一種人Annexin V基因優(yōu)化序列及其制作方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種人Annexin V基因優(yōu)化序列及其制作方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人膜聯(lián)蛋白V (Annexin V)是1?離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白一Annexin家庭成員之一。共有320個氨基酸，分子量約35.8 KDa，存在于大多數(shù)真核生物細(xì)胞內(nèi)，在多種組織細(xì)胞(如心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮、骨骼肌、肝細(xì)胞等)中都有表達(dá)。在Ca2+存在時，對酸性磷脂分子有很高的親和力，在體內(nèi)具有多種生理功能，在細(xì)胞中參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜表面一系列依賴于鈣調(diào)蛋白的活動，包括胞吐作用中的膜融合、信號傳導(dǎo)和鈣離子通道的形成、抗凝、抗炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架蛋白間的相互作用等。
[0003]目前Annexin V蛋白主要應(yīng)用在細(xì)胞凋亡檢測領(lǐng)域。細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是由基因調(diào)控的細(xì)胞主動的有序性死亡方式，是生物體調(diào)節(jié)和維持機(jī)體相對平衡的重要方式，與多種疾病病理密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(phosphatidyl — serine，PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜夕卜，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。Annexin V高度特異性親和PS，將Annexin V進(jìn)行熒光素(FITC，Alexa Fluor 488，PE等)或生物素標(biāo)記，可作為一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS，利用流式細(xì)胞儀或者熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。這是目前公認(rèn)的靈敏、高效和特異的凋亡細(xì)胞的檢測方法[Sgonc R，Gruber J.Aptoptosis detect1n:An OverviewExperimental[J].Exp Gerontol，1998，33:525 ?533.]。
[0004]人Annexin V蛋白的應(yīng)用廣泛，但是天然來源的人Annexin V含量低，無法批量提供，商業(yè)上需要大量重組表達(dá)人Annexin V蛋白，但是人Annexin V在大腸桿菌中用普通方法誘導(dǎo)表達(dá)時經(jīng)常以包涵體形式存在，可溶性蛋白產(chǎn)量較低，不符合實(shí)際應(yīng)用的需求。根據(jù)最新研宄報道，人Annexin V產(chǎn)量最高的重組表達(dá)方法是采用流加發(fā)酵的生產(chǎn)方式，在大腸桿菌中產(chǎn)率達(dá)到 28.5mg/lL 培養(yǎng)基[Marder L, S et al.BMC B1technology 2014，14-33]，但對生產(chǎn)設(shè)備和工藝要求較高，不容易擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)。而本專利發(fā)明人利用基因工程技術(shù)，對人Annexin V編碼基因進(jìn)行優(yōu)化，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，用最簡單的生產(chǎn)方法高效表達(dá)可溶性人Annexin V蛋白，一步法純化，重組蛋白產(chǎn)率達(dá)200mg/lL培養(yǎng)基，這一方法可低成本，批量獲得高純度、有生物學(xué)功能的人Annexin V純品，解決了一直以來人Annexin V蛋白難重組表達(dá)的問題，大大降低凋亡檢測試劑盒生產(chǎn)成本，具有很好的市場應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題本發(fā)明提供了一種人Annexin V基因優(yōu)化序列及其制作方法和應(yīng)用。本發(fā)明解決了一直以來人Annexin V蛋白難重組表達(dá)的問題，大大降低凋亡檢測試劑盒生產(chǎn)成本，具有很好的市場應(yīng)用前景。為達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明的技術(shù)方案是: 一種人Annexin V基因優(yōu)化序列，人Annexin V基因優(yōu)化序列的核苷酸序列為SEQ IDNO:1o
一種人Annexin V基因優(yōu)化序列的制作方法，包括如下步驟:
步驟一)在基因數(shù)據(jù)庫中獲取人Annexin V基因；
步驟二)基因優(yōu)化:對人Annexin V基因的編碼區(qū)進(jìn)行大腸桿菌密碼子偏愛性的基因優(yōu)化得到優(yōu)化序列；優(yōu)化序列編碼的氨基酸與人Annexin V基因編碼形成的氨基酸序列一致；
步驟三)添加酶切位點(diǎn):在優(yōu)化序列的Y端添加一種內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在優(yōu)化序列的:V端添加另一種內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，得到合成序列；
步驟四)基因合成:對得到的合成序列進(jìn)行全基因合成。
[0006]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟三)中，優(yōu)化序列的5'端添加NdeI酶切位點(diǎn)，優(yōu)化序列的3'端添加XhoI酶切位點(diǎn)。
[0007]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述步驟二)中的優(yōu)化序列為SEQ ID NO:1。
[0008]一種含有SEQ ID NO:1序列的質(zhì)粒。
[0009]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述質(zhì)粒為pET23a質(zhì)粒。
[0010]進(jìn)一步的改進(jìn)，SEQ ID NO:1序列插入到pET23a質(zhì)粒的NdeI酶切位點(diǎn)和XhoI酶切位點(diǎn)之間。
[0011]一種含有SEQ ID NO:1序列的原核生物。
[0012]進(jìn)一步的改進(jìn)，所述原核生物為大腸桿菌。
[0013]—種上述人Annexin V基因優(yōu)化序列的使用方法，SEQ ID NO:1序列導(dǎo)入大腸桿菌中翻譯為重組蛋白，所述重組蛋白用于檢測細(xì)胞凋亡。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明通過基因優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了人Annexin V基因在原核中高產(chǎn)量可溶性表達(dá)，一步純化及FITC偶聯(lián)標(biāo)記，更驗(yàn)證了優(yōu)化后的人Annexin V基因序列生產(chǎn)的人Annexin V-FITC完全可以替代進(jìn)口試劑盒中的人Annexin V-FITC。尤其重要的是，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了 IL培養(yǎng)基誘導(dǎo)菌體可一步法純化出200mg人Annexin V蛋白，所需設(shè)備和工藝簡單，快速，容易大規(guī)模生產(chǎn)，極大降低了凋亡試劑盒的生產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[0015]圖1人Annexin V重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳圖；
圖2人Annexin V重組蛋白純化SDS-PAGE電泳圖；
圖3A本發(fā)明的人Annexin V-FITC檢測紫外誘導(dǎo)處理30s的細(xì)胞凋亡的檢測圖；
圖3B eB1science的人Annexin V-FITC檢測紫外誘導(dǎo)處理30s的細(xì)胞凋亡的檢測圖；
圖4A本發(fā)明的人Annexin V-FITC檢測紫外誘導(dǎo)處理60s的細(xì)胞凋亡的檢測圖；
圖4B eB1science的人Annexin V-FITC檢測紫外誘導(dǎo)處理60s的細(xì)胞凋亡的檢測圖；
圖5A本發(fā)明的人Annexin V-FITC檢測紫外誘導(dǎo)處理90s的細(xì)胞凋亡的檢測圖；
圖5B eB1science的人Annexin V-FITC檢測紫外誘導(dǎo)處理90s的細(xì)胞凋亡的檢測圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1
一種人Annexin V基因的優(yōu)化的方法:
登錄GeneBank，查找編碼人Annexin V成熟蛋白的基因序列(序列號為GenBank:AK312644.1)，其核苷酸長度為963bp，由于人Annexin V為真核生物蛋白，后續(xù)研宄需要在原核生物中進(jìn)行表達(dá)，因此將上述人Annexin V基因的編碼密碼子與大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行比對，根據(jù)密碼子的兼并性，在不改變氨基酸組成的排列順序的基礎(chǔ)上，對已知的編碼人Annexin V基因序列進(jìn)行改造，將大腸桿菌的某些稀有密碼子替換為大腸桿菌偏愛密碼子，以提高目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平，并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，最后得到的人AnnexinV基因優(yōu)化序列如SEQ ID NO:1所示。
[0017]將人Annexin V基因優(yōu)化序列V端加上NdeI酶切位點(diǎn)，3 '端加上XhoI酶切位點(diǎn)，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行全基因合成，并連入原核表達(dá)載體pET23a(購自Novagen公司)的NdeI酶切位點(diǎn)和XhoI酶切位點(diǎn)之間，得到重組的原核表達(dá)質(zhì)粒 pET23a-ANXV。
[0018]實(shí)施例2
2.1表達(dá)菌株的獲得
將實(shí)施例1中得到的原核表達(dá)質(zhì)粒pET23a-ANXV通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，LB平板培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素至100mg/L進(jìn)行篩選，挑取單菌落進(jìn)行測序鑒定。
[0019]2.2人Annexin V基因優(yōu)化序列在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
挑取含有重組陽性質(zhì)粒的單菌落，接種到含有濃度為100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，按照1%的比例將過夜培養(yǎng)的菌液接種