專利名稱：一種利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是一種革蘭氏陰性菌,能夠感染多種水產(chǎn)動物,包括魚類、蝦類、貝類等。鰻弧菌感染可導(dǎo)致弧菌病，該病是世界流行性疾病，可發(fā)生在任何季節(jié)，多年來給世界產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失?；蚪M序列分析表明，鰻弧菌基因組含有多個鞭毛蛋白基因，分別編碼鞭毛蛋白FlaA，F(xiàn)laB，F(xiàn)laC，F(xiàn)laDjPFlaE。研究表明，突變FlaA7FlaD和FlaE基因可降低細(xì)菌的侵染能力，而突變FlaB和FlaC對于細(xì)菌侵染沒有顯著影響，由此推測FlaA，F(xiàn)laD和FlaE可能參與細(xì)菌毒力。目前鰻弧菌鞭毛研究主要集中于致病性，鞭毛蛋白作為疫苗的可能性研究尚未開展起來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗，以鰻弧菌為模板，F(xiàn)1/R1為引物所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體PET259連接，連接轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒經(jīng)裂解與佐劑混合，即得到利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗；所述引物為Fl :5’ -CCCGGGATGCCTAAGGAGATCAATATG-3’ ；R1 :5’ -CCCGGGACCCAATAGACTAAGAGCT-3，。所述模板為鰻弧菌C312 ;鰻弧菌C312保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 6250，保藏日期2012年6月21日，分類命名為鰻弧菌(Vibrio anguillarum),保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。以鰻弧菌為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與載體pET259連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α篩選質(zhì)粒，而后加入裂解液純化離心后上清液稀釋后與佐劑等體積混合，即得到利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗。利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗的應(yīng)用，:所述疫苗作為抵御鰻弧菌侵染的疫苗藥物。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的重組鰻弧菌鞭毛蛋白作為亞單位疫苗具有高效的免疫保護(hù)效應(yīng)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的鞭毛蛋白電泳圖(泳道2)。泳道1，分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例旨在對本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法
1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。
2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)；
3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司”。
實(shí)施例1
鰻弧菌鞭毛蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法
質(zhì)粒pEFBl的構(gòu)建以鰻弧菌為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鰻弧菌鞭毛蛋白FlaB基因(該基因序列已被報道。具體參見Naka H，Dias GM, Thompson CC, Dubay C，Thompson FL, Crosa JH. Complete genome sequence of the marine fish pathogen Vibrio anguillarum harboring the pJMl virulence plasmid and genomic comparison with other virulent strains of V. anguillarum and V.ordali1.1nfect Immun2011 ;79:2889 - 900)。PCR 條件為94。C60s 預(yù)變性模板 DNA,然后 94。C40s，50。C60s，72。C60s, 5 個循環(huán)；然后 94。C40s，62。C60s, 72° C60s, 25 個循環(huán)后再在72° C延伸反應(yīng)IOmin。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化。
將載體pET259 (pET259 構(gòu)建過程參見 Zheng, ff . J.，Hu, Y. H.，Sun, L.，2010. Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot (Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish.1mmunol. 28，829 - 836)用 Swa I 酶切后回收 5. 4kb 片段，將其與上述純化的PCR片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 — 4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α，在含卡那霉素(30ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒 pEFBl。
所述LB組成成分按重量百分比計(jì)1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水；所述引物為 Fl :5’ -CCCGGGATGCCTAAGGAGATCAATATG-3’ 和 Rl :5’ -CCCG GGACCCAATAGACTAAGAGCT-3，。
所述作為模板的鰻弧菌可為現(xiàn)階段諸多種類的鰻弧菌；特別為鰻弧菌C312，該鰻弧菌保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為=CGMCC No. 6250,保藏日期 21012. 6. 21,分類命名為鰻弧菌(Vibrio anguillarum)。
實(shí)施例2
鞭毛蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將上述的質(zhì)粒pEFBl用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)(購自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(30ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時，挑取一個轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/pEFBl。將BL21/pEFBl 于含有卡那霉素(30ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取Iml過夜后的培養(yǎng)液，加入 IOOml新鮮的含有卡那霉素(30ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37° C下轉(zhuǎn)速200rpm搖動培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6，加入終濃度為0. 3mM的IPTG，30°C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速160rpm搖動培養(yǎng)5_6h， 而后以5000g，4° C離心lOmin，收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動1_2 小時，直至菌懸液變澄清為止。將菌液以10000g，4° C離心30min，回收上清。將上清中的蛋白用His Trap HP Columns (購于美國GE Healthcare公司)回收純化,純化的蛋白經(jīng) SDS-PAGE電泳檢測(8v/cm電壓下電泳25 — 30min,隨后15v/cm電壓下電泳2-2. 5h)，測定其分子量大小(參見圖1)。將純化的蛋白經(jīng)質(zhì)譜分析，證實(shí)其為具有FlaB序列的鞭毛蛋白。所述裂解液為終濃度的IOmM NaH2PO4, IOmM Tris和8M尿素，pH8. O。
實(shí)施例3
鞭毛蛋白作為疫苗的應(yīng)用
步驟I)佐劑及疫苗混合液的制備。
佐劑制備將5% (質(zhì)量比)NaOH和5% (質(zhì)量比)Al2 (SO4) 3以2 :5體積比混合，將混合物以10，OOOg離5分鐘。將沉淀懸浮于PBS中至O. 2mg/ml。
疫苗混合液制備將上述實(shí)施例純化的疫苗蛋白在I3BS中稀釋至300ug/ml ;將稀釋后的疫苗蛋白與佐劑等體積混合。佐劑對照液制備將PBS與佐劑等體積混合。所述 PBS 組成成分按重量百分比計(jì)0. 8% NaCl, O. 02% KCl, O. 358% Na2HPO4. 12H20, O. 024% NaH2PO4，余量為水。
步驟2)疫苗的免疫應(yīng)用。將60條牙鲆(每條重約12. 7g)隨機(jī)分為2組，每組30 條。將這2組分別命名為A和B組。將A組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟I)的疫苗混合液，將B組的每條魚分別腹腔注射IOOu I上述步驟I)的佐劑對照液。
步驟3)鰻弧菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)鰻弧菌C312至OD6tltl為O. 8，然后離心(5000g，4° CMOmi η。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為5xl06cfu/ml。
步驟4)疫苗免疫保護(hù)效應(yīng)檢測。在步驟2)免疫注射后的第30天，用上述步驟3) 的鰻弧菌懸液腹腔注射步驟2)的2組魚，每條魚的注射量為lOOul。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計(jì)各組魚的總死亡數(shù)目A組，6條；B組 ，27 條。利用下列公式計(jì)算相對免疫保護(hù)效率(RPS)
RPS=100x(l —免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)
根據(jù)此公式算出疫苗的免疫保護(hù)效率為78%。因此，所得疫苗能夠高效地保護(hù)牙鲆抵御鰻弧菌侵染。
Untitled. ST25. txtSEQUENCE LISTING!IU屮國科學(xué)浣海洋研究所 <120； 種利詔鰻弧菌鞭毛蛋白的疫]Ti及其應(yīng)W 3 、<iG0>2·<170>PatentTn version 3, I<210>I<211、27<212>歷<213>人工設(shè)訃 \220><221>gone(272、(O.. (27) s223；<400、Icccgggatgc ctaaggagat caatatg27\210/2<211>25<212>MA <213>人丨:設(shè)計(jì)<220><22ngene<222(I)·.(25)<223;<400>2cccgggaccc aatagactaa gagct2權(quán)利要求
1.一種利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗，其特征在于以鰻弧菌為模板，F(xiàn)1/R1為引物所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pET259連接，連接轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒經(jīng)裂解與佐劑混合，即得到利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗；所述引物為 Fl :5’ -CCCGGGATGCCTAAGGAGATCAATATG-3’；R1 :5’ -CCCGGGACCCAATAGACTAAGAGCT-3，。
2.按權(quán)利要求1所述的利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗，其特征在于所述模板為鰻弧菌C312 ;鰻弧菌C312保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 6250，保藏日期2012年6月21日，分類命名為鰻弧菌(Vibrioanguillarum)。
3.按權(quán)利要求1或2所述的利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗，其特征在于以鰻弧菌為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與載體pET259連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α篩選質(zhì)粒，而后加入裂解液純化離心后上清液稀釋后與佐劑等體積混合，即得到利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗。
4.一種權(quán)利要求1所述的利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗的應(yīng)用，其特征在于所述疫苗作為抵御鰻弧菌侵染的疫苗藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其應(yīng)用。以鰻弧菌為模板，F(xiàn)1/R1為引物所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pET259連接，連接轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒經(jīng)裂解與佐劑混合，即得到利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗；所述引物為F15’-CCCGGGATGCCTAAGGAGATCAATATG-3’；R15’-CCCGGGACCCAATAGACTAAGAGCT-3’。本發(fā)明的疫苗對鰻弧菌的免疫保護(hù)效率達(dá)78%。
文檔編號A61P31/04GK102988968SQ201210371870
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者孫黎, 賈盼盼 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所