專利名稱：甘蔗黑穗病菌dna快速提取方法
技術領域：
本發(fā)明屬植物保護領域，具體是一種甘蔗黑穗病菌DNA的快速提取方法。
背景技術：
甘蔗黑穗病(Ustilago scitaminea Syd.)已成為世界各植蔗區(qū)的主要病害之一。 該病害在一些蔗區(qū)曾流行和引起重大的經(jīng)濟損失，至今仍在造成不同程度的經(jīng)濟損失。黑 穗病發(fā)生的輕重與甘蔗品種的抗病性和感病性有密切的關系，抗病性較強的品種發(fā)病率低 于10%，感病的品種發(fā)病率可高達50%以上，宿根蔗產(chǎn)量損失高達70%，嚴重的甚至高達 80-90%。甘蔗黑穗病是由黑粉菌引起的一種真菌性甘蔗病害，目前應用分離培養(yǎng)技術、血 清(ELISA)或PCR技術等多種方法檢測該病害，其中PCR技術是廣泛應用于該病害檢測的 一種分子技術，能夠準確快速地診斷該病害。但是應用PCR技術對病菌進行準確檢測要求 有高質(zhì)量的病菌DNA，因此建立一種快速高效的甘蔗黑穗病菌DNA的提取方法非常必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，以彌補上述不足，通過對提取 高質(zhì)量的病菌DNA進行準確快速的PCR檢測鑒定，能夠及時掌握甘蔗生產(chǎn)中該病害的發(fā)生 情況，制定有效的防控措施，同時為今后開展甘蔗黑穗病抗性品種/材料篩選研究提供技 術支撐。本發(fā)明方法通過以下技術方案實現(xiàn)其發(fā)明目的直接取甘蔗黑穗病發(fā)病植株上 的病菌孢子，采用尿素提取混合液對病菌進行研磨，經(jīng)過振蕩混勻，離心取上清液，加入 等體積氯仿/異戊醇溶液，振蕩混勻，離心取上清液，加入2倍體積異丙醇和1/10體積 NaAC，-20°C放置lh，離心棄上清液，用70%乙醇洗沉淀，室溫干燥；溶于800 μ L雙蒸水，加 入RnaseA 2 μ L，37°C水浴60min，加入等體積氯仿/異戊醇溶液，振蕩混勻，離心取上清液， 加入2倍體積異丙醇和1/10體積NaAC，-20°C放置lh，離心棄上清液，用70%乙醇洗沉淀， 離心棄上清液，室溫干燥，即可獲得高質(zhì)量的甘蔗黑穗病菌基因組DNA，將DNA溶于100 μ L 滅菌雙蒸水中，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA條帶完整、明亮。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是由于甘蔗黑穗病菌在固體培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)生長緩慢，傳統(tǒng)方法要先對病菌進行 分離培養(yǎng)，再對病菌進行DNA提取，需要的周期長，步驟繁瑣。本方法直接取甘蔗黑穗病發(fā) 病植株上的病菌孢子進行DNA提取，取代了傳統(tǒng)的對病菌進行分離培養(yǎng)后再進行DNA提取 的方法，大大縮短了周期，減少了繁瑣的步驟。此外，本方法利用尿素混合液直接研磨病菌，取代了利用液氮研磨病菌后再用提 取液抽提的步驟，縮減了程序，節(jié)省了費用。綜上所述，本方法具有操作簡便、快速、經(jīng)濟、高 效等特點。


圖1是本發(fā)明采用甘蔗黑穗病菌DNA凝膠電泳檢測的DNA條帶。
具體實施例方式從田間采集甘蔗黑穗病發(fā)病植株，直接取病株上的黑穗病菌孢子進行DNA提取。 步驟如下1、取0. 5g病菌孢子于研缽，加入600 μ L尿素提取混合液研磨，該尿素提取混合液 的組成為 7mol/L Urea、50mmol/L Tris-HCl pH 8. 0,62. 5mmol/L NaClU % SDS ；2、轉(zhuǎn)移菌液于2mL離心管，加入800 μ L尿素提取混合液，于振蕩儀上充分振蕩混 勻，12000r/min 離心 5min ；3、取上清液于一新的2mL離心管，12000r/min離心5min ；4、將上清液移入另一新的2mL離心管，加入等體積氯仿/異戊醇(24 1)溶液， 用力振蕩數(shù)次混勻，12000r/min離心5min ；5、取上清液到一新的2mL離心管，加入2倍體積異丙醇和1/10體積3mol/ LNaAc (pH 5. 2)，_20°C放置 lh, 12000r/min 離心 IOmin ；6、棄上清液，倒置使管壁液體流盡，70%乙醇洗沉淀2次，12000r/min離心5min， 棄上清液，室溫放置干燥，沉淀溶于800 μ L雙蒸水，加入RNaseA (10 μ g/ μ L) 2 μ L, 37°C水 浴60min ；獲得了高質(zhì)量的甘蔗黑穗病菌基因組DNA，如圖1。
權利要求
甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是取甘蔗黑穗病發(fā)病植株上的黑穗病菌孢子0.5g，采用尿素提取混合液研磨病菌，振蕩混勻，離心取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇溶液，振蕩混勻，離心取上清液，加入2倍體積異丙醇和1/10體積NaAc， 20℃放置1h，離心棄上清液，用70％乙醇洗沉淀，室溫干燥；溶于800μL雙蒸水中，加入RNaseA 2μL，37℃水浴60min，加入等體積氯仿/異戊醇溶液，振蕩混勻，離心取上清，加入2倍體積異丙醇和1/10體積NaAc， 20℃放置1h，離心棄上清液，用70％乙醇洗沉淀，離心棄上清液，室溫干燥，即可獲得甘蔗黑穗病菌DNA。
2.根據(jù)權利要求1所述的甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是從田間采集甘 蔗黑穗病發(fā)病植株，直接取病株上的黑穗病菌孢子進行DNA提取。
3.根據(jù)權利要求1所述的甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是所用尿素提取 混合液為 7mol/L Urea、50mmol/L Tris-HC 1 pH 8. 0,62. 5mmol/LNaClU % SDS0
4.根據(jù)權利要求1所述的甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是所述的氯仿 異戊醇按24 1配制。
5.根據(jù)權利要求1所述的甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是所述的NaAc按 3mol/L、pH 5. 2 配制。
6.根據(jù)權利要求1所述的甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是所述的RnaseA 按IOyg/μ L配制。
全文摘要
一種甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，取甘蔗黑穗病發(fā)病植株上的黑穗病菌孢子0.5g，采用尿素提取混合液研磨病菌，振蕩混勻，離心取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇溶液，振蕩混勻，離心取上清液，加入2倍體積異丙醇和1/10體積NaAc，-20℃放置1h，離心棄上清液，用70％乙醇洗沉淀，室溫干燥；溶于800μL雙蒸水中，加入RNaseA 2μL，37℃水浴60min，加入等體積氯仿/異戊醇溶液，振蕩混勻，離心取上清，加入2倍體積異丙醇和1/10體積NaAc，-20℃放置1h，離心棄上清液，用70％乙醇洗沉淀，離心棄上清液，室溫干燥，即可獲得甘蔗黑穗病菌DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA條帶完整，明亮。
文檔編號C12N15/10GK101935644SQ20101025816
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權日2010年8月20日
發(fā)明者盧文潔, 李如丹, 李文鳳, 王明強, 王曉燕, 羅志明, 黃應昆 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所