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞用編碼0CT4蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。另一方面，提供了治療需要組織修復(fù)的哺乳動(dòng)物的方法。所述方法包括將誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞給予所述哺乳動(dòng)物，并允許所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞進(jìn)行分裂并分化為所述哺乳動(dòng)物中的體細(xì)胞，從而提供所述哺乳動(dòng)物的組織修復(fù)。在一些實(shí)施方案中，通過包括以下步驟的過程制備所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞用編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，通過包括以下步驟的過程制備所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞用編碼0CT4蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。附圖簡要描述

圖1A-1E.僅利用0CT4和S0X2因子產(chǎn)生CBiPS細(xì)胞系。圖IA :臍帶血干細(xì)胞重新編程的時(shí)間線。感染后3天，將CB⑶133+細(xì)胞轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)細(xì)胞上。在第9天左右觀察到小的附著集落。12天后，典型hES樣集落清晰可見。圖IB :基因組DNA PCR確認(rèn)插入4個(gè)、3個(gè)和僅2個(gè)轉(zhuǎn)基因。圖IC :CBiPS2F-l、3F-10和4F-3細(xì)胞系的代表性相差圖像和堿性磷酸酶(AP)染色。圖ID :CBIPS2F、3F和4F細(xì)胞系的代表性端粒酶活性(HI :熱失活，HFF :人類包皮成纖維細(xì)胞，-C :作為陰性對照的裂解緩沖液，+C :陽性對照和QC :定量對照)。圖IE :CBIPS2F-1細(xì)胞系的多能性標(biāo)志物的免疫熒光分析。集落表達(dá)胚胎標(biāo)志物SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和轉(zhuǎn)錄因子0CT4、S0X2和NAN0G。下方的成纖維細(xì)胞提供陰性對照。比例尺:250 μ m圖2A-2G. CBiPS細(xì)胞系的表征。圖2A :描述多能性標(biāo)志物0CT4、S0X2、NANOG,REXl、CRIPTO、KLF4和c_MYC的定量RT-PCR分析的柱狀圖。分析了 ES [2]和角質(zhì)細(xì)胞iPS(KiPS)細(xì)胞系以及來源于新鮮和冷凍樣品的不同CBiPS細(xì)胞系。誤差棒代表三個(gè)平行樣品的s. d.(標(biāo)準(zhǔn)差)。柱狀例(從左至右):CBiPS4F-3、CBiPS4F-5、CBiPS3F_10、CBiPS3F-12、CBiPS2F_l、CBiPS2F_2、CBiPSF-U CBiPSF-5、ES2 和 KiPS0 圖 2B :描述定量RT-PCR的柱狀圖顯示了 CBiPS細(xì)胞系中0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC轉(zhuǎn)基因的抑制。柱狀例(從左至右):CBiPS4F-3、CBiPS3F-10 和 CBiPS2F_l。圖 2C :CBiPS2F_l 體外分化為 3個(gè)原代胚細(xì)胞層(外胚層-Tujl、內(nèi)胚層-AFP和F0XA2、以及中胚層-ASA和GATA4)。圖2D :睪丸內(nèi)注射CBiPS2F-l后60天的畸胎瘤切片的免疫熒光分析顯示出Tujl/GFAP陽性外胚層、AFP/FoxA2陽性內(nèi)胚層和ASM/ASA陽性中胚層。比例尺75-250 μ m。CBiPS2F_l (圖2E)和CBiPS3F-12(圖2F)的特異性體外分化為免疫學(xué)表型成熟的多巴胺能神經(jīng)(Tujl/TH酪氨酸羥化酶)。圖2G :柱狀圖描述的是比較人類成纖維細(xì)胞和CD133+細(xì)胞中0CT4、NAN0G、H0XB4 和 HOXB5 的啟動(dòng)子中 K4 (H3K4me2)、K27 (H3K27me3)和 K9 (H3K9me3)處的組蛋白 H3 甲基化水平的染色質(zhì)免疫沉淀分析。柱狀例成纖維細(xì) 胞(陣列點(diǎn))，CD133+(黑色)。圖3A-3C.人類⑶133+細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。圖3A :描述了免疫選擇后的⑶133細(xì)胞純度的代表性點(diǎn)圖。圖3B :描述了感染后3天總GFP+細(xì)胞和雙陽性GFP/CD133細(xì)胞的定量。圖3C :柱狀圖描述的是hES條件下培養(yǎng)3周的未轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD133+干細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。分析了細(xì)胞的造血標(biāo)志物⑶45、⑶34、⑶38和⑶133和包括SSEA3、SSEA4和TRA-1-60的胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物。圖4A-4B. pMXs-OSKMG和pMXs-OSKG多順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒的示意圖。圖4A:pMXs-OSKG多順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒。圖4B pMXs-0SKMG多順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒。圖5A-5C.多能性標(biāo)志物的免疫熒光分析。圖5A :CBiPS3F_10。圖5B :CBiPS4F_3細(xì)胞系表達(dá)包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81的其它典型多能性標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄因子0CT4、S0X2和NANOG。圖5C :用OSK逆轉(zhuǎn)錄病毒對從凍/融CB單位純化出的CD 133+細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)之后而產(chǎn)生的CBiPS冷凍(CBiPSFr)-I細(xì)胞系表達(dá)包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1_60、TRA-1-81的其它典型多能性標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄因子0CT4、S0X2和NAN0G。下方的成纖維細(xì)胞提供陰性對照。比例尺250 μ m圖6.CBiPS2F的流式細(xì)胞術(shù)分析。柱狀圖描述的是，流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)了CBiPS2F-l細(xì)胞已喪失了諸如⑶45和⑶34的造血標(biāo)志物并獲取了包括TRA-1-181和SSEA-4的典型多能性標(biāo)志物。圖7A-7B.全局基因表達(dá)分析。圖7A :比較了 CBiPS (2種系，每個(gè)系2個(gè)重復(fù))和ES2(2個(gè)重復(fù))的平均全局基因表達(dá)模式，其顯示出非常高的相關(guān)性水平。圖中標(biāo)出了某些多能性基因。圖7B :不同多能系和各自的起始群體的所有配對比較的全基因組轉(zhuǎn)錄譜的相關(guān)系數(shù)。圖8A-8B.逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因沉默。針對0CT4與特異性FLAG-抗體的組合的免疫熒光染色，其僅檢測任何FLAG標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。圖8A CBiPS2F-l中內(nèi)源0CT4的表達(dá)和轉(zhuǎn)基因的沉默。圖8B :用作為陽性對照的0CT4和S0X2感染的原代人類成纖維細(xì)胞。比例尺250 μ m圖9.通過重亞硫酸鹽基因組測序進(jìn)行的甲基化啟動(dòng)子分析。0CT4啟動(dòng)子甲基化分析證實(shí)了所有CBiPS細(xì)胞系中啟動(dòng)子的一致性去甲基化。圖10. Southern印跡。評價(jià)CBiPS2F_l系和亞克隆中的逆轉(zhuǎn)錄病毒整合數(shù)量的Southern印跡。I :用PstI消化的基因組DNA與KLF4特異性探針雜交。內(nèi)源條帶5. 9kb和0.9kb (黑色箭頭)。正如所預(yù)期的，用該探針未檢測出其它條帶。2:用PstI消化的基因組DNA與S0X2特異性探針雜交。內(nèi)源條帶0.9kb (黑色箭頭)。同一其它條帶存在于CBiPS2F-l、CBiPS2F-la和CBiPS2F_lb中，其對應(yīng)于獨(dú)特的轉(zhuǎn)基因插入(紅色星號(hào))。3 :用HindIII消化的基因組DNA與0CT4特異性探針雜交。內(nèi)源特異性條帶4. 5kb (黑色箭頭)。內(nèi)源非特異性條帶(灰色箭頭)。同一其它條帶存在于CBiPS2F-l、CBiPS2F-la和CBiPS2F-lb中，其對應(yīng)于獨(dú)特的轉(zhuǎn)基因插入(紅色星號(hào))。4 :用HindIII消化的基因組DNA與c-MYC特異性探針雜交。內(nèi)源條帶llkb (黑色箭頭)。正如所預(yù)期的，用該探針未檢測出其它條帶。圖IIA-11C. CBiPS2F、3F和4F細(xì)胞系 的核型分析。高分辨率G顯帶核型表明第10代后分析的 CBiPS2F-l(圖 11A)、CBiPS3F-10(圖 11B)和 CBiPS4F_3(圖 11C)細(xì)胞的正常的、二倍體的、雄性和雌性染色體含量。圖12A-12F. CBiPS細(xì)胞系的體外和體內(nèi)多能性。圖12A :來源于CBiPS2F_l細(xì)胞系的類胚胎體。CBiPS3F-10 (圖12B)和CBiPS4F_3 (圖12C)能體外分化為3個(gè)胚層，包括神經(jīng)(Tujl/GFAP)、內(nèi)胚層(AFP/FoxA2)和中胚層(ASM)細(xì)胞。圖12D =CBiPSFr-I細(xì)胞系體外分化為3個(gè)胚層，包括神經(jīng)(Tujl)、內(nèi)胚層(AFP/FoxA2)和中胚層(ASM)細(xì)胞。CBiPS3F_10 (圖12E)和CBiPS4F-3(圖12F)體內(nèi)分化。得到的含畸胎瘤的組織表現(xiàn)出所有3個(gè)胚層外胚層(Tujl/GFAP)、內(nèi)胚層(AFP/FoxA2)和中胚層(ASM/ASA)。圖13A-13D. CB CD133+細(xì)胞的基因表達(dá)分析。圖13A :表現(xiàn)了 CD133+、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、ES細(xì)胞、KiPS和CBiPS的全基因組轉(zhuǎn)錄譜的層級聚類的系統(tǒng)樹狀圖顯示出，CD133+細(xì)胞并不比成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞更接近多能細(xì)胞。圖13B :柱狀圖描述了通過定量RT-PCR比較的⑶133+細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞中多能性標(biāo)志物和KLF4的基因表達(dá)分析。柱狀例(從左至右)CD133+(黑色)、成纖維細(xì)胞(空心)和角質(zhì)細(xì)胞(灰色)。圖 13C :通過定量 RT-PCR 證實(shí) CD133+ 細(xì)胞中 SALL2、ZNF589、DPPA4、DNMT3A 和 DNMT3B 基因上調(diào)。柱狀例與圖13B相同。圖13D :⑶133+細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞中c_MYC表達(dá)的定量RT-PCR分析。誤差棒表示三個(gè)平行樣的標(biāo)準(zhǔn)差。柱狀例與圖13B相同。發(fā)明詳述I.定義提供下述定義是為了便于理解本文常用的某些術(shù)語，而并非意圖限制本申請的范圍。“核酸”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，以及以上的互補(bǔ)物。術(shù)語“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”指多核苷酸中的核酸與另一多核苷酸中的另一核酸形成堿基對的能力。例如，序列A-G-T與序列T-C-A是互補(bǔ)的?；パa(bǔ)性可以是部分的，其中僅一部分核酸按照堿基配對而相匹配；或是完全的，其中所有核酸都按照堿基配對而相匹配。對于兩個(gè)或更多個(gè)核酸，術(shù)語“同一的”或“同一性”百分比是指利用BLAST或BLAST 2. O序列比較算法以及下文所述默認(rèn)參數(shù)或通過手工比對和肉眼檢查(參閱如NCBI網(wǎng)站等)進(jìn)行測定時(shí)，相同的或具有規(guī)定的相同核苷酸的百分比(即，當(dāng)在比較窗或指定區(qū)域上進(jìn)行比較和為最大一致性進(jìn)行比對時(shí)，在規(guī)定區(qū)域上具有約60%的同一性，優(yōu)選65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的同一性)的兩條或更多條序列或亞序列。此類序列被認(rèn)為是“基本上同一的”。該定義還指或可適用于測試序列的互補(bǔ)物。該定義還包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下文所述，優(yōu)選的算法能夠解決空位等。優(yōu)選地，同一性存在于長度為至少約25個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上，或更優(yōu)選長度為50-100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上。短語“嚴(yán)緊雜交條件”指探針與通常在核酸復(fù)合混合物中的探針靶序列雜交而不與其它序列雜交的條件。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的，并且視情況的不同而不同。較長的序列在較高的溫度下特異性雜交。有關(guān)核酸雜交的廣泛指導(dǎo)可參見Tijssen，Techniques In Biochemistry and molecular Biology-Hybridization With NucleicProbes， " Overview of principles of hybridization 和 the strategy of nucleicacid assays" (1993)中。通常，將嚴(yán)緊條件選擇為低于規(guī)定離子強(qiáng)度、pH下具體序列的熱解鏈溫度(Tm)約5-10°C。Tm是(在規(guī)定離子強(qiáng)度、pH以及核酸強(qiáng)度下)在平衡時(shí)與靶標(biāo)互補(bǔ)的探針中的50%與靶序列雜交的溫度(因?yàn)榘行蛄羞^量存在 所以在Tm下，50%的探針在平衡時(shí)被占據(jù))。也可以通過添加諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊條件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號(hào)至少是背景兩倍的雜交，優(yōu)選為背景10倍的雜交。示例性的嚴(yán)緊雜交條件可以為如下所述50%甲酰胺、5 X SSC和I % SDS、42°C下孵育，或5 X SSC、I %SDS、65°C下孵育，同時(shí)在65°C下、在O. 2XSSC和O. 1% SDS中洗滌。使用核酸雜交技術(shù)的各種具體DNA和RNA測量方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的(參見Sambrook,同上)。部分方法涉及電泳分離(如檢測DNA的Southern印跡和檢測RNA的Northern印跡)，但DNA和RNA的測量也可以在缺少電泳分離的情況下進(jìn)行(如利用斑點(diǎn)印跡)?？梢酝ㄟ^使用能增加所檢測的靶核酸的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)來增強(qiáng)雜交測定的敏感性。這類系統(tǒng)的實(shí)例包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)系統(tǒng)和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)系統(tǒng)。本領(lǐng)域中最近描述的其它方法是基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario)和
復(fù)制酶系統(tǒng)。這些系統(tǒng)可用于直接鑒定突變體，其中PCR或LCR引物被設(shè)計(jì)為僅當(dāng)所選序列存在時(shí)才會(huì)進(jìn)行延伸或連接?？蛇x地，通?？梢岳美绶翘禺愋訮CR引物來擴(kuò)增所選序列，并隨后探測所擴(kuò)增的靶區(qū)域中指示突變的特定序列。應(yīng)當(dāng)理解，包括Taqman 和分子信標(biāo)探針在內(nèi)的各種檢測探針可用于監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，例如實(shí)時(shí)監(jiān)測。詞語“多核苷酸”指核苷酸的線性序列。核苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核苷核苷酸或兩者的混合物。本文所考慮的多核苷酸的實(shí)例包括單鏈和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈RNA (包括miRNA)，以及具有單鏈和雙鏈DNA和RNA混合物的雜交分子。詞語“蛋白”、“肽”以及“多肽”可互換使用，表示氨基酸聚合物或一組兩個(gè)或更多個(gè)相互作用的或結(jié)合的氨基酸聚合物。術(shù)語“基因”指參與產(chǎn)生蛋白的DNA的區(qū)段；其包含編碼區(qū)前后的區(qū)域(前導(dǎo)區(qū)和拖尾區(qū))，以及各編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。前導(dǎo)區(qū)、拖尾區(qū)以及內(nèi)含子包含基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程所必需的調(diào)節(jié)元件。此外，“蛋白基因產(chǎn)物”是由具體基因表達(dá)的蛋白?！安《据d體”是能將另一核酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的病毒來源的核酸。當(dāng)病毒載體存在于適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中時(shí)，其能指導(dǎo)該載體所攜帶的一個(gè)或多個(gè)基因所編碼的一種或多種蛋白的表達(dá)。病毒載體的實(shí)例包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。術(shù)語“轉(zhuǎn)染(transfection) ”或“轉(zhuǎn)染(transfecting) ”被定義為將核酸分子通過非病毒或基于病毒的方法引入細(xì)胞的過程。非病毒轉(zhuǎn)染方法包括不利用病毒DNA或病毒顆粒作為遞送系統(tǒng)而將核酸分子引入細(xì)胞的任何合適的轉(zhuǎn)染方法。示例性的非病毒轉(zhuǎn)染方法包括磷酸韓轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染(nucleofection)、聲波穿孔(sonoporation)、通過熱休克轉(zhuǎn)染、磁轉(zhuǎn)染(magnetifection)和電穿孔。對于基于病毒的轉(zhuǎn)染方法，任何有用的病毒載體都可以用于本文所述的方法中。病毒載體的實(shí)例包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。本文所用詞語“表達(dá)(expression) ” 或“表達(dá)(expressed) ”,當(dāng)涉及基因時(shí),表示該基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物?？梢愿鶕?jù)細(xì)胞中存在的相應(yīng)mRNA的量或細(xì)胞所產(chǎn)生的DNA所編碼的蛋白的量來確定細(xì)胞中DNA分子的表達(dá)水平(Sambrook et al. , 1989 MolecularCloning A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)，18. 1-18. 88)。術(shù)語“質(zhì)?！敝妇幋a基因和/或基因表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)元件的核酸分子?；驈馁|(zhì)粒的的表達(dá)可以順式發(fā)生或反式發(fā)生。如果基因順式表達(dá)，則基因和調(diào)節(jié)元件由同一質(zhì)粒編碼。反式表達(dá)指基因和調(diào)節(jié)序列由單獨(dú)的質(zhì)粒編碼的情況。術(shù)語“附加的”指細(xì)胞中質(zhì)粒的染色體外狀態(tài)。附加型質(zhì)粒是指不是染色體DNA的一部分并且獨(dú)立于染色體DNA進(jìn)行復(fù)制的核酸分子?！凹?xì)胞培養(yǎng)物”是存在于生物體外的細(xì)胞群體。這些細(xì)胞任選地是分離自細(xì)胞庫、動(dòng)物或血液庫的原代細(xì)胞，或是來自這些來源之一并且已經(jīng)永生化為長期存活的體外培養(yǎng)物的次代細(xì)胞?！案杉?xì)胞”是特征為能通過細(xì)胞有絲分裂而進(jìn)行自我更新且能分化成組織或者器官的細(xì)胞。在哺乳動(dòng)物干細(xì)胞中，胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞是有區(qū)別的。胚胎干細(xì)胞存在于胚泡中，并且產(chǎn)生胚胎組織，而成體干細(xì)胞存在于成體組織中，用于組織再生和修復(fù)。術(shù)語“多能的”或“多能性”指能產(chǎn)生后代的細(xì)胞所述后代在適當(dāng)?shù)臈l件下能分化為共同表現(xiàn)出與來自三個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的細(xì)胞譜系相關(guān)的特征的細(xì)胞類型。多能干細(xì)胞能為出生前、出生后或成體生物體的組織提供貢獻(xiàn)。本領(lǐng)域中公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)測試，例如在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可用于建立細(xì)胞群的多能性。然而，各種多能干細(xì)胞特征的鑒定也可以用于鑒定多能細(xì)胞?！岸嗄芨杉?xì)胞特征”指能將多能干細(xì)胞與其它細(xì)胞區(qū)分開的細(xì)胞特征。分子標(biāo)志物的特定組合的表達(dá)或不表達(dá)是多能干細(xì)胞特征的實(shí)例。具體而言，人類多能干細(xì)胞可以表達(dá)下述非限制性標(biāo)志物中的至少一些以及任選地表達(dá)所有標(biāo)志物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60, TRA-1-8K TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-鈣粘蛋白、UTF-I、0ct4、Lin28、Rexl 以及Nanog。與多能干細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞形態(tài)也是多能干細(xì)胞的特征。術(shù)語“重新編程”是指使非多能細(xì)胞去分化成為表現(xiàn)多能干細(xì)胞特征的細(xì)胞的過程。術(shù)語“治療”表示改善、抑制、根除所治療的疾病和/或延遲所治療的疾病的發(fā)作。II.從臍帶血制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法一方面，提供了制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法。所述方法包括用編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。“誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞”指通過人為方式來源于非多能細(xì)胞的多能干細(xì)胞?！胺嵌嗄芗?xì)胞”可以是自我更新能力和分化能力比多能干細(xì)胞差的細(xì)胞。能力較差的細(xì)胞可以是但不限于成體干細(xì)胞、組織特異性祖細(xì)胞、原代或次代細(xì)胞。成體干細(xì)胞是胚胎發(fā)育之后在全身均可發(fā)現(xiàn)的未分化的細(xì)胞。成體干細(xì)胞通過細(xì)胞分裂進(jìn)行擴(kuò)增，從而補(bǔ)充將死亡的細(xì)胞并再生受損組織。成體干細(xì)胞能分裂并產(chǎn)生與其相似的另一細(xì)胞，并且還能分裂并產(chǎn)生比其分化程度更高的細(xì)胞。盡管成體干細(xì)胞與多能性標(biāo)志物例如REXl、Nanog、0ct4或Sox2的表達(dá)有關(guān)，但是它們不具有多能干細(xì)胞的分化為所有3個(gè)胚層的細(xì)胞類型的能力。成體干細(xì)胞的自我更新能力和產(chǎn)生獨(dú)特細(xì)胞類型的后代的能力是有限的。成體干細(xì)胞可以是造血干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞 、皮膚干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞，但不限于此。組織特異性祖細(xì)胞指缺乏自我更新潛能、已定向?yàn)橄蛱囟ㄆ鞴倩蚪M織分化的細(xì)胞。原代細(xì)胞包括除了卵細(xì)胞、精細(xì)胞和干細(xì)胞之外的成體或胎兒生物體的任何細(xì)胞。有用的原代細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于皮膚細(xì)胞、骨細(xì)胞、血液細(xì)胞、內(nèi)部器官的細(xì)胞和結(jié)締組織的細(xì)胞。次代細(xì)胞來源于原代細(xì)胞，并且已經(jīng)永生化為長期存活的體外細(xì)胞培養(yǎng)物?！澳殠а杉?xì)胞”是指存在于臍帶血中的成體干細(xì)胞，其特征為自我更新能力和分化能力比多能干細(xì)胞差。術(shù)語“轉(zhuǎn)染(transfection) ”或“轉(zhuǎn)染(transfecting) ”被定義為將核酸分子通過非病毒或基于病毒的方法引入細(xì)胞的過程。非病毒轉(zhuǎn)染方法包括不利用病毒DNA或病毒顆粒作為遞送系統(tǒng)而將核酸分子引入細(xì)胞的任何合適的轉(zhuǎn)染方法。示例性的非病毒轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染、聲波穿孔、通過熱休克轉(zhuǎn)染、磁轉(zhuǎn)染和電穿孔。在一些實(shí)施方案中，利用電穿孔、按照本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)步驟將核酸分子引入細(xì)胞。對于基于病毒的轉(zhuǎn)染方法，任何有用的病毒載體都可以用于本文所述的方法中。病毒載體的實(shí)例包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。在一些實(shí)施方案中，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、按照本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)步驟將核酸分子引入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的基因的表達(dá)在細(xì)胞中可以瞬時(shí)或穩(wěn)定發(fā)生。在“瞬時(shí)表達(dá)”過程中，轉(zhuǎn)染的基因在細(xì)胞分裂過程中不會(huì)轉(zhuǎn)移到子代細(xì)胞中。因?yàn)槠浔磉_(dá)限于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，因此，該基因的表達(dá)隨時(shí)間而喪失。相比之下，當(dāng)轉(zhuǎn)染的基因與賦予轉(zhuǎn)染的細(xì)胞選擇優(yōu)勢的另一基因共轉(zhuǎn)染時(shí)，會(huì)發(fā)生該轉(zhuǎn)染的基因的穩(wěn)定表達(dá)。所述選擇優(yōu)勢可以是對提供給細(xì)胞的某種毒素的抗性。還可以通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的宿主基因組插入來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的基因的進(jìn)一步表達(dá)。在轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入過程中，基因位于兩個(gè)轉(zhuǎn)座子連接序列之間，所述連接序列允許所述基因插入到宿主基因組中以及隨后的切除。本文涉及的“0CT4蛋白”包括任何天然存在形式的Octomer 4轉(zhuǎn)錄因子或它的能保持0ct4轉(zhuǎn)錄因子活性(例如，與0ct4相比，活性在至少50 %、80 %、90 %、95 %、96 %、97%、98%、99%或100%內(nèi))的變體。在一些實(shí)施方案中，與天然存在的0ct4多肽(如SEQ ID NO USEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3)相比，變體在全序列或序列的一部分(如50、100、150或200個(gè)連續(xù)氨基酸部分)上具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。在其它實(shí)施方案中，0ct4蛋白是由以下NCBI參考號(hào)所確定的蛋白對應(yīng)于同種型I的gi :42560248 (SEQ ID NO :1)、對應(yīng)于同種型2的gi :116235491和gi 291167755 (SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3)。
本文涉及的“Sox2蛋白”包括任何天然存在形式的Sox2轉(zhuǎn)錄因子或它的能保持Sox2轉(zhuǎn)錄因子活性(例如，與Sox2相比，活性在至少50%,80%,90%,95%,96%,97%,98%、99%或100%內(nèi))的變體。在一些實(shí)施方案中，與天然存在的Sox2多肽(如SEQ IDN04)相比，變體在全序列或序列的一部分(如50、100、150或200個(gè)連續(xù)氨基酸部分)上具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。在其它實(shí)施方案中，Sox2蛋白是NCBI參考號(hào)gi :28195386 (SEQ ID NO 4)所確定的蛋白。本文涉及的“KLF4蛋白”包括任何天然存在形式的KLF4轉(zhuǎn)錄因子或它的能保持KLF4轉(zhuǎn)錄因子活性(例如，與KLF4相比，活性在至少50 %、80 %、90 %、95%、96 %、97 %、98%、99%或100%內(nèi))的變體。在一些實(shí)施方案中，與天然存在的KLF4多肽(如SEQ IDNO 5)相比，變體在全序列或序列的一部分(如50、1 00、150或200個(gè)連續(xù)氨基酸部分)上具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。在其它實(shí)施方案中，KLF4蛋白是NCBI參考號(hào)gi :194248077 (SEQ ID NO 5)所確定的蛋白。本文涉及的“cMYC蛋白”包括任何天然存在形式的cMyc轉(zhuǎn)錄因子或它的能保持cMyc轉(zhuǎn)錄因子活性(例如，與cMyc相比，活性在至少50 % ,80 % ,90 % ,95% ,96 % ,97 %,98%、99%或100%內(nèi))的變體。在一些實(shí)施方案中，與天然存在的cMyc多肽(如SEQ IDN06)相比，變體在全序列或序列的一部分(如50、100、150或200個(gè)連續(xù)氨基酸部分)上具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。在其它實(shí)施方案中，cMyc蛋白是NCBI參考號(hào)gi :71774083 (SEQ ID NO 6)所確定的蛋白。本文涉及的“NANOG蛋白”包括任何天然存在形式的Nanog轉(zhuǎn)錄因子或它的能保持Nanog轉(zhuǎn)錄因子活性(例如，與似11(^相比，活性在至少50%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%內(nèi))的變體。在一些實(shí)施方案中，與天然存在的Nanog多肽(如SEQ IDNO 7)相比，變體在全序列或序列的一部分(如50、100、150或200個(gè)連續(xù)氨基酸部分)上具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。在其它實(shí)施方案中，Nanog蛋白是NCBI參考號(hào)gi :153945816 (SEQ ID NO 7)所確定的蛋白。本文涉及的“LIN28蛋白”包括任何天然存在形式的Lin28轉(zhuǎn)錄因子或它的能保持Lin28轉(zhuǎn)錄因子活性(例如，與1^1128相比，活性在至少50%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%內(nèi))的變體。在一些實(shí)施方案中，與天然存在的Lin28多肽(如SEQ IDNO 8)相比，變體在全序列或序列的一部分(如50、100、150或200個(gè)連續(xù)氨基酸部分)上具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。在其它實(shí)施方案中，Lin28蛋白是NCBI參考號(hào)gi :13375938 (SEQ ID NO 8)所確定的蛋白。允許轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂并從而形成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可以包括，在轉(zhuǎn)染后擴(kuò)增臍帶血干細(xì)胞、任選地選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并鑒定多能干細(xì)胞。本文所用的擴(kuò)增包括在本領(lǐng)域公知的條件下、在容器中由轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞產(chǎn)生后代細(xì)胞。擴(kuò)增可以在合適的培養(yǎng)基和細(xì)胞生長因子的存在下發(fā)生。細(xì)胞生長因子是使細(xì)胞發(fā)生遷移、分化、轉(zhuǎn)化或成熟和分裂的試劑。它們是通常能從各種正常和惡性哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型分離的多肽。某些生長因子也可以由基因工程微生物產(chǎn)生，例如細(xì)菌(大腸桿菌(E.coli))和酵母。可以將細(xì)胞生長因子補(bǔ)充到培養(yǎng)基中和/或通過與分泌所述細(xì)胞生長因子的照射的胚胎成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)來提供細(xì)胞生長因子。細(xì)胞生長因子的實(shí)例包括但不限于FGF、bFGF2和EGF。在合適的情況下，轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞的擴(kuò)增可以經(jīng)歷選擇過程。選擇過程可以包括通過轉(zhuǎn)染引入臍帶血干細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記可以是編碼具有酶活性的多肽的基因。酶活性包括但不限于乙酰轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。在一些實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記的酶活性是磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。選擇標(biāo)記的酶活性可以賦予轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞在毒素存在下擴(kuò)增的能力。這類毒素通常抑制細(xì)胞擴(kuò)增和/或?qū)е录?xì)胞死亡。這類毒素的實(shí)例包括但不限于潮霉素、新霉素、嘌呤霉素以及慶大霉素。在一些實(shí)施方案中，毒素是潮霉素。通過選擇標(biāo)記的酶活性，毒素可以被轉(zhuǎn)變?yōu)椴辉僖种妻D(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞擴(kuò)增和導(dǎo)致細(xì)胞死亡的非毒素。一旦暴露于毒素，缺少選擇標(biāo)記的細(xì)胞可以被清除，并由此阻止其擴(kuò)增。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的鑒定可以包括但不限于評價(jià)上述多能干細(xì)胞的特征。這類多能干細(xì)胞的特征包括但不限于，分子標(biāo)志物的某些組合的表達(dá)或不表達(dá)。此外，與多能干細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞形態(tài)也是多能干細(xì)胞的特征。
如上文所述，可以用編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸轉(zhuǎn)染本文的方法所提供的臍帶血干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，不用編碼cMYC蛋白、LIN28蛋白、NANOG蛋白或KLF4蛋白的其它核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，編碼0CT4蛋白的核酸形成質(zhì)粒的一部分，并且編碼S0X2蛋白的核酸形成質(zhì)粒的一部分。在另一實(shí)施方案中，編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸形成同一質(zhì)粒的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼0CT4蛋白的核酸形成第一質(zhì)粒的一部分，并且編碼S0X2蛋白的核酸形成第二質(zhì)粒的一部分。另一方面，提供了制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法。所述方法包括用編碼0CT4蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。 在一個(gè)實(shí)施方案中，不用編碼cMYC蛋白、LIN28蛋白、NANOG蛋白或KLF4蛋白的其它核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本文提供的方法所用的臍帶血細(xì)胞表達(dá)⑶133抗原。“⑶133抗原”是5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的糖蛋白，大小為120kD。成體干細(xì)胞和祖細(xì)胞可以表達(dá)⑶133抗原。CD 133抗原還稱為PROMLU AC133、造血干細(xì)胞抗原、hProminin、prominin樣I、prominin、RP41、MCDR2、STCD4、C0RD12 或 MSTP061。在一些實(shí)施方案中，CD133 抗原是由NCBI參考號(hào)gi :225690512 (SEQ ID NO 9)確定的基因所編碼的蛋白。在一些實(shí)施方案中，本文提供的方法所用的臍帶血干細(xì)胞來源于新鮮臍帶血?！靶迈r臍帶血”是來自新生兒的臍帶的血液，如果不過早地夾住臍帶，臍帶血會(huì)返回新生兒的循環(huán)。本文所指的新鮮臍帶血不是從臍帶分離后低溫保存的。術(shù)語“低溫保存”是指利用液氮冷凍諸如臍帶血的生物材料，從而長期保存所述生物材料的過程。在其它實(shí)施方案中，本文提供的方法所用的臍帶血干細(xì)胞來源于冷凍臍帶血。冷凍臍帶血是來自新生兒的臍帶的血液，但是該血液在按照本文提供的方法處理之前被低溫保存。III.誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞另一方面，提供了按照本文的方法制備的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。上文名為“從臍帶血制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法”的章節(jié)中所述的方法同等地適用于本文提供的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。IV.臍帶血干細(xì)胞—方面，提供了包含編碼0CT4蛋白的核酸(例如編碼0CT4蛋白的外源核酸或編碼0CT4蛋白的重組核酸)和編碼S0X2蛋白的核酸(例如編碼S0X2蛋白的外源核酸或編碼S0X2蛋白的重組核酸)的臍帶血干細(xì)胞。當(dāng)涉及編碼本文所用的蛋白的核酸時(shí)，術(shù)語“外源”表示不是天然存在于其所在的細(xì)胞(例如臍帶血細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，編碼0CT4蛋白的核酸形成質(zhì)粒的一部分，并且編碼S0X2蛋白的核酸形成質(zhì)粒的一部分。在另一實(shí)施方案中，編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸形成同一質(zhì)粒的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼0CT4蛋白的核酸形成第一質(zhì)粒的一部分，并且編碼S0X2蛋白的核酸形成第二質(zhì)粒的一部分。在一些實(shí)施方案中，臍帶血干細(xì)胞不包含編碼已知可用于iPS細(xì)胞形成的其它轉(zhuǎn)錄因子的核酸，例如編碼cMYC蛋白的核酸(例如編碼cMYC蛋白的外源核酸或編碼cMYC蛋白的重組核酸)、編碼LIN28蛋白的核酸(例如編碼LIN28蛋白的外源核酸或編碼LIN28蛋白的重組核酸)、編碼NANOG蛋白的核酸(例如編碼NANOG蛋白的外源核酸或編碼NANOG蛋白的重組核酸)和/或編碼KLF4蛋白的核酸 (例如編碼KLF4蛋白的外源核酸或編碼KLF4蛋白的重組核酸)。在其它實(shí)施方案中，所述臍帶血干細(xì)胞基本上由編碼0CT4蛋白的核酸(例如編碼0CT4蛋白的外源核酸或編碼0CT4蛋白的重組核酸)和編碼S0X2蛋白的核酸(例如編碼S0X2蛋白的外源核酸或編碼S0X2蛋白的重組核酸)組成。如果臍帶血干細(xì)胞“基本上由編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸組成”，則所述臍帶血干細(xì)胞不包含編碼已知可用于iPS細(xì)胞形成的其它轉(zhuǎn)錄因子的核酸，例如編碼cMYC蛋白的核酸(例如編碼cMYC蛋白的外源核酸或編碼cMYC蛋白的重組核酸)、編碼LIN28蛋白的核酸(例如編碼LIN28蛋白的外源核酸或編碼LIN28蛋白的重組核酸)、編碼NANOG蛋白的核酸(例如編碼NANOG蛋白的外源核酸或編碼NANOG蛋白的重組核酸)和/或編碼KLF4蛋白的核酸(例如編碼KLF4蛋白的外源核酸或編碼KLF4蛋白的重組核酸)。在一些實(shí)施方案中，所述臍帶血干細(xì)胞不包含編碼其它轉(zhuǎn)錄因子的核酸(例如編碼轉(zhuǎn)錄因子的其它外源核酸或編碼轉(zhuǎn)錄因子的其它重組核酸)。在其它實(shí)施方案中，所述臍帶血干細(xì)胞不包含編碼其它蛋白表達(dá)基因的核酸(例如編碼蛋白的其它外源核酸或編碼蛋白的其它重組核酸)。另一方面，提供了包含編碼0CT4蛋白的核酸(例如編碼0CT4蛋白的外源核酸或編碼0CT4蛋白的重組核酸)的臍帶血干細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，所述臍帶血干細(xì)胞基本上由編碼0CT4蛋白的核酸(例如編碼0CT4蛋白的外源核酸或編碼0CT4蛋白的重組核酸)組成。如果臍帶血干細(xì)胞“基本上由編碼0CT4蛋白的核酸組成”，則所述臍帶血干細(xì)胞不包含編碼已知可用于iPS細(xì)胞形成的其它轉(zhuǎn)錄因子的核酸，例如編碼cMYC蛋白的核酸(例如編碼cMYC蛋白的外源核酸或編碼cMYC蛋白的重組核酸)、編碼LIN28蛋白的核酸(例如編碼LIN28蛋白的外源核酸或編碼LIN28蛋白的重組核酸)、編碼NANOG蛋白的核酸(例如編碼NANOG蛋白的外源核酸或編碼NANOG蛋白的重組核酸)和/或編碼KLF4蛋白的核酸(例如編碼KLF4蛋白的外源核酸或編碼KLF4蛋白的重組核酸)。在一些實(shí)施方案中，所述臍帶血干細(xì)胞不包含編碼其它轉(zhuǎn)錄因子的核酸(例編碼轉(zhuǎn)錄因子的其它外源核酸或編碼轉(zhuǎn)錄因子的其它重組核酸)。在其它實(shí)施方案中，所述臍帶血干細(xì)胞不包含編碼其它蛋白表達(dá)基因的核酸(例如編碼蛋白的其它外源核酸或編碼蛋白的其它重組核酸)。在一些實(shí)施方案中，所述臍帶血干細(xì)胞表達(dá)⑶133抗原。在其它實(shí)施方案中，所述臍帶血干細(xì)胞來源于新鮮臍帶血。在一些實(shí)施方案中，所述臍帶血干細(xì)胞來源于冷凍臍帶血。
V.從無足跡的人類誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞制備人類體細(xì)胞的方法一方面，提供了制備人類體細(xì)胞的方法。所述方法包括使誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞與細(xì)胞生長因子接觸。允許誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成人類體細(xì)胞。允許誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基和細(xì)胞生長因子的存在下進(jìn)行分裂。細(xì)胞生長因子的實(shí)例包括但不限于SCF、GMCSF, FGF、TNF、IFN、EGF、IGF和白介素家族的成員。按照本發(fā)明提供的方法制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法包括以下步驟用編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法包括以下步驟用編碼0CT4蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。 另一方面，提供了治療需要組織修復(fù)的哺乳動(dòng)物的方法。所述方法包括將誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞給予哺乳動(dòng)物，并允許誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞進(jìn)行分裂并分化為哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞，從而為所述哺乳動(dòng)物提供組織修復(fù)。在一些實(shí)施方案中，制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法包括以下步驟用編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法包括以下步驟用編碼0CT4蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞。允許轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
實(shí)施例為了分離CB干細(xì)胞，利用免疫磁性選擇，從CB單位純化CD133+細(xì)胞，從而獲得純度為90-94%的細(xì)胞群體(圖3A)。為了促進(jìn)靜止的CD133+干細(xì)胞的增殖，在干細(xì)胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、Flt配體3 (Flt3)和白介素6 (IL-6)的存在下將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。按照用于貼壁細(xì)胞的方案1(1并進(jìn)行一些改動(dòng)來感染這些細(xì)胞。簡言之，將細(xì)胞接種在retronectin包被的平板上，事先按照之前所述19使這些平板預(yù)先吸附病毒顆粒。在對照實(shí)驗(yàn)中，利用組成型GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒對純化的CD 133+群體進(jìn)行3輪感染，每12小時(shí)一輪，并利用流式細(xì)胞術(shù)在感染后3天分析得到的群體；圖3B展示了典型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果全部細(xì)胞中的28%是GFP陽性的，并且全部細(xì)胞中的58%仍然是⑶133抗原陽性的。在GFP陽性群體中，17%為 CD133+/GFP+，11%為 CD133-/GFP+。試圖利用任何單獨(dú)的OSKM因子或OSKM因子的組合對⑶133+細(xì)胞進(jìn)行重新編程。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天，將細(xì)胞接種在照射的人類包皮成纖維細(xì)胞(HFF-I)飼養(yǎng)細(xì)胞上，并在含bFGF的hES培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了排除類似ES的培養(yǎng)條件本身能誘導(dǎo)重新編程的可能性，還在hES細(xì)胞條件下將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶133+干細(xì)胞培養(yǎng)3周。在這些平板中未觀察到集落形成。那些細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析表明它們不再表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物⑶133、⑶34和⑶38，仍然對造血標(biāo)志物CD45是陽性的，但是未獲得胚胎標(biāo)志物SSEA-3、SSEA-4或TRA1-60，上述結(jié)果提示當(dāng)在hES細(xì)胞條件下培養(yǎng)時(shí)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD133+細(xì)胞分化為成熟的造血細(xì)胞(圖1C)。感染后約9天，用0SKM、0SK或OS轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中開始出現(xiàn)小的集落。感染后12_15天時(shí)，部分的集落表現(xiàn)出典型的hES細(xì)胞形態(tài)，具有尖的邊緣，并且由小的、緊密填充的細(xì)胞群體構(gòu)成，該細(xì)胞群體具有大的細(xì)胞核和清晰可見的核仁(圖1A)。從8X IO4個(gè)CD133+細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染中，觀察到4-5個(gè)hES樣集落，并將其命名為CBiPS。通過手動(dòng)挑選擴(kuò)增集落，并且擴(kuò)增來自每種因子組合的CBiPS系(CBiPS 4F-l、CBiPS3F-l、CBiPS 2F-1)用于進(jìn)一步表征。通過PCR基因分型驗(yàn)證每種逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因的存在，分別證實(shí)了 CBiPS 4F-1、CBiPS 3F-1、CBiPS 2F-1中插入了預(yù)期的4、3或2種轉(zhuǎn)錄因子(圖1B)。所有3種CBiPS系對于堿性磷酸酶都是陽性染色的(圖1C)，并且正如免疫熒光染色所測定的，這些CBiPS系表達(dá)多能性標(biāo)志物0CT4、S0X2、TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA3、SSEA4和NANOG (圖1D)。此外，正如流式細(xì)胞術(shù)所測定的，重新編程的CBiPS系對于造血干細(xì)胞標(biāo)志物⑶45、⑶34和⑶38是陰性的。然而 ，它們對于造血干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的共同標(biāo)志物CD133是陽性的(圖1E)。與之前的免疫學(xué)表征相同，實(shí)時(shí)PCR分析表明所有3種CBiPS系都表達(dá)多種多能性基因，包括0CT4、S0X2、NANOG, CRIPTO和REX，這反映出與其它iPS10和hES [2]細(xì)胞系2°相似的基因表達(dá)譜(圖2A)。此外，正確地沉默了逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，并且由相應(yīng)的內(nèi)源基因驅(qū)動(dòng)CBiPS系中0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC的表達(dá)(圖2B)。這一點(diǎn)也通過利用具有FLAG標(biāo)簽的轉(zhuǎn)基因因子的特異性抗體的免疫熒光染色而得到證實(shí)(圖8A-8B)。⑶133+干細(xì)胞而不是成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)低水平的內(nèi)源0CT4、NANOG,S0X2、REX1和CRIPT0(圖2C)，從而指向允許快速重新編程的更可塑的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)。此夕卜，還發(fā)現(xiàn)與成纖維細(xì)胞相比，⑶133+細(xì)胞中0CT4和NANOG的啟動(dòng)子具有低水平的組蛋白抑制型標(biāo)志(H3K7和H3K9甲基化)(圖2D)，這提示存在可能利于由過表達(dá)的因子結(jié)合并轉(zhuǎn)錄激活這些基因的更寬松的染色質(zhì)組織。此外，與成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞相比(圖2C，圖2E)，CB⑶133+干細(xì)胞中高水平的KLF4和c-MYC的組合可能進(jìn)一步表明這些因子的內(nèi)源表達(dá)可以允許那些細(xì)胞的更快速的和/或增強(qiáng)的重新編程'細(xì)胞發(fā)生學(xué)分析表明3種細(xì)胞系在10代后仍保持正常的46XY核型。此外，雄性染色體的含量排除了重新編程的細(xì)胞來源于已知存在于原始臍帶血樣品中的少部分污染性母體細(xì)胞的可能性(圖11A)。然后，通過體外類胚胎體形成評價(jià)CBiPS細(xì)胞系的分化潛能。所有細(xì)胞系都能高效地形成類胚胎體(EB)(圖12A)，并且EB能分化為所有3種胚胎胚層的細(xì)胞類型，包括FoxA2和α-輔肌動(dòng)蛋白陽性的中胚層、GFAP和Tujl陽性的外胚層和α-胎蛋白陽性的內(nèi)胚層(圖12B-12F)。結(jié)果證實(shí)CBiPS4F_l、CBiPS 3F-1、CBiPS 2F-1細(xì)胞系在轉(zhuǎn)錄水平重新編程為與其它hiPS和hES細(xì)胞系相似的狀態(tài)、在核型上是穩(wěn)定的并且表現(xiàn)出符合多能性的體外發(fā)育潛能。通過表達(dá)多能性因子和癌基因的組合能實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重新編程。僅用兩周并僅利用2種因子就能將CB⑶133+干細(xì)胞重新編程的事實(shí)，突出了 CB細(xì)胞作為為再生醫(yī)學(xué)開發(fā)臨床適用的iPS細(xì)胞的體細(xì)胞理想來源的潛能。這可以包括利用非整合或半整合方法21_23，以及用小分子替換0CT4或S0X224’25。如果考慮其它易控體細(xì)胞來源，最近證實(shí)動(dòng)員的外周血(mPB)細(xì)胞也能為iPS衍生提供有效來源26。然而，與新生CB干細(xì)胞相比，成體mPB細(xì)胞更易于積累基因組改變，這可以由于衰老或直接由特定的疾病造成。此外，用于動(dòng)員成體造血干細(xì)胞室的藥學(xué)處理對供體造成健康風(fēng)險(xiǎn)在較小但不可忽視的比例的供體中，該過程能引起嚴(yán)重的反應(yīng)，包括脾破裂27。CB干細(xì)胞克服了這些問題，其易于獲得，并且由于它們是早期來源的，因此仍然是免疫上未成熟的，從而允許較低的HLA-供體-受體選擇的標(biāo)準(zhǔn)15。至今，全世界臍帶血庫的綜合網(wǎng)絡(luò)可提供超過400，000CB單位，這有利于快速且有效地搜索相容的供體來產(chǎn)生CBiPS20盡管產(chǎn)生患者特異性iPS系被再三地提議為理論上理想的臨床選擇，但是從實(shí)際性和成本效益的方面來看，該方法在很多情況下都是不可行的。大規(guī)模生產(chǎn)和儲(chǔ)備CBiPS系在公開的網(wǎng)絡(luò)中提供多種HLA單體型，這會(huì)為人類iPS細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和未來的臨床應(yīng)用提供極其重要的工具。VI.材料和方法樣品收集胳帶CB 樣品獲自 Bane de Sang i Teixi ts, Hospital Duran i Reynals,Barcelona。CD 133+細(xì)胞純化利用淋巴細(xì)胞-H(Cederlane，Ontario, CA)密度梯度離心從CB分離單核細(xì)胞(MNC)。利用 Mini-Macs 免疫磁性分離系統(tǒng)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Germany)陽性選擇⑶133+細(xì)胞。通過利用⑶133-藻紅蛋白(PE ；Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach, Germany)抗體染色的流式細(xì)胞術(shù)分析驗(yàn)證純化效率。構(gòu)建體和逆轉(zhuǎn)錄病毒制備通過RT-PCR從ES [4]總RNA擴(kuò)增0CT4和S0X2的人類cDNA ；從IMAGE克隆5111134擴(kuò)增人類KLF4，從Luciano Di Croce贈(zèng)予的DNA模板擴(kuò)增突變的人類C-MYCT58A。將擴(kuò)增的cDNA克隆到修改的pMSCVpuro載體的EcoRI/Clal位點(diǎn)，該載體允許N末端具有FLAG標(biāo)簽的蛋白的表達(dá)。按照下述構(gòu)建pMXs-OSKMG:利用去除了 0ct4終止密碼子并添加了 BspEI位點(diǎn)的反向引物擴(kuò)增小鼠0ct4cDNA，并將其克隆到pCRII (Invitrogen)，從而得到pCRII-0ct4-Bsp(方向?yàn)镹otI-5' cDNA3 ' _Acc65I)。利用含有AgeI位點(diǎn)和在其后面的P2A肽序列的正向引物和去除了 Sox2終止密碼子并含有BspEI位點(diǎn)的反向引物擴(kuò)增小鼠Sox2cDNA ;將該片段克隆到pCRII中，從而得到pCRII-Age-Sox2-Bsp (方向?yàn)镹otI-5 ' cDNA3 ' _Acc65I)。用 AgeI 和 Acc65I 切割 pCRII-Age-Sox2_Bsp，并克隆到用BspEI-Acc65I 切割的 pCRII-0ct4_Bsp，從而產(chǎn)生 pCRII-0ct4-P2A-Sox2-BspEI。相同的克隆方法重復(fù)兩次，從而并入小鼠Klf4和eGFP (產(chǎn)生pCRII-OSKG)或小鼠KIf 4、c_Myc和eGFP (產(chǎn)生 pCRII-OSKMG)。最后，用 EcoRI 切割 pCRII-OSKG 和 pCRII-OSKMG，并克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體PMXs的特有EcoRI位點(diǎn)，從而產(chǎn)生pMXs-OSKG和pMXs_0SKMG。利用Fugene6試劑(Roche)、按照廠商說明書轉(zhuǎn)染Phoenix Amphotropic細(xì)胞系后，獨(dú)立地產(chǎn)生4種因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒。24小時(shí)后,更換培養(yǎng)基,在32°C下孵育細(xì)胞,并且每12小時(shí)收獲病毒上清液。⑶133+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)在補(bǔ)充了10 % FBS 的 DMEM 中、在 SCF (50ng/ml) +Flt3 (50ng/ml) +TPO (lOng/ml)+IL-6(10ng/ml) (PeproTech)的存在下，預(yù)先刺激 CBCD133+細(xì)胞(I X IO5 個(gè)細(xì)胞/ml) 24小時(shí)。將非組織培養(yǎng)處理的多孔板用四連接素(Tetranectin，其是纖連蛋白片段CH-296)(Takara, Otsu, Japan, www. takara-bio. com)進(jìn)行包被(15mg/cm2),并且通過將含有 0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液的過濾的I : I : I : I混合物的平板在2，500RPM下離心30分鐘進(jìn)行預(yù)裝。在DMEM+10% FBS和上述細(xì)胞因子混合物的存在下接種約80，000個(gè)CD133+細(xì)胞。每12小時(shí)，用含有細(xì)胞因子混合物的新鮮病毒上清液更換一半的培養(yǎng)基，并在37°C、5% CO2下孵育；進(jìn)行3個(gè)感染周期。第3天時(shí)，收獲細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)移到含照射的人類成纖維細(xì)胞和ES培養(yǎng)基的6孔板，ES培養(yǎng)基的組成為=KO-DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)并補(bǔ)充20 % KO-血清替代品(GIBCO)、非必需氨基酸(Lonza)、
2-β-巰基乙醇(GIBCO)、青霉素 / 鏈霉素(GIBCO)、GlutaMAX (Invitrogene)和 10ng/mlbFGF(Peprotech)。CBiPS細(xì)胞在照射的人類成纖維細(xì)胞的頂部進(jìn)行培養(yǎng)并且手動(dòng)挑取。 總RNA的純化和定量RT-PCR
利用Trizol ⑧試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)或 RNAqueous ⑧.微型試劑盒(Ambion Inc. ,Austin TX)，根據(jù)可用細(xì)胞數(shù)，從CB CD133+干細(xì)胞、hES[2]細(xì)胞、KiPS細(xì)胞
(14)和CBiPS分離總RNA。用TURBO DNA酶抑制劑(Ambion)處理所有樣品，從而去除任何殘留基因組DNA,并利用Invitrogen Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒,使用Iyg RNA來合成cDNA。通過定量RT-PCR、利用之前所述的引物1Q，使用25ng cDNA來定量基因表達(dá)。GeneChip 表達(dá)分析按照廠商說明(Affymetrix,Santa Clara, CA),由生物醫(yī)學(xué)研究所(Institutefor Research in Biomedicine (Barcelona, Spain))白勺功倉泛基因組學(xué)中心(FunctionalGenomica Core)進(jìn)行GeneChip⑩微陣列處理。按照Nugen流程的說明、利用25ng起始RNA進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記。對于每個(gè)樣品，將3. 75 μ g ssDNA進(jìn)行標(biāo)記，并使其與AffymetrixHG-U133 Plus 2· O芯片雜交。在Affymetrix基因芯片掃描儀(7G升級)上掃描表達(dá)信號(hào)。利用Affymetrix GCOS軟件ν· I. 4進(jìn)行數(shù)據(jù)提取。利用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)學(xué)R Project的程序R進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。首先，利用R中執(zhí)行的gcRMA算法將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，并且對標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)的分級群聚。為了整合從兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)集(我們的角質(zhì)細(xì)胞重新編程(GE0登錄號(hào)GSE12583)和本實(shí)驗(yàn)(GSE16694))，我們利用R中的gcRMA算法將原始CEL文件共同標(biāo)準(zhǔn)化并，然后利用本領(lǐng)域已知的ComBat算法校正批次效應(yīng)。參見，例如 Johnson et al.，2007，Biostatistics8 :118_127。Southern 印跡利用All Prep DNA/RNA柱(Qiagen)、按照廠商指導(dǎo)，從每種細(xì)胞系分離基因組DNA0 Southern印跡的每個(gè)泳道對應(yīng)于用40U PstI或HindIII限制性酶(New EnglandBiolabs)消化的4yg基因組DNA，在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移到中性尼龍膜(Hybond -N, Amersham)，并與DIG_dUTP標(biāo)記的探針雜交，DIG-dUTP標(biāo)記的探針是通過利用PCR DIG探針合成試劑盒(Roche Diagnostics)的PCR生成的。利用AP偶聯(lián)DIG抗體(Roche Diagnostics)并利用(DP-Star (Sigma-Aldrich)作為化學(xué)發(fā)光底物來檢測探針。條件遵照廠商的說明。用S0X2、0CT4、KLF4和c_MYCcDNA作為模板并利用下述引物(F :正向；R :反向)生成探針S0X2 F 5/ -AGTACAACTCCATGACCAGC-3' (SEQ ID NO : 10);S0X2 R5/ -TCACATGTGTGAGAGGGGC-3' (SEQ ID NO :11);0CT4F:5' -TAAGCTTCCAAGGCCCTCC-3' (SEQ ID NO :12);0CT4 R 5; -CTCCTCCGGGTTTTGCTCC-3' (SEQ ID NO :13);KLF4F:5' -AATTACCCATCCTTCCTGCC-3' (SEQ ID NO :14);KLF4 R 5/ -TTAAAAATGCCTCTTCATGTGTA-3' (SEQ ID NO :15);
c-MYC F 5/ -TCCACTCGGAAGGACTATCC-3' (SEQ ID NO :16);c-MYC R :5' -TTACGCACAAGAGTTCCGTAG-3' (SEQ ID NO : 17)。免疫熒光分析和AP分析使CBiPS在塑料蓋片槽上生長，并用4%多聚甲醛(PFA)進(jìn)行固定。使用以下抗體TRA-1-60(MAB4360,1 200)、TRA_1_81 (MAB4381，I 200)、S0X2 (AB5603，I 500)(以上均來自 Chemicon)、SSEA-4 (MC-813-70，I 2)、SSEA_3 (MC-631，I 2)(以上均來自 Iowa)，TujKl 500 ;Covance)，a -胎蛋白(I 400 ;Dako)，a -輔肌動(dòng)蛋白(I 100 ;Sigma)、0CT4(C-10，SantaCruz，sc-5279，I 100)、NAN OG (Everest Biotech EB06860,1 100)、GATA4(1 50，SantaCruz)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(I 400，Sigma)、FoxA2 (I 50R&D System)、GFAP(1 1000，Dako)、a-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(I 400，Sigma)、抗 Flag (Sigma M2)。利用Leica SP5共聚焦顯微鏡采集圖像。利用堿性磷酸酶藍(lán)/紅膜底物溶液試劑盒(Sigma)、按照廠商指導(dǎo)，分析直接AP活性。體外分化從手動(dòng)收集的集落碎塊誘導(dǎo)EB形成，并然后在hES培養(yǎng)基中懸浮保持24小時(shí)。我們進(jìn)行了 2-3天的預(yù)條件培養(yǎng)，其中將EB保持在超低貼壁平板的3種不同的分化培養(yǎng)基中。具體而言，對于內(nèi)胚層分化，將EB培養(yǎng)在補(bǔ)充了 10%胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、0. ImM 2-β-巰基乙醇、非必需氨基酸和青霉素/鏈霉素的KO-DMEM培養(yǎng)基中。對于中胚層分化，我們使用與上述相同的培養(yǎng)基，但添加了抗壞血酸(0. 5mM)。對于外胚層誘導(dǎo)，將EB培養(yǎng)在N2/B27培養(yǎng)基中。預(yù)條件步驟后，將內(nèi)胚層和中胚層條件下的EB轉(zhuǎn)移到0. 1%明膠包被的塑料槽滑片中，并分別在分化培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基+抗壞血酸(0. 5nM)中培養(yǎng)2周。對于外胚層分化，將EB轉(zhuǎn)移到基質(zhì)細(xì)胞系PA6并在N2/B27培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周。每隔一天更換每種條件的培養(yǎng)基。染色質(zhì)免疫沉淀利用Diagenode的Magnetic Low cell ChIP試劑盒、按照廠商說明并且每次免疫沉淀使用15，000個(gè)細(xì)胞來進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。所用抗體來自Millipore 07-440(抗H3K27me3),07-030(抗 H3K4me2)和 17-625 (抗 H3K9me3)。啟動(dòng)子甲基化分析利用QIA AMP DNA小型試劑盒(Qiagen)，從約500，000個(gè)CD133+和CBiPS細(xì)胞的樣品提取基因組DNA。利用Epitect Bisulfite試劑盒(Qiagen)、按照廠商說明，誘變2 μ g純化的DNA。通過利用之前所述引物的2次連續(xù)PCRltl來擴(kuò)增目的啟動(dòng)子序列。將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM T Easy質(zhì)粒中，在T0P10細(xì)胞中擴(kuò)增，進(jìn)行純化并測序?；チ鲂纬蓪⒅囟嚷?lián)合免疫缺陷(SCID)拜格小鼠(Charles River Laboratories)麻醉,并且將懸浮于20-40 μ I hES培養(yǎng)基中的約0. 5 X IO6個(gè)CBiPS細(xì)胞注射到睪丸中。細(xì)胞注射后6-8周,將小鼠處死,按照常規(guī)免疫組化(Masson三色染色)和免疫突光流程處理和分析腫瘤。VII.參考文獻(xiàn)I. Yamanaka, S. A fresh look at iPS cells (新角度觀察 iPS 細(xì)胞).Cell 137,13-7(2009).
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權(quán)利要求
1.制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，包括 (i)用編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞；以及 ( )允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中不用編碼cMYC蛋白、LIN28蛋白、NANOG蛋白或KLF4蛋白的其它核酸轉(zhuǎn)染所述臍帶血干細(xì)胞。
3.制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，包括 (i)用編碼0CT4蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞；以及 ( )允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中不用編碼cMYC蛋白、LIN28蛋白、NANOG蛋白或KLF4蛋白的其它核酸轉(zhuǎn)染所述臍帶血干細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求I或3所述的方法，其中所述臍帶血干細(xì)胞表達(dá)CD133抗原。
6.如權(quán)利要求I或3所述的方法，其中所述臍帶血干細(xì)胞來源于新鮮臍帶血。
7.如權(quán)利要求I或3所述的方法，其中所述臍帶血干細(xì)胞來源于冷凍臍帶血。
8.按照權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法制備的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
9.臍帶血干細(xì)胞，包含編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸。
10.如權(quán)利要求9所述的臍帶血干細(xì)胞，其中所述臍帶血干細(xì)胞基本上由編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸組成。
11.臍帶血干細(xì)胞，包含編碼0CT4蛋白的核酸。
12.如權(quán)利要求11所述的臍帶血干細(xì)胞，其中所述臍帶血干細(xì)胞基本上由編碼0CT4蛋白的核酸組成。
13.如權(quán)利要求9、10、11或12所述的臍帶血干細(xì)胞，其中所述臍帶血干細(xì)胞表達(dá)⑶133抗原。
14.如權(quán)利要求9、10、11或12所述的臍帶血干細(xì)胞，其中所述臍帶血干細(xì)胞來源于新鮮臍帶血。
15.如權(quán)利要求9、10、11或12所述的臍帶血干細(xì)胞，其中所述臍帶血干細(xì)胞來源于冷凍臍帶血。
16.產(chǎn)生人類體細(xì)胞的方法，包括 (i)使誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞與細(xì)胞生長因子接觸；和 ( )允許所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述人類體細(xì)胞； 其中通過包括以下步驟的過程制備所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (i)用編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞，和 ( )允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞； 或者其中通過包括以下步驟的過程制備所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (i)用編碼0CT4蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞，和 ( )允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
17.治療需要組織修復(fù)的哺乳動(dòng)物的方法，包括 (i)將誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞給予所述哺乳動(dòng)物，(ii)允許所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞進(jìn)行分裂并分化為所述哺乳動(dòng)物中的體細(xì)胞，從而提供所述哺乳動(dòng)物的組織修復(fù)； 其中通過包括以下步驟的過程制備所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (i)用編碼0CT4蛋白的核酸和編碼S0X2蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞，和 ( )允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞； 或者其中通過包括以下步驟的過程制備所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (i)用編碼0CT4蛋白的核酸轉(zhuǎn)染臍帶血干細(xì)胞，從而形成轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞，和 ( )允許所述轉(zhuǎn)染的臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行分裂，從而形成所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
全文摘要
提供了用于產(chǎn)生和使用基因修正的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法和組合物。
文檔編號(hào)C12N5/074GK102712903SQ201080035756
公開日2012年10月3日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者胡安·卡洛斯·伊茲皮蘇阿貝爾蒙特, 阿萊斯桑德拉·吉奧蓋帝 申請人:索爾克生物學(xué)研究院, 西班牙巴塞羅那再生醫(yī)學(xué)中心