專利名稱：：經(jīng)改造的間充質(zhì)干細胞和用其治療腫瘤的方法經(jīng)改造的間充質(zhì)干細胞和用其治療腫瘤的方法在本申請全文中引用了多篇出版物。這些出版物的公開內(nèi)容在本文中通過引用被并入到到本申請中，以對本發(fā)明所屬技術(shù)的狀態(tài)進行更全面的描述。
背景技術(shù)：
：一種新理論提出惡性細胞存在于顯著影響惡性表型的發(fā)生和維持的復雜的細胞和細胞外微環(huán)境中。u可以發(fā)現(xiàn)實體瘤由惡性細胞和包含基質(zhì)的支持細胞構(gòu)成，所述包含基質(zhì)的細胞包括成纖維細胞、內(nèi)皮、周細胞、淋巴和通常的單核浸潤。2_6這些基質(zhì)細胞對腫瘤存活的重要性使其成為化學治療性干預的重要靶標。間充質(zhì)干細胞(MSC)是幫助多種組織維持和再生的多能祖細胞7’8?？梢栽谌绻撬琛⒀夯虿煌瑏碓吹拈g充質(zhì)組織的許多組織中發(fā)現(xiàn)MSC，它們在其中作為干細胞的局部來源。MSC有助于損傷后或慢性炎癥期間的組織重構(gòu)。認為受損的組織釋放特定的內(nèi)分泌物，而后這些內(nèi)分泌物調(diào)動多潛能MSC并隨后使其匯集至損傷部位。MSC也被腫瘤基質(zhì)強烈吸弓I。融合到實驗動物血液中的MSC定位至惡性腫瘤。一旦定位，MSC可以形成包括腫瘤血管和基質(zhì)成纖維細胞的包含腫瘤基質(zhì)的多種細胞類型。近期Karnoub等指出，在乳腺癌中，腫瘤部位的MSC釋放一種小蛋白質(zhì),趨化因子CCL5。CCL5可作為多種基質(zhì)細胞的化學引誘劑9_1(1并且其表達與增強的腫瘤新生血管生成相關(guān)。此外，CCL5可通過將多種基質(zhì)細胞類型匯集至原發(fā)腫瘤生長部位來幫助癌的生長和轉(zhuǎn)移。9’n’12近期發(fā)現(xiàn)MSC祖細胞的⑶34_亞群被匯集至正在生長的腫瘤并通過分化為新血管內(nèi)皮細胞(EC)或周細胞來幫助腫瘤的新血管生成。13_15重要的是，在將MSC直接注射入外周循環(huán)后可以觀察到這些和相關(guān)的直接影響。16存在對這樣的基于干細胞的療法的未滿足需求使用基于對細胞毒性蛋白表達而言與腫瘤間質(zhì)組織本身的接近的細胞毒性蛋白表達，而不是基于與正在血管發(fā)生的腫瘤組織的接近的細胞毒性蛋白表達。對于還沒有經(jīng)歷血管生成的轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療，此需求尤為急切。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個實施方案提供用于治療患腫瘤的對象的方法，包括向所述對象的血流中引入治療有效量的遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞，其中每個遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)細胞毒性蛋白編碼區(qū)，其可操作性地連接至(ii)啟動子或啟動子/增強子組合，據(jù)此在所述遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞與腫瘤的間質(zhì)組織接近時選擇性地表達所述細胞毒性蛋白。本發(fā)明的另一實施方案還提供用于本專利申請中公開的任何治療患腫瘤對象的方法的遺傳修飾間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明還提供用于治療患胰腺腫瘤的人對象的方法，包括向所述對象的血流中引入約IXIO5至約IXIO9細胞/kg體重的遺傳修飾的⑶干細胞，其中(a)每個遺傳修飾的CD34—干細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)單純皰疹病毒胸苷激酶編碼區(qū)，其可操作性地連接至(ii)RANTES啟動子，(b)以允許單純皰疹病毒胸苷激酶致使更昔洛韋成為細胞毒性的方式用更昔洛韋治療所述對象，以及(c)在所述遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞的引入之后、同時或之前沒有髓抑制(myeIoabIation)。本發(fā)明還提供包含外源核酸的遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞，所述外源核酸包含(i)細胞毒性蛋白編碼區(qū)，其可操作性地連接至(ii)啟動子或啟動子/增強子組合，據(jù)此在所述遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞與腫瘤的間質(zhì)組織接近時選擇性地表達所述細胞毒性蛋白。本發(fā)明的另一實施方案涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞包含:-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含(i)細胞毒性蛋白編碼區(qū)，所述細胞毒性蛋白編碼區(qū)可操作性地連接至(ii)可由炎癥介質(zhì)誘導的啟動子或啟動子/增強子組合；以及-編碼病毒表面蛋白的基因，所述病毒表面蛋白為間充質(zhì)干細胞或CD34_干細胞提供趨向性。此外所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞還包含編碼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的基因和用于從包裝細胞生成假病毒粒子的酶。最后，本發(fā)明提供包含外源核酸的遺傳修飾的人CD34_干細胞，所述外源核酸包含(i)單純皰疹病毒胸苷激酶編碼區(qū)，其可操作性地連接至(ii)RANTES啟動子。圖I(A)通過位于左側(cè)的Icm切口曝露胰腺。用Iml注射器將150，000Panc02胰腺癌細胞注射入胰腺。(B)手術(shù)后2周，所有小鼠長出可觸知的腫瘤并被隨機分入各個實驗組。圖2用改良的博伊登室分析法(ModifiedBoydenChamberassay)來評估C57B16MSC到源自Panc02細胞的條件培養(yǎng)基的遷移響應。結(jié)果顯示MSC到源自Panc02的生長培養(yǎng)基的劑量依賴性誘導遷移。圖3檢測MSC(被改造為在CMV啟動子的控制下組成性地表達eGFP)滲透植入的Panc02腫瘤的能力。將500,000細胞靜脈內(nèi)注射入有生長的胰腺腫瘤的小鼠，一周三次。在5周后，處死小鼠移出腫瘤并分析GFP的表達。(A)結(jié)果顯示與腫瘤相關(guān)的強GFP表達。(B)發(fā)現(xiàn)在實驗過程中MSC的過繼轉(zhuǎn)移增加植入腫瘤的生長。圖4CCL5啟動子對靶向Panc02腫瘤的MSC提供增加的報告基因表達選擇性。MSC被改造為在CCL5啟動子的控制下表達RFP或eGFP。每周注射500，000細胞持續(xù)三周后，處死動物，通過熒光顯微鏡檢測腫瘤中報告基因的表達。由CCL5驅(qū)動的eGFP(A)和RFP-(B)報告基因均在腫瘤環(huán)境中顯示表達。通過免疫組織化學使用RFP特異多克隆抗體在固定的組織切片上觀察更精細的腫瘤形態(tài)(C和D)。(C)結(jié)果顯示在腫瘤的基質(zhì)區(qū)有RFP的集中表達(100X)。(D+E)在更高的放大倍數(shù)(分別為200X、500X)下類似的腫瘤樣品顯示出腫瘤環(huán)境中顯不RFP報告基因的表達的MSC的大量浸潤。圖5將被改造為CCL5啟動子的控制下表達HSV-TK的MSC與GVC聯(lián)合應用作為胰腺癌的治療模式。(A)用于將MSC改造為表達HSV-TK自殺基因的構(gòu)建體的概示圖。(B)對于治療方案，靜脈內(nèi)注射500，000CCL-5TK改造的MSC。在3天中使細胞匯集至生長的腫瘤并激活TK基因的表達。小鼠接受I天I次的7.5mgGVC的靜脈內(nèi)注射，持續(xù)4天，而后中止I天。然后對小鼠再注射經(jīng)改造的干細胞并在實驗期間重復該循環(huán)。在3次循環(huán)(引入腫瘤36天或第一次注射MSC后21天)后，處死動物并評估腫瘤生長。(C)從用載體對照、經(jīng)改造的MSC對照(RFP、eGFP)和HSV-TK/GCV處理的動物中切取的腫瘤的實例。(D)在實驗過程中HSV-TK/GCV處理導致腫瘤生長的顯著降低。圖6具有若干基因元件實例的轉(zhuǎn)基因盒的示意性概示圖。可誘導啟動子(plnd)連接至細胞毒性蛋白編碼區(qū)。第二組成型細胞或病毒啟動子(PConst)連接至選擇標記基因。兩個單元可以被絕緣子序列分隔(+/_絕緣子)。圖7攜帶用于MSC遺傳修飾的圖6所示轉(zhuǎn)基因盒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的概示圖。載體產(chǎn)生由5’長末端重復(LTR)的U3區(qū)的啟動子活性驅(qū)動。5’U3區(qū)可被其他病毒啟動子替換。包裝信號W幫助載體基因組包囊(incapsidation)到載體顆粒中。對于慢病毒顆粒的產(chǎn)生，需要另外的元件如加速反應元件(revresponsiveelement,RRE)和中央多聚嘌呤區(qū)(cPPT)。任選添加土撥鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(wPRE)有助于增加載體效價和轉(zhuǎn)基因表達。可誘導啟動子(Plnd)連接至細胞毒性蛋白編碼區(qū)。第二組成型細胞或病毒啟動子(PConst)連接至選擇標記基因。兩個單元可以被絕緣子序列分隔(+/_絕緣子)。圖8用于在RANTES啟動子控制下表達HSV_tk的慢病毒載體質(zhì)粒圖譜。圖9用TNFa(10ng/ml)和IFNy(10ng/ml)誘導MSC后的RANTESmRNA的表達。以0小時未誘導樣品作為歸一化值用AACT法計算相對RANTESmRNA量。顯示2個生物樣品的平均值。圖10用更昔洛韋處理hMSC導致在用TNFa和IFNy誘導RANTES啟動子后特異性細胞死亡。未處理的hMSC的代表性顯微圖片(A)、用TNFa和IFNy誘導的hMSC的代表性顯微圖片(B)、僅用更昔洛韋處理的hMSC的代表性顯微圖片(C)或先用TNFa和IFNy誘導而后用更昔洛韋處理的hMSC的代表性顯微圖片(D)。放大倍數(shù)100X。具體實施例方式術(shù)語在本申請中，使用具有下列意義的特定術(shù)語。當在本文中使用時，如果細胞或任何其前體細胞來自于相同物種的另一對象則該細胞是相對于對象的“異體”細胞。當在本文中使用時，如果細胞或其前體細胞來自于相同對象則該細胞是相對于所述對象的“自體”細胞。當在本文中使用時，“⑶34_干細胞”是指在其表面缺乏⑶34的干細胞。⑶34_干細胞及其分離方法在如LangeC.等，Acceleratedandsafeexpansionofhumanmesenchymalstromalcellsinanimalserum-freemediumfortransplantationandregenerativemedicine.J.CellPhysiol.2007年4月25日[印刷前的電子出版]中進行了描述。當在本文中使用時，“細胞毒性蛋白”是指當在細胞內(nèi)、細胞上和/或在細胞附近存在時直接和/或間接導致細胞死亡的蛋白質(zhì)。細胞毒性蛋白質(zhì)包括，例如自殺蛋白(例如HSV-tk)和凋亡誘導物。細胞毒性基因包括用于基因敲除(例如CCR5-/-)的零基因、siRNA或miRNA。已識別了多種自殺基因系統(tǒng)，包括單純皰疹病毒胸苷激酶基因、胞嘧啶脫氨酶基因、水痘帶狀皰疫病毒胸苷激酶基因、硝基還原酶基因、大腸桿菌(Escherichiacoli)gpt基因和大腸桿菌Deo基因。胞嘧啶脫氨酶；細胞色素P450;嘌呤核苷磷酸化酶；羧肽酶G2；硝基還原酶。如在YazawaK,FisherWE,BrunicardiFCCurrentprogressinsuicidegenetherapyforcancer.WorldJSurg.2002Jul；26(7):783-9中詳細描述的。細胞毒性因子包括以下(i)回歸因子如趨化因子和粘蛋白趨化因子GPI融合物(趨化因子衍生試劑可用于促進經(jīng)改造干細胞的定向匯集，參見例如關(guān)于GPI錨定粘蛋白融合物的PCT國際申請NO.PCT/EP2006/011508)；(ii)作為細胞毒性蛋白的病毒抗原(麻疹、雞痘)；和(iii)在施用Her2/neu抗體和針對⑶52表位的CamPath(阿倫單抗)后能夠存在于經(jīng)改造干細胞表面上的Her2/neu抗原。當在本文中使用時，如果核酸被人工引入細胞或任何該細胞的前體細胞則核酸相對于該細胞是“外源的”。當在本文中使用，如果干細胞或任何其前體細胞具有人工引入其中的核酸則該干細胞是“遺傳修飾的”。用于產(chǎn)生遺傳修飾干細胞的方法包括使用病毒或非病毒基因轉(zhuǎn)移(例如質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、噬菌體整合酶、轉(zhuǎn)座子、AdV、AAV和慢病毒)。當在本文中使用時，將干細胞“引入”對象的血流包括但不限于通過注射將該細胞引入對象的一條靜脈或動脈。這種施用也可以進行例如一次、多次和/或在一段或更多段時間內(nèi)進行。優(yōu)選單次注射，但在一些情況下可能需要在一段時間內(nèi)(例如每天、每三天、每周、每兩周、每月、每季度、每半年或每年)重復注射。這種施用還優(yōu)選使用干細胞和藥學可接受的載體的混合物進行。藥學可接受的載體對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的并且包括但不限于0.01-0.IM并優(yōu)選0.05M的磷酸鹽緩沖液或0.8%鹽水。此外，這種藥學可接受的載體可以是水性或非水性的溶液、混懸液和乳液。非水性溶劑的實例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射有機酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液和混懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載劑包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化林格氏溶液和固定油。靜脈內(nèi)載體包括流體和營養(yǎng)補充劑、電解質(zhì)補充劑如林格氏葡萄糖、基于林格氏葡萄糖的載體等。常用于靜脈內(nèi)施用的流體例如在Remington(34)中查找。還可以存在防腐劑或其他添加劑如抗菌劑、抗氧化劑、鰲合劑、惰性氣體等?！伴g充質(zhì)干細胞”(也稱為“MSC”)可以生成結(jié)締組織、骨、軟骨和循環(huán)系統(tǒng)與淋巴系統(tǒng)細胞。間充質(zhì)干細胞存在于間充質(zhì)中，它是由松散聚集的紡錘形或星形未分化細胞組成的胚胎中胚層的一部分。當在本文中使用時，間充質(zhì)干細胞包括但不限于0034_干細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，MSC在Horwitz等49中被定義為多能間充質(zhì)基質(zhì)細胞的成纖維細胞樣塑性粘附細胞，并且也包括CD34—細胞。為了避免任何疑問，術(shù)語“多能間充質(zhì)基質(zhì)細胞”還包括間充質(zhì)干細胞及其前體的亞群，所述亞群由能夠在體內(nèi)分化成特定的多種細胞類型的多能自我更新細胞構(gòu)成。當在本文中使用時，“髓抑制”是指由例如施用高劑量的化學治療或放射治療引起的骨髓細胞的嚴重或完全缺失。髓抑制是標準過程并在如Deeg(33)中進行了描述。當在本文中使用時，“核酸”是指任何核酸分子，包括但不限于DNA、RNA及其雜交體。形成核酸分子的核酸堿基可以是堿基A、C、G、T和U及其衍生物。這些堿基的衍生物在本領(lǐng)域公知并且在PCRSystems,ReagentsandConsumables(PerkinElmerCatalogue1996-1997,RocheMolecularSystems,Inc.，Branchburg,N.J.，USA)中不例。當在本文中使用時，如果啟動子或啟動子/增強子組合在合適的環(huán)境下引起細胞毒性蛋白的表達，則該細胞毒性蛋白編碼核酸區(qū)被“可操作性地連接”至啟動子或啟動子/增強子組合。當在本文中使用時，“多肽”是指氨基酸殘基的聚合物?！半摹蓖ǔＪ侵篙^短的多肽(例如10個氨基酸殘基)，“蛋白質(zhì)”通常是指較長的多肽(例如200個氨基酸殘基)。氨基酸殘基可以是天然存在的或者其化學類似物。多肽還可以包含修飾，如糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、羥基化和ADP-核糖基化。當在本文中使用時，與組織“接近”包括例如距所述組織Imm內(nèi)、距所述組織0.5mm內(nèi)和距所述組織0.25mm內(nèi)。本文所用術(shù)語“RANTES”啟動子與術(shù)語“CCL5”啟動子同義。當在本文中使用時，當編碼細胞毒性蛋白的遺傳修飾間充質(zhì)干細胞接近腫瘤基質(zhì)組織時，如果在該區(qū)域中細胞毒性蛋白的表達比對象中任何其他區(qū)域的表達多，則細胞毒性蛋白是被“選擇性地表達”的。優(yōu)選地，與對象中任何其他區(qū)域的表達相比，細胞毒性蛋白在該區(qū)域的表達大至少10倍。當在本文中使用時，術(shù)語“對象”是指任何動物，如人、非人靈長類動物、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。當在本文中使用時，“治療”患疾病的對象是指減緩、停止或逆轉(zhuǎn)疾病的進展。在一個優(yōu)選的實施方案中，治療患疾病的對象是指逆轉(zhuǎn)疾病的進展，理想的是達到消除疾病本身的程度。當在本文中使用時，改善疾病和治療疾病是等同的。當在本文中使用時，“腫瘤”包括但不限于前列腺腫瘤、胰腺腫瘤、鱗狀上皮細胞癌、乳腺腫瘤、黑素瘤、基底細胞癌、肝細胞癌、睪丸癌、神經(jīng)母細胞瘤、膠質(zhì)瘤或惡性星形細胞瘤如多形性膠質(zhì)母細胞瘤、結(jié)直腸腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、卵巢腫瘤、子宮頸腫瘤、骨肉瘤、橫紋肌/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、尤文氏肉瘤/PNET和惡性淋巴瘤。這些包括原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤(血管化的和非血管化的)。當在本文使用時，如果細胞或任何其前體細胞來自不同物種的另一對象則該細胞相對于對象是“異種”的。當在本文中使用時，術(shù)語“腫瘤的基質(zhì)組織”包括腫瘤附近的結(jié)締組織和結(jié)構(gòu)組織，它們包含多種細胞如成纖維細胞/肌成纖維細胞、膠質(zhì)細胞、上皮細胞、脂肪細胞、血管細胞、平滑肌細胞和免疫細胞。腫瘤基質(zhì)還提供細胞外基質(zhì)和細胞外分子53。當在本文中使用時，術(shù)語“炎癥介質(zhì)”包括在組織損傷和腫瘤生長部位發(fā)揮作用并介導對組織損傷和腫瘤生長的促炎性和抗炎性應答的免疫調(diào)節(jié)分子。炎癥介質(zhì)的非限制性實例有趨化因子和類二十烷酸。已知腫瘤細胞和周圍的基質(zhì)細胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)炎性反應的多種促炎性介質(zhì)如促炎性趨化因子和蛋白酶。這些介質(zhì)的實例為TNFa和IL-6。另外，腫瘤細胞和基質(zhì)細胞能通過分泌抗炎性分子如TGFP、IL-10和M-CSF來抑制免疫應答，它們例如抑制樹突狀細胞成熟54。本發(fā)明一些實施方案本發(fā)明提供用于治療患腫瘤的對象的方法，所述方法包括向所述對象的血流中弓I入治療有效量的遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞，其中每個遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含a)細胞毒性蛋白編碼區(qū)，所述細胞毒性蛋白編碼區(qū)可操作性地連接至ai)啟動子或啟動子/增強子組合，據(jù)此當所述遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞與所述腫瘤的基質(zhì)組織接近時，選擇性地表達所述細胞毒性蛋白。被治療的對象可以是任何動物，優(yōu)選為人。被治療的腫瘤可以是原發(fā)性的或轉(zhuǎn)移性的，并且可以是血管化的或非血管化的。優(yōu)選地，腫瘤是轉(zhuǎn)移性的并且是非血管化的。例如腫瘤可以是前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、胰腺腫瘤、鱗狀上皮細胞癌、乳腺腫瘤、黑素瘤、基底細胞癌、肝細胞癌、睪丸癌、神經(jīng)母細胞瘤、膠質(zhì)瘤或惡性星形細胞瘤如多形性膠質(zhì)母細胞瘤、結(jié)直腸腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、卵巢腫瘤、子宮頸腫瘤、骨肉瘤、橫紋肌/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、尤文氏(Ewing)肉瘤/PNET和惡性淋巴瘤。優(yōu)選地，所述腫瘤是胰腺腫瘤。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述治療腫瘤的基質(zhì)組織包含成纖細胞樣細胞?？梢詮亩喾N來源分離間充質(zhì)干細胞例如骨髓、臍帶血、(動員的)外周血和脂肪組織49。在另一優(yōu)選的實施方案中，遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞是CD34—干細胞。另外，遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞相對于對象可以是異體的、自體的或異種的。在使用遺傳修飾干細胞的本發(fā)明方法中，當干細胞⑴接近靶組織的適當細胞，(ii)分化，和/或(iii)與靶組織中的適當細胞融合時，外源基因被表達，即被“啟動”。在本發(fā)明中，優(yōu)選在遺傳修飾間充質(zhì)干細胞的弓I入之后、同時或之前沒有髓抑制。本發(fā)明的另一實施方案提供用于在治療患腫瘤對象的任何方法中使用的間充質(zhì)或CD34_干細胞。特別是，所述間充質(zhì)或CD34_干細胞可以包含啟動子或啟動子/增強子組合，所述啟動子或啟動子/增強子組合可以由炎癥介質(zhì)誘導并控制細胞毒性蛋白編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄。這些炎癥介質(zhì)可由腫瘤的基質(zhì)組織釋放，從而在干細胞接近腫瘤基質(zhì)組織時誘發(fā)細胞毒性蛋白在間充質(zhì)干細胞中的表達。例如炎癥介質(zhì)可以是趨化因子，如TNFa或IFNY。特別是，啟動子可以是RANTES啟動子，其特別地被TNFa或IFNY誘導35。在MSC分化環(huán)境中RANTES啟動子也可以被分化信號誘導?？杀淮傺装Y介質(zhì)誘導的啟動子的其他實例有NF-kB-應答元件36和可由ILlP或TNFa37誘導的通用啟動子。此外，由抗炎癥介質(zhì)(例如TGF-P)激活的啟動子可用于在間充質(zhì)干細胞中實現(xiàn)細胞毒性蛋白的靶向表達。實例有包含Smad結(jié)合元件的啟動子55。使用可由炎癥介質(zhì)誘導的啟動子能夠選擇性地治療未經(jīng)歷血管生成的腫瘤。用于本發(fā)明任何治療方法的干細胞還可以包含(iii)選擇標記基因，所述選擇標記基因可操作性地連接至(iv)組成型啟動子或啟動子/增強子組合。選擇標記基因可以包括抗生素抗性基因，如提供嘌呤霉素、新霉素和哇巴因抗性的基因38?？墒褂每股乜剐曰驈亩诳股卮嬖谙逻x擇遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞并抑制未修飾的間充質(zhì)干細胞，后者由于促進腫瘤的可能性不應被用于腫瘤治療。另外或作為抗生素抗性基因的替代物，可以使用編碼表面標記蛋白的基因，該蛋白只在遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞表面表達。表面標記蛋白的非限制性實例是⑶34和⑶24的剪接變體39_4°?？梢允褂脭y帶識別表面標記蛋白之特異抗體的磁珠以選擇遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞41?？刂七x擇標記基因轉(zhuǎn)錄的組成型啟動子可以是多種不同的啟動子如pCAG42、EFla43、PGK42,CMV和SFFV42。此外，本發(fā)明的各種實施方案的干細胞可以包含(V)位于細胞毒性蛋白編碼區(qū)和選擇標記基因之間的絕緣子序列。絕緣子序列可以保證選擇標記基因的組成型啟動子不會在不存在任何炎性介質(zhì)的情況下影響和“啟動”細胞毒性蛋白編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄44。優(yōu)選地，將可操作性地連接至啟動子或啟動子/增強子組合的細胞毒性蛋白編碼區(qū)和可操作性地連接至組成型啟動子或啟動子/增強子組合的選擇標記基因整合于干細胞基因組中。這能產(chǎn)生比攜帶染色體外的載體的遺傳修飾干細胞更穩(wěn)定的遺傳修飾間充質(zhì)干細胞。在本發(fā)明的另一實施方案中，遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞還包含整合到干細胞基因組的前病毒序列，其中可操作性地連接至啟動子或啟動子/增強子組合的細胞毒性蛋白編碼區(qū)和可操作性地連接至組成型啟動子或啟動子/增強子組合的選擇標記基因是前病毒序列的一部分。特別是，可使用來自逆轉(zhuǎn)錄病毒科家族的病毒來穩(wěn)定遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒的實例有慢病毒、a逆轉(zhuǎn)錄病毒或Y逆轉(zhuǎn)錄病毒。以下將描述包含具有兩個功能性單元的轉(zhuǎn)基因盒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(圖6)。兩個功能性單元為I.體外選擇連接至選擇標記基因如抗生素抗性基因(例如嘌呤霉素抗性基因)或適于磁珠分離的表面標記基因(例如CD34)的細胞或病毒源性組成型啟動子(例如CAG啟動子)。2.旁觀殺死(by-standerkilling):連接至細胞毒性蛋白編碼區(qū)(例如單純皰疫胸苷激酶的編碼區(qū))的細胞或病毒源性可誘導腫瘤特異啟動子(例如RANTES啟動子)。任選地，可用絕緣子序列分隔功能單元以防止兩個啟動子之間的啟動子干擾。上述轉(zhuǎn)基因盒會被整合到用于在MSC中遞送和穩(wěn)定表達的多種病毒和非病毒載體系統(tǒng)中，如衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒載體系統(tǒng)。用于MSC遺傳修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體源自a-、Y-逆轉(zhuǎn)錄病毒或(人或非人)慢病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)包含轉(zhuǎn)化載體骨架，其攜帶關(guān)注的轉(zhuǎn)基因，即細胞毒性蛋白編碼區(qū)和載體DNA逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的所有序列元件，但缺乏大部分或全部病毒基因，如gag-、pol-和env-基因。最新一代的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶特別安全的修飾在這些所謂的自失活(SIN)載體中，部分或完全地去除了3’U3區(qū)以關(guān)閉病毒啟動子活性并防止宿主細胞基因組中臨近基因的反式激活5°。對于載體顆粒的產(chǎn)生，需要反式提供結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、酶和包膜蛋白的多種輔助質(zhì)粒5°?？僧a(chǎn)生攜帶外源包膜糖蛋白的病毒顆粒。該過程稱為假型包裝(pseudotyping)。其允許改變載體顆粒的向性并且在某些情況下增強載體效價。上述轉(zhuǎn)基因盒會通過使用標準分子生物學方法被插入SIN-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架并根據(jù)標準方法產(chǎn)生病毒顆粒5°。圖7顯示a-和Y-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體構(gòu)建體的示例性概示圖，該構(gòu)建體攜帶圖6中所述的轉(zhuǎn)基因。計劃用淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMVGP)、水皰性口膜炎病毒(VSV-g)、RD114-TR或長臂猿白血病病毒(GALVenv)的糖蛋白來假型包裝載體顆粒。遺傳修飾間充質(zhì)干細胞的另一替代性方法是化學(例如脂質(zhì)體(Iipofectamin))或物理(例如電穿孔)轉(zhuǎn)染。之后可按照上述從轉(zhuǎn)染細胞中選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSC，其中轉(zhuǎn)基因盒隨機整合到間充質(zhì)干細胞基因組中。遺傳修飾MSC的另一替換性方法是通過使用衍生自轉(zhuǎn)座子的非病毒載體系統(tǒng)。在使上述表達盒與末端反相重復側(cè)翼相接之后，可通過轉(zhuǎn)染將構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至MSC中。如果在轉(zhuǎn)染中反式表達了轉(zhuǎn)座酶如睡美人(SleepingBeauty)51或Piggybac轉(zhuǎn)座因子52,則表達盒會穩(wěn)定整合到MSC的基因組中。本發(fā)明一些實施方案的遺傳修飾間充質(zhì)干細胞可以通過用假型包裝的病毒粒轉(zhuǎn)導天然間充質(zhì)干細胞來制備，所述病毒粒在其表面表達改變病毒粒向性并通常改變其效價的外源糖蛋白。假型包裝的病毒?？稍谀孓D(zhuǎn)錄病毒包裝細胞的協(xié)助下產(chǎn)生，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞包含-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其包含⑴細胞毒性蛋白編碼區(qū)，所述細胞毒性蛋白編碼區(qū)可操作性地連接至(ii)可由炎癥介質(zhì)誘導的啟動子或啟動子/增強子組合，和-編碼病毒表面蛋白的基因，所述病毒表面蛋白為間充質(zhì)干細胞或CD34-干細胞提供趨向性的。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞還包含用于從包裝細胞產(chǎn)生假型包裝病毒粒的結(jié)構(gòu)蛋白和酶編碼基因，例如gag-、pol-和env-基因，它們能組裝假型包裝的病毒粒。優(yōu)選地，編碼結(jié)構(gòu)蛋白和酶的這些基因和編碼為間充質(zhì)或CD34-干細胞提供向性的病毒表面蛋白的基因位于不同的載體上以產(chǎn)生具有感染性但不能復制的病毒粒。這些假型包裝的病毒粒攜帶細胞毒性蛋白編碼區(qū)，所述細胞毒性蛋白編碼區(qū)可操作性地連接至(ii)啟動子或啟動子/增強子組合并表達病毒表面蛋白。通常含有假型包裝病毒粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞的上清液用于轉(zhuǎn)導間充質(zhì)干細胞。編碼為間充質(zhì)或CD34-干細胞(假型包裝的)提供向性的病毒表面蛋白的基因可以是提供廣泛宿主向性的多種糖蛋白如淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMVGP)45、水皰性口膜炎病毒(VSV-g)45、RDl14-TR46或長臂猿白血病病毒(GALVenv)47。如以上所述，啟動子或啟動子/增強子組合可被趨化因子或其他炎癥介質(zhì)誘導。在一個優(yōu)選的實施方案中，啟動子為RANTES啟動子。逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞還可以包含其他基因和啟動子。在本發(fā)明的另一具體實施方案中，理想的細胞毒性蛋白為單純皰疹病毒胸苷激酶，并且理想地以允許單純皰疹病毒胸苷激酶使更昔洛韋成為細胞毒性的方式用更昔洛韋治療所述對象。更昔洛韋和其使用方法是本領(lǐng)域已知的。還可以用胞嘧啶脫氨酶作為細胞毒性蛋白，其將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為毒性化合物5-氟尿嘧啶48。在本發(fā)明中，遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞的治療有效量包括但不限于以下量和量的范圍⑴約IXIO5至約IXIO9細胞/kg體重;(ii)約IXIO6至約IXIO8細胞/kg體重；(iii)約5XIO6至約2父107細胞/1^體重；(“)約5XIO6至約IXIO7細胞/kg體重；(v)約IXIO7至約2XIO7細胞/kg體重；(vi)約7XIO6至約9XIO6細胞/kg體重；(vii)約IXIO5細胞/kg體重；(viii)約IXIO6細胞/kg體重；(ix)約5XIO6細胞/kg體重；(x)約IXIO7細胞/kg體重；(xi)約6XIO6細胞/kg體重；(xii)約7XIO6細胞/kg體重；(xiii)約8XIO6細胞/kg體重；和(ix)約9XIO6細胞/kg體重。預想的人體重包括但不限于約50kg;約60kg;約70kg;約80kg;約90kg;和約100kg。這些數(shù)值是建立在MSC移植的臨床如動物實驗和標準實驗方案的基礎(chǔ)上。本發(fā)明還提供用于治療患胰腺腫瘤的人對象的方法，所述方法包括向所述對象的血流中引入約5XIO6至約2XIO7細胞/kg體重的遺傳修飾的⑶干細胞，其中(a)每個遺傳修飾的⑶34—干細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)單純皰疹病毒胸苷激酶編碼區(qū)，所述單純皰疹病毒胸苷激酶編碼區(qū)可操作性地連接至(ii)RANTES啟動子，(b)以允許單純皰疹病毒胸苷激酶使更昔洛韋成為細胞毒性的方式用更昔洛韋治療所述對象，和(c)在所述遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞的引入之后、同時或之前沒有髓抑制。在該方法中，腫瘤優(yōu)選為轉(zhuǎn)移性的，并且可以是血管化的或非血管化的。此外，遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞相對于所述對象可以是異體的、自體的或異種的。本發(fā)明還提供包含外源核酸的遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞，所述外源核酸包含(i)細胞毒性蛋白編碼區(qū)，所述細胞毒性蛋白編碼區(qū)可操作性地連接至(ii)啟動子或啟動子/增強子組合，據(jù)此當所述遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞與腫瘤的基質(zhì)組織接近時，選擇性地表達所述細胞毒性蛋白。優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細胞是人0034_干細胞。還優(yōu)選的是包含RANTES啟動子的外源核酸，其中所述細胞毒性蛋白是單純皰疹病毒胸苷激酶。最后，本發(fā)明提供包含外源核酸的遺傳修飾的人CD34—干細胞，所述外源核酸包含(i)單純皰疹病毒胸苷激酶編碼區(qū)，所述單純皰疹病毒胸苷激酶編碼區(qū)可操作性地連接至(ii)RANTES啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地獲得本發(fā)明中使用的多種蛋白質(zhì)和調(diào)控序列。例如RANTES啟動子在(22)中公開，并且可通過普通技術(shù)獲得。HSVTK-V00467皰疹病毒基因可用作胸苷激酶(ATP:5’胸苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，e.c.2.7.I.21)(類型I菌株CL101)。參照以下的詳細實驗會更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地理解具體的詳細實驗只是對權(quán)利要求中更全面描述的本發(fā)明的示例。詳細實驗概述目的為了分析基于經(jīng)改造的間充質(zhì)干細胞的療法對胰腺腫瘤基質(zhì)的效力。背景數(shù)據(jù)概述間充質(zhì)干細胞(MSC)被主動匯集至腫瘤基質(zhì)，在那里它們增強腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。已證明腫瘤基質(zhì)中MSC對趨化性細胞因子CCL5的上調(diào)在該過程中起中心作用。鼠MSC被改造為在CCL5啟動子控制下表達報告基因或治療性基因，并過繼轉(zhuǎn)移至具有生長的胰腫瘤的小鼠中。然后評價對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。方法用RANTES啟動子驅(qū)動的紅色熒光蛋白(RFP)、增強綠色熒光蛋白(eGFP)或單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(tk)基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染從C57/B16p53(-/_)小鼠骨髓分離的MSC。對攜帶原位同源胰Panc02腫瘤的小鼠每周I次靜脈內(nèi)施用MSC，持續(xù)3周。結(jié)果在經(jīng)處理的胰腫瘤樣品中通過熒光檢測到CCL5啟動子驅(qū)動的eGFP和RFP信號。在施用干細胞后5-7天用前藥更昔洛韋(GCV)腹腔內(nèi)處理的HSV-tk治療組導致原發(fā)胰腺腫瘤生長減少50%(p<0.0003，學生t檢驗)并降低肝轉(zhuǎn)移(30%相對于100%)。結(jié)論用eGFP-和RFP報告基因確認MSC到原發(fā)胰腺腫瘤基質(zhì)的主動回歸和RANTES啟動子的激活。在更昔洛韋的存在下，HSV-tk轉(zhuǎn)染的MSC導致原發(fā)胰腺腫瘤生長和轉(zhuǎn)移發(fā)生的顯著降低。材料和方法間充質(zhì)干細胞按照所述的從p53靶向刪除的純合C57BL/6小鼠骨髓分離間充質(zhì)干細胞。15細胞在細胞培養(yǎng)基中粘附連續(xù)生長。在亞克隆后，選擇單細胞克隆并表征。15用連接至CCL5啟動子的紅色熒光蛋白(RFP)、綠色熒光蛋白(eGFP)或HSV胸苷激酶轉(zhuǎn)染細胞。啟動子序列占用上游區(qū)域的-972和完全5’非翻譯區(qū)。18此外，所有載體包含CMV控制的Bsr2殺稻瘟菌素抗性基因。以5yg/ml的濃度使用殺稻瘟菌素選擇轉(zhuǎn)染細胞。在注射入小鼠前，從培養(yǎng)瓶中脫離細胞，用PBS清洗2次并在PBS中重新混懸。改良的博伊登室分析法用改良的博伊登室分析法進行體外定向MSC遷移。15干細胞逆Panc02同源胰腺腫瘤細胞上清液濃度降低的方向遷移。原位胰癌模型C57BL6小鼠得自Jackson實驗室。所有動物實驗在巴伐利亞州動物保護委員會的專門允許下進行。將平均重量約20g的2月齡至3月齡C57BL/6小鼠用于Panc02(與C57BL/6小鼠同源)胰腺腫瘤的植入。19用開他敏(100mg/kg體重)、甲苯噻嗪(5mg/kg體重)和阿托品麻醉小鼠。將小鼠左側(cè)的手術(shù)部位剃毛并以無菌方式準備。通過左側(cè)Icm的切口暴露胰。用校準推鈕裝置(購自HamiltonSyringe公司，USA)和有30G針頭的Iml注射器(均購自BDBiosciences公司，Spain)將150，000Panc02胰癌細胞的40ulPBS溶液注射入胰腺。小心操作以保證沒有胰癌細胞散布到腹膜。為此，在將針抽出胰后在注射部位輕柔地壓上棉簽(Q-tip)I分鐘。注射腫瘤細胞后，用4-0縫線(購自BraunAG公司，Germany)間斷縫術(shù)閉合腹腔和皮膚。手術(shù)后2周，所有小鼠均生長出可觸知的腫瘤，并隨機分配入各個實驗組。組A不接受干細胞或更昔洛韋注射，組B接受未修飾的干細胞，組C接受C57BL/6p53-/-CCL5/HSV_tk+間充質(zhì)干細胞和GCV注射，組D接受C57BL/6p53-/-CCL5/RFP+間充質(zhì)干細胞，組E接受C57BL/6p53-/-CCL5/eGFP間充質(zhì)干細胞。所有干細胞注射的劑量為0.5XIO6細胞/周，并經(jīng)尾靜脈施用。組C的GCV(Cymeven，購自Roche公司，Germany)注射劑量為I.5mg,是在干細胞注射后5至7天腹腔內(nèi)施用。在3次處理循環(huán)后處死全部小鼠，分離腫瘤并稱重。用對獨立樣品的未配對雙尾t-檢驗獲得統(tǒng)計學顯著性。突光顯微鏡觀察將胰腺腫瘤組織樣品包埋在Tissue-Tek0.C.T.(購自MilesInc.公司USA)中并在液氮中快速冷凍。獲得5um厚的低溫切片。向切片上加入DAPI核染色溶液(Vectashield“HardsetmountingmediumwithDapi”,USA),立即評測GFP或RFP突光信號。用AxioCam顯微照相機獲得照片,用Photoshop(Adobe,USA)軟件重疊不同突光通道的圖像。MSC注射和更昔洛韋處理在注射前，計數(shù)細胞并稀釋至IXIO6細胞/mlPBS的終濃度。在H2O(注射用水(aquaadiniectabilia))中溶解更昔洛韋(GCV)(Cymeven；Roche)至濃度為10mg/ml。細胞混懸液用26G針頭經(jīng)尾靜脈施用，藥物經(jīng)腹腔內(nèi)注射施用。在第I天開始處理，注射0.5ml細胞(500，000細胞)。在第5至7天，每天以60ug/g體重(例如對體重25g的小鼠為150yl)的劑量施用更昔洛韋。在第7天后，重復處理循環(huán)直至解剖。在處理期間記錄腫瘤進展和行為。組織和腫瘤制備在解剖后，所有腫瘤均獨立第制備。每個腫瘤的三分之一用甲醛固定并包埋在石蠟中，而將另外的三分之一快速冷凍。剩下的三分之一根據(jù)制造商說明保存在RNAlater溶液(Ambion)中以備以后的RNA分離和預期的qRT-PCR分析。免疫組織化學如之前所述在5Um切片上進行免疫組織化學。2°對于第一抗體，將多克隆兔抗RFP抗體(MblMedicalandBiologicalLaboratories,Japan)以I:5O在封閉溶液(乳+超級塊(superblock))中稀釋。對于第二抗體，將多克隆生物素化山羊抗兔(Linaris,Wertheim-Bettingen,Germany)抗體以I:300稀釋在乳中。結(jié)果MSC到胰腺腫瘤的匯集之前在C57B1/6小鼠背景下建立了同源原位鼠胰腺腫瘤。31’32植入于胰被膜下的腫瘤細胞生長并顯示出深入的腫瘤血管組織(圖I)。用從P53(-/_)骨髓分離的⑶3411SC評價經(jīng)改造的MSC對腫瘤基質(zhì)的靶向效力。15’16’21首先為了評價MSC對Panc02腫瘤的總體向性，使用了改良的博伊登室分析法來研究C57B16MSC向腫瘤衍生因子的誘導遷移。結(jié)果顯示響應于增高水平的條件腫瘤培養(yǎng)基的MSC劑量依賴性遷移(圖2)。然后在CMV啟動子控制下用含有綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒改造細胞。一周一次，將500，000個細胞靜脈內(nèi)注射入具有生長的胰腺腫瘤的小鼠中。5周后處死小鼠，取出腫瘤并分析GFP表達。結(jié)果顯示與腫瘤相關(guān)的強GFP表達(圖3A)。還發(fā)現(xiàn)細胞遷移至二級脾、淋巴結(jié)、胸腺、皮膚和膽(數(shù)據(jù)未示出，(15))。這證明全身注射的干細胞回歸至生長的腫瘤。對具有生長的胰腺腫瘤的C57B16小鼠靜脈內(nèi)注射MSC也導致腫瘤生長的顯著增加(圖3B)。還評價了靜脈內(nèi)施用的MSC對至肝、脾和腹膜轉(zhuǎn)移的作用。發(fā)現(xiàn)施用MSC顯著增加對腹膜的轉(zhuǎn)移(表I)。CCL5啟動子驅(qū)動腫瘤基質(zhì)中的報告基因表達然后我們研究了在使用CCL5使MSC匯集至腫瘤基質(zhì)的條件下驅(qū)動更加受控制的報告基因表達的可能性。為此，在CCL5啟動子控制下用RFP和eGFP報告基因改造P53(-/-)MSCC57/B16細胞系。18’22CCL5啟動子通常在組織壓力或損傷的環(huán)境中在多種組織類型中有活性。23_27緊靠-972上游的核苷酸和起始翻譯的完全5’非翻譯區(qū)被克隆進載體中的eGFP或RFP上游。所得的CCL5_eGFP或RFP穩(wěn)定改造的MSC經(jīng)FACS顯示弱但可檢測的報告子表達水平(數(shù)據(jù)未顯示)。然后每8天將細胞(500，000)注射入具有生長的胰腺腫瘤的小鼠的外周循環(huán)中，持續(xù)21天。3周后處死小鼠，通過熒光顯微鏡觀察和免疫組織化學分析腫瘤和周圍組織的RFP和eGFP報告基因表達。所得結(jié)果顯示了生長腫瘤中RFP和GFP熒光的表達(圖4A和圖4B)。為了更好地檢查組織樣品中RFP表達的形態(tài)，通過免疫組織化學檢測甲醛固定樣品的RFP蛋白質(zhì)表達。在腫瘤基質(zhì)中檢測到表達RFP的MSC(圖4C、圖4D和圖4E)。在經(jīng)改造的MSC中使用HSV-tk作為治療模式在下一階段的試驗中，檢測了使用CCL5啟動子的治療性基因的遞送。為此，將單純皰疹胸苷激酶(HSV-Tk)28基因克隆在CCL5啟動子之后(圖5A)。在注射0.5X106個CCL5_tk改造MSC后，用3天使細胞匯集至生長的腫瘤基質(zhì)，進行分化和隨后的tk基因表達。然后小鼠接受由一天一次腹膜內(nèi)注射I.5mgGVC(進行3天)組成的療程。然后對小鼠再次注射經(jīng)改造的干細胞，然后在實驗持續(xù)期間重復循環(huán)(圖5B)。36天后，處死動物并評價腫瘤生長(圖5C和圖OT)。結(jié)果顯示與具有未接受處理或接受對照MSC(CCL5-RFPMSC和CCL5_eGFPMSC)的腫瘤的對照動物相比，接受治療性CCL5/HSV-Tk干細胞構(gòu)建體和GCV的小鼠組腫瘤體積顯著減小。圖5C顯示試驗完成后切取的代表性腫瘤。腫瘤重量與未處理或處理的對照動物相比顯示統(tǒng)計學顯著降低。作為另外的參數(shù)，分析了處理的情況下肝、脾和腹膜的轉(zhuǎn)移。盡管施用MSC增加腹膜中轉(zhuǎn)移的量，但是用GCV處理導致脾和肝轉(zhuǎn)移的顯著降低(雙尾Fisher’s精確測試)(表2)。通過檢視脾、肝和腹膜并觸摸相應器官來評估轉(zhuǎn)移。討論間充質(zhì)干細胞主動匯集至腫瘤基質(zhì)，在腫瘤基質(zhì)中它們對腫瘤生長的多個方面做出貢獻。MSC可以作為腫瘤血管的前體細胞發(fā)揮作用，還似乎對基質(zhì)成纖維細胞樣細胞產(chǎn)生有貢獻。腫瘤相關(guān)基質(zhì)細胞對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移潛能的具體影響是目前正在研究的問題。在乳癌(mamma-carcinoma)模型的臨床前研究中，證明腫瘤基質(zhì)中的間充質(zhì)干細胞(MSC)產(chǎn)生增加水平的細胞因子CCL5。CCL5的分泌導致肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率升高。在胰腺泡周(periacinar)肌成纖維細胞中CCL5的分泌也被區(qū)別地調(diào)控,這暗示這些細胞在介導浸潤和胰中炎性細胞累積中的作用。29在患胰腺癌的患者中，胰腺炎與CCL5啟動子多態(tài)性顯著相關(guān)。3°本文所述的工作評價了使用經(jīng)改造的MSC作為在腫瘤基質(zhì)環(huán)境中選擇性地遞送自殺基因的治療載劑對原發(fā)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。MSC被改造為在CCL5啟動子的控制下表達單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)以進行組織特異性表達。用單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)在CCL5啟動子的控制下轉(zhuǎn)染MSC，從而有更多組織特異的基因表達。Tk磷酸化更昔洛韋(GCV)，產(chǎn)生殺死轉(zhuǎn)染細胞和經(jīng)旁觀作用(bystandereffect)殺死周圍腫瘤細胞的毒性。使用更昔洛韋的HSV-TK基因治療構(gòu)成自殺基因治療的廣泛使用策略的基礎(chǔ)。17由于實體瘤對循環(huán)祖細胞有強的回歸作用，使用本方法可有效靶向腫瘤環(huán)境。該載體干細胞的靶向加上由自殺基因的CCL5啟動子驅(qū)動的組織特異性基因表達導致了高效和低副作用的特性。此外，可以從癌癥患者自身獲得骨髓源性MSC。這允許經(jīng)過簡單的靜脈內(nèi)施用遞送自殺基因而不需要髓抑制和骨髓移植?；谂R床前研究的胰腺癌治療策略在顯著延長患者生存方面還未取得成功。在診斷時，僅有20%患胰腺癌的患者具有可以手術(shù)的局部疾病。40%的患者具有局部晚期(因此不能切除)疾病，而另外40%已有遠端轉(zhuǎn)移。胰腺腫瘤模型證明MSC在胰腺癌中起重要作用。如通過遷移測定和CCL5/RFPMSC系統(tǒng)注射所示，細胞主動尋找腫瘤。全身注射的干細胞僅在腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。隨后的腫瘤體積減小和腹腔癌減少為患者特制的干細胞/自殺基因組合療法有望于臨床應用。匯集至其他組織部位的經(jīng)改造干細胞不進行相同的分化過程，因此不表達治療性基因。該方法允許在確定的微環(huán)境中對治療性基因的選擇性表達進行很大程度的控制。將干細胞療法與選擇性基因療法結(jié)合為患病或丟失細胞的再生或替換并為破壞腫瘤增大了治療選擇。本文證明遺傳修飾的干細胞可作為將組織特異性基因治療輸送到腫瘤的載體，并且用CCL5啟動子改造的MSC可驅(qū)動tk表達。表I組對照(n=5)天然mSC(n=3)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移P值器官脾5(100%)3(100%)1.00肝3(60%)3(100%)0.46腹膜0(100%)3(100%)0.018*MSC處理對轉(zhuǎn)移發(fā)生的作用。比較載體對照和用天然MSC處理(在3周時間內(nèi)每周給予500，000細胞的MSC)的動物。通過在腫瘤生長36天后檢視并觸摸來進行檢測。數(shù)字表示具有轉(zhuǎn)移瘤的動物。用雙尾Fisher精確測試檢測顯著性。表2組對照RaPro/RFP(n=9)RaPro/eGFP(n=6)RaPro/Tk+GCV(n=10)(n=5)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移p值轉(zhuǎn)移P值轉(zhuǎn)移P值器脾5(100°/。)8(89%)1.005(100%)1.003(30%)0.026*官肝3(60%)4(44.4%)1.002(33%)0.570(0%)0.022*腹膜0(0%)7(78%)0.021*4(67%)0.060(0%)1.00表2.腫瘤轉(zhuǎn)移的分布。將載劑對照動物和GFP與RFP報告基因轉(zhuǎn)染的對照MSC與用自殺基因療法處理的動物比較。通過在腫瘤生長36天后檢視并觸摸來進行檢測。數(shù)字表示具有轉(zhuǎn)移瘤的動物。用雙尾Fisher精確測試檢測顯著性。所有MSC為在3周時間內(nèi)每周給予500，OOO細胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)導人MSC的體外實驗和誘導HSVtk表達的體外測定遺傳修飾的人MSC的生成用復制缺陷的慢病毒孵育人MSC過夜，所述慢病毒攜帶具有RANTES啟動子控制下的HSVtk基因和SV40啟動子控制下的殺稻瘟菌素抗性基因的pLenti6TKRANTES載體(復合感染(MOI):10)(見圖8)。在過夜孵育后，去除含有病毒的培養(yǎng)基并替換為新鮮培養(yǎng)基。第二天向細胞中加入殺稻瘟菌素(6i!g/ml)以選擇遺傳修飾的MSC。包含殺稻瘟菌素的培養(yǎng)基每3至4天更換，最少持續(xù)6天。RANTES啟動子的體外誘導已證明細胞因子TNFa(10ng/ml)和IFNy(10ng/ml)的組合導致人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECS)中RANTES啟動子的誘導35。在我們的實驗中，我們想證明相同的細胞因子組合也導致MSC中內(nèi)源RANTES啟動子的誘導。我們想使用該測定誘導外源性HSVtk的體外表達。用TNFa和IFNY或不用細胞因子將遺傳改造的MSC培養(yǎng)最多48小時，在0、24和48小之后分離整個RNA。將RNA(600ng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后用LighCycler系統(tǒng)(Roche，引物正向CCTCATTGCTACTGCCCTCT;反向GGTGTGGTGTCCGAGGAATA;通用探針16)在qRT-PCR反應中使用cDNA以定量內(nèi)源RANTES表達。為確保對不同樣品使用相同量的RNA，用看家基因(肌動蛋白)作為參照基因(通用探針實驗室人ACTB基因分析法，Roche)，用AACT法計算相對量。如圖9所示，我們能在用TNFa(10ng/ml)和IFNy(10ng/ml)誘導MSC24和48小時后檢測到內(nèi)源RANTESmRNA的顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)證明TNFa和IFNy不只在HUVEC中也在人MSC中誘導RANTES表達。更昔洛韋處理后遺傳修飾MSC誘導的特定細胞死亡在我們證明RANTES啟動子的可誘導性后，我們繼續(xù)研究是否可以誘導外源RANTES啟動子控制下的HSVtk表達，并隨之在用更昔洛韋處理誘導細胞后促使細胞死亡。用TNFa(10ng/ml)和IFNy(10ng/ml)處理上述產(chǎn)生的遺傳修飾細胞(每6孔50000細胞)，每3天添加新鮮細胞因子。隨后用100PM更昔洛韋孵育細胞3天。結(jié)果清楚地證明用TNFa和IFNy誘導并隨后用更昔洛韋處理的遺傳修飾MSC不存活(圖10D)。這與只用TNFa和IFNY(圖10B)誘導或用更昔洛韋處理(圖10C)的細胞相反。參考文獻I.KorcM.Pancreaticcancer-associatedstromaproduction.AmJSurg2007；194(4SuppI)S84-6.2.AhmedF,SteeleJC,HerbertJM,etal.Tumorstromaasatargetincancer.CurrCancerDrugTargets2008；8(6):447-53.3.FarrowB,SugiyamaY,ChenA,etal.Inflammatorymechanismscontributingtopancreaticcancerdevelopment.AnnSurg2004；239(6):763-9;discussion769-71.4.KarnoubAE.WeinbergRA.Chemokinenetworksandbreastcancermetastasis.BreastDis2006；26:75-85.5.KiarisH，TrimisG，PapavassiliouAG.Regulationoftumor-stromalfibroblastinteractions!implicationsinanticancertherapy.CurrMedChem2008；15(29):3062-7.6.OrimoA,WeinbergRA.Stromalfibroblastsincanceranoveltumor-promotingcelltype.CellCycle2006；5(15):1597-601.7.FritzV，JorgensenC.Mesenchymalstemcellsanemergingtoolforcancertargetingandtherapy.CurrStemCellResTher2008;3(I):32-42.8.ZiporiD.Themesenchymeincancertherapyasatargettumorcomponent，effectorcellmodalityandcytokineexpressionvehicle.CancerMetastasisRev2006；25(3):459-67.9.KarnoubAE,DashAB,VoAP,etal.Mesenchymalstemcellswithintumourstromapromotebreastcancermetastasis.Nature2007；449(7162):557-63.10.MollerC，StrombergT，JuremalmM，etal.Expressionandfunctionofchemokinereceptorsinhumanmultiplemyeloma.Leukemia2003；17(I):203-10.11.SoriaG,Ben-BaruchA.TheinflammatorychemokinesCCL2andCCL5inbreastcancer.CancerLett2008；267(2):271-85.12.FischerM，JuremalmM，OlssonN，etal.ExpressionofCCL5/RANTESbyHodgkinandReed-Sternbergcellsanditspossibleroleintherecruitmentofmastcellsintolymphomatoustissue.IntJCancer2003；107(2):197-201.13.BexellD，GunnarssonS，TorminA，etal.Bonemarrowmultipotentmesenchymalstromacellsactaspericyte-1ikemigratoryvehiclesinexperimentalgliomas.MolTher2009；17(I):183-90.14.KanehiraM，KatagiriT，ShimoA，etal.OncogenicroleofMPH0SPH1，acancer-testisantigenspecifictohumanbladdercancer.CancerRes2007；67(7)3276-85.15.VonLuttichauI,NotohamiprodjoM,WechselbergerA，etal.HumanadultCD34-progenitorcellsfunctionallyexpressthechemokinereceptorsCCR1，CCR4，CCR7，CXCR5，andCCRlObutnotCXCR4.StemCellsDev2005；14(3):329-36.16.ConradC，NiessH，HussR，etal.MultipotentMesenchymalStemCellsAcquireaLymphendothelialPhenotypeandEnhanceLymphaticRegenerationInVivo.Circulation2008.17.ConradC，GuptaR，MohanH，etal.Geneticallyengineeredstemcellsfortherapeuticgenedelivery.CurrGeneTher2007；7(4):249-60.18.KumarD，HosseJ，vonToerneC，etal.JNKMAPKpathwayregulatesconstitutivetranscriptionofCCL5byhumanNKcellsthroughSPl.JImmunol2009；182(2):1011-20.19.LiyanageUK,GoedegebuurePS,MooreTT,etal.IncreasedprevalenceofregulatoryTcells(Treg)isinducedbypancreasadenocarcinoma.JImmunother2006；29(4):416-24.20.SegererS，BanasB，WornleM，etal.CXCR3isinvolvedintubulointerstitialinjuryinhumanglomerulonephritis.AmJPathol2004;164(2)635-49.21.ConradC，GottgensB，KinstonS，etal.GATAtranscriptioninasmallrhodamine123(low)CD34(+)subpopulationofaperipheralblood-derivedCD34(-)CD105(+)mesenchymalcellline.ExpHematol2002；30(8):887-95.22.NelsonPJ,KimHT,ManningWC,etal.GenomicorganizationandtranscriptionalregulationoftheRANTESchemokinegene.JImmunol1993；151(5)2601-12.23.WernerT，F(xiàn)esseleS，MaierH，NelsonPJ.Computermodelingofpromoterorganizationasatooltostudytranscriptionalcoregulation.FASEBJ2003；17(10):1228-37.24.vonLuettichauI，NelsonPJ,PattisonJM,etal.RANTESchemokineexpressionindiseasedandnormalhumantissues.Cytokine1996；8(I):89-98.25.NelsonPJ，PattisonJM,KrenskyAM.GeneexpressionofRANTES.MethodsEnzymol1997；287:148-62.26.FesseleS，BoehlkS，MojaatA，etal.MolecularandinsilicocharacterizationofapromotermoduleandC/EBPelementthatmediateLPS-inducedRANTES/CCL5expressioninmonocyticcells.FASEBJ2001；15(3)577-9.27.FesseleS，MaierH，ZischekC，etal.Regulatorycontextisacrucialpartofgenefunction.TrendsGenet2002;18(2):60-3.28.GolumbekPT，HamzehFM，JaffeeEM,etal.Herpessimplex-1virusthymidinekinasegeneisunabletocompletelyeliminatelive,nonimmunogenictumorcellvaccines.JImmunother1992；12(4):224-30.29.AndohA，TakayaH，SaotomeT，etal.Cytokineregulationofchemokine(IL-8，MCP-1，andRANTES)geneexpressioninhumanpancreaticperiacinarmyofibroblasts.Gastroenterology2000；119(I):211-9.30.DuelIEJ,CasellaDP,BurkRD,etal.Inflammation,geneticpolymorphismsinproinflammatorygenesTNF-A,RANTES，andCCR5，andriskofpancreaticadenocarcinoma.CancerEpidemiolBiomarkersPrev2006；15(4):726-31.31.CorbettT.H.，RobertsBJ,LeopoldWR,etal.InductionandchemotherapeuticresponseoftwotransplantableductaladenocarcinomasofthepancreasinC57BL/6mice.CancerRes1984；44:717-72632.MorikaneK，TemperoRM,SivinskiCL，etal.Organ-specificpancreatictumorgrowthpropertiesandtumorimmunity.CancerImmunolImmunother1999；47(5):287-96.33.DeegHJ,KlingemannHG，PhilipsGL,AGuidetoBoneMarrowTransplantation.Springer-VerlagBerlinHeidelberg1992.34.RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy,20thEd.，p.808，LippincottWilliams&Wilkins(2000).35.Marfaing-Koka,A.，etal.，RegulationoftheproductionoftheRANTESchemokinebyendothelialcells.SynergisticinductionbyIFN-gammaplusTNF-alphaandinhibitionbyIL_4andIL-13.JournalofImmunology,1995.154(4)p.1870-8.36.Khoury,M，etal.(200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白編碼區(qū)可操作性地連接至(ii)啟動子或啟動子/增強子組合，據(jù)此當所述遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞與腫瘤的基質(zhì)組織接近時，選擇性地表達所述細胞毒性蛋白。25.權(quán)利要求24的干細胞，其中所述干細胞是人干細胞。26.權(quán)利要求24或25中任ー項的干細胞，其中所述干細胞是CD34_干細胞。27.權(quán)利要求24至26中任ー項的干細胞，其中所述啟動子或啟動子/增強子組合可由炎癥介質(zhì)誘導。28.前ー權(quán)利要求的干細胞，其中所述啟動子或啟動子/増強子組合可由細胞因子誘導。29.權(quán)利要求24至28中任ー項的干細胞，其中所述啟動子是RANTES啟動子。30.權(quán)利要求24至29中任ー項的干細胞，還包含(iii)選擇標記基因，所述選擇標記基因可操作性地連接至(iv)組成型啟動子或啟動子/増強子組合。31.權(quán)利要求30的干細胞，其中所述選擇標記基因包括抗生素抗性基因或編碼表面標記蛋白的基因。32.權(quán)利要求30或31中任ー項的干細胞，還包含(V)位于所述細胞毒性蛋白編碼區(qū)和所述表面標記基因之間的絕緣子序列。33.權(quán)利要求24至32中任ー項的干細胞，其中所述可操作性地連接至啟動子或啟動子/增強子組合的細胞毒性蛋白編碼區(qū)被整合到所述干細胞的基因組中。34.權(quán)利要求30至32中任ー項的干細胞，其中所述可操作性地連接至組成型啟動子或啟動子/增強子組合的選擇標記基因被整合到所述干細胞的基因組中。35.權(quán)利要求33或34中任一項的干細胞，還包含整合到所述干細胞的基因組中的前病毒序列，其中所述可操作性地連接至啟動子或啟動子/増強子組合的細胞毒性蛋白編碼區(qū)和所述可操作性地連接至組成型啟動子或啟動子/增強子組合的選擇標記基因是所述前病毒序列的一部分。36.權(quán)利要求35的干細胞，其中所述前病毒序列是慢病毒序列、α逆轉(zhuǎn)錄病毒序列或Y逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。37.權(quán)利要求24至36中任ー項的干細胞，其中所述細胞毒性蛋白是單純皰疹病毒胸苷激酶或胞嘧啶脫氨酶。38.逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞，包含-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含(i)細胞毒性蛋白編碼區(qū)，所述細胞毒性蛋白編碼區(qū)可操作性地連接至(ii)可由炎癥介質(zhì)誘導的啟動子或啟動子/増強子組合；以及-編碼為間充質(zhì)干細胞或CD34-干細胞提供趨向性的病毒表面蛋白的基因。39.前ー權(quán)利要求的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞，其中所述啟動子或啟動子/增強子組合可由細胞因子誘導。40.前述權(quán)利要求38或39的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞，其中所述啟動子是RANTES啟動子。41.遺傳修飾的人CD34_干細胞，所述遺傳修飾的人CD34_干細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)單純皰疹病毒胸苷激酶編碼區(qū)，所述單純皰疹病毒胸苷激酶編碼區(qū)可操作性地連接至(ii)RANTES啟動子。全文摘要本發(fā)明提供了用遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞治療患腫瘤的對象的方法，其中每個遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)細胞毒性蛋白編碼區(qū)，所述細胞毒性蛋白編碼區(qū)可操作性地連接至(ii)啟動子或啟動子/增強子組合，據(jù)此在所述遺傳修飾的間充質(zhì)干細胞與腫瘤的間質(zhì)組織接近時選擇性地表達所述細胞毒性蛋白。本發(fā)明還提供了用于該方法的遺傳修飾間充質(zhì)干細胞。文檔編號C12N5/10GK102695517SQ201080026333公開日2012年9月26日申請日期2010年4月13日優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日發(fā)明者彼得·納爾遜申請人:埃普塞斯有限責任兩合公司