融合多肽、編碼它的核酸分子以及使用它產(chǎn)生衣康酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用以在細(xì)胞中產(chǎn)生衣康酸的重組酶系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 在化學(xué)產(chǎn)業(yè)中高度需求的衣康酸（Itaconate)為一前驅(qū)物化合物，通常用于各種 產(chǎn)物的制造，如亞克力纖維、橡膠、人工鉆石與透鏡（lens)。特定的絲狀真菌（例如，黑穗 病菌屬（Ustilago)、紫紋羽病菌屬（Helicobasidium)與曲菌屬（Aspergillus))將單糖類(lèi) 轉(zhuǎn)化成此化合物。目前，衣康酸的工業(yè)生產(chǎn)主要仰賴以天然衣康酸生產(chǎn)菌株一例如土曲菌 (Aspergillus terreus)一進(jìn)行發(fā)酵。土曲菌生長(zhǎng)緩慢且于其孢子形成階段不產(chǎn)生衣康酸。 因此，亟需一種以高產(chǎn)量來(lái)產(chǎn)生衣康酸的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明描述一種包含烏頭酸酶（aconitase, Aco)與順式烏頭酸脫羧酶 (cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)的融合多肽，以及編碼此多肽的核酸分子。此多 肽顯示出烏頭酸酶活性與順式烏頭酸脫羧酶活性。
[0004] 本發(fā)明也描述了表達(dá)此融合多肽的經(jīng)基因修飾的細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞通過(guò)在允許融合 多肽表達(dá)與衣康酸產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，可用來(lái)產(chǎn)生衣康酸。
[0005] 下文結(jié)合附圖與說(shuō)明提及一或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)。實(shí)施例的其它特征、目的與優(yōu) 點(diǎn)，從說(shuō)明書(shū)與附圖，以及從權(quán)利要求書(shū)中是明顯的。
【附圖說(shuō)明】
[0006] 圖IA與圖1B。于大腸桿菌（Escherichia coli)細(xì)胞中的衣康酸的生物合成。圖 IA :通過(guò)烏頭酸酶（Aco)與順式烏頭酸脫羧酶（CAD)所催化的反應(yīng)分別以方框與橢圓框所 標(biāo)示。圖IB :烏頭酸酶A(AcnA)、烏頭酸酶B(AcnB)(來(lái)自大腸桿菌）與順式烏頭酸脫羧酶 (來(lái)自土曲菌）對(duì)于梓檬酸（citrate)與順式烏頭酸（cis-aconitate)的Km值列于表中。
[0007] 圖2。cad-aco融合基因的基礎(chǔ)編排與用來(lái)克隆這些基因的PCR策略。位于接頭 區(qū)域的內(nèi)部XbaI切割位點(diǎn)（cutting site)被用來(lái)將兩種的PCR-I與PCR-2片段連接在一 起。外面的KpnI與HindIII切割位點(diǎn)（以方框標(biāo)出）被用來(lái)插入pSA40a在此載體上的對(duì) 應(yīng)位。以單一連接反應(yīng)將所有3個(gè)片段連接在一起。
[0008] 圖3A與圖3B。在攜帶不同cad-aco融合體或cad與aco基因的菌株中，衣康酸（圖 3A)與順式烏頭酸（圖3B)的產(chǎn)量的比較。這些菌株全部以相同的宿主，大腸桿菌SY403K 為基礎(chǔ)。于各菌株中所攜帶的載體列于括號(hào)中。
[0009] 圖4。在被提供過(guò)量的檸檬酸的不同菌株中，衣康酸與順式烏頭酸的產(chǎn)生的比較。 這些菌株以相同的宿主，大腸桿菌SY403K為基礎(chǔ)。兩個(gè)質(zhì)粒被包含于細(xì)胞中，pPC6,用以過(guò) 量提供檸檬酸，而用以測(cè)試功能的質(zhì)粒，則列于括號(hào)中。
[0010] 圖5A與圖5B。在被提供過(guò)量的檸檬酸的不同菌株中，衣康酸（圖5A)與順式烏頭 酸（圖5B)的產(chǎn)生的比較。這些菌株以相同的宿主，大腸桿菌PCI400*為基礎(chǔ)，且攜帶兩個(gè) 質(zhì)粒，PPC6與用以測(cè)試功能的質(zhì)粒（列于括號(hào)中）。
[0011] 圖6A與圖6B。在被提供過(guò)量的檸檬酸且被表達(dá)個(gè)別的順式烏頭酸脫羧酶的不同 菌株中，衣康酸（圖6A)與順式烏頭酸（圖6B)的產(chǎn)生的比較。這些菌株以相同的宿主，大 腸桿菌PCI400*為基礎(chǔ)，且攜帶三個(gè)質(zhì)粒，pPCl、pPC6與用以測(cè)試功能的質(zhì)粒（列于括號(hào) 中）。
[0012] 圖7A與圖7B。在不同測(cè)試菌株中，衣康酸（圖7A)與順式烏頭酸（圖7B)的產(chǎn)生 的比較。這些菌株以相同的宿主，大腸桿菌PCI400*為基礎(chǔ)。
[0013] 圖8。在被提供過(guò)量的檸檬酸的不同菌株中，衣康酸與順式烏頭酸的產(chǎn)生的比較。 這些菌株以相同的宿主，大腸桿菌SY403K為基礎(chǔ)，且攜帶兩個(gè)質(zhì)粒，pPC6與用以測(cè)試功能 的質(zhì)粒（列于括號(hào)中）。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 在下文詳細(xì)敘述中，為了說(shuō)明目的，提及多個(gè)特定細(xì)節(jié)以提供所揭露的實(shí)施例的 徹底了解。然而，明顯的是，可實(shí)施一或多個(gè)實(shí)施例而不須這些細(xì)節(jié)。在其它例子中，為了 簡(jiǎn)化附圖，概要地顯示熟知的結(jié)構(gòu)或裝置。
[0015] 在真核或原核宿主中，衣康酸的生物合成需要兩種酶，烏頭酸酶（aconitase, Aco) 與順式烏頭酸脫羧酶（cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)，以用于將梓檬酸 (citrate)轉(zhuǎn)化為衣康酸的兩個(gè)依序反應(yīng)。檸檬酸首先通過(guò)烏頭酸酶被轉(zhuǎn)化為順式烏頭酸。 所產(chǎn)生的順式烏頭酸通過(guò)順式烏頭酸脫羧酶更進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為衣康酸，隨著釋放一分子的 CO2(圖1)。如于此所使用，用語(yǔ)"衣康酸（itaconate)"與"衣康酸（itaconic acid)"可被 替換地使用。
[0016] 非預(yù)期地發(fā)現(xiàn)，表達(dá)包含烏頭酸酶與順式烏頭酸脫羧酶的融合多肽的細(xì)胞，產(chǎn)生 高程度的衣康酸。
[0017] 因此，于此所描述為一融合多肽，其包含烏頭酸酶與順式烏頭酸脫羧酶。
[0018] 于此所使用的用語(yǔ)"順式烏頭酸脫羧酶（cis-aconitate decarboxylase) "或 "CAD"意指任何自然發(fā)生的順式烏頭酸脫羧酶（例如，于Dwiarti et al.，J. Bioscience and Bioengineering, 94(1):29-33, 2002 與 TO 2009/014437 中所描述的土 曲菌順 式烏頭酸脫羧酶）及其功能性等同物。例如，順式烏頭酸脫羧酶包括于US Patent No. 8, 338, 158中所描述的突變的土曲菌順式烏頭酸脫羧酶。于以下所提供的是一示范的土曲 菌順式烏頭酸脫羧酶的核苷酸序列（SEQ ID No :1)與一氨基酸序列（SEQ ID No :2):


[0069] 于此所使用的用語(yǔ)"烏頭酸酶（aconitase) "或"Aco"意指任何自然發(fā)生的順式烏 頭酸脫羧酶及其功能性等同物，包括，但不限于，自然發(fā)生的土曲菌與大腸桿菌烏頭酸酶與 其變體。于以下所提供的是大腸桿菌烏頭酸酶A(由acnA基因所編碼）與烏頭酸酶B (由 acnB基因所編碼）的核苷酸序列與氨基酸序列：
[0070] 一大腸桿菌烏頭酸酶A的核酸序列（SEQ ID No :3)與氨基酸序列（SEQ ID No :4)
[0071] 烏頭酸酶A




[0252] 例如，順式烏頭酸脫羧酶可位于多肽的N端。在一實(shí)施例中，烏頭酸酶與 順式烏頭酸脫羧酶通過(guò)接頭來(lái)連接，而接頭具有，例如1-200個(gè)氨基酸。接頭可為 EFGPGPGPGPGPLEVLFQGPGRAKL(SEQ ID No ：7)〇
[0253] 于以下所顯示的是示范的融合多肽的氨基酸序列與編碼出此多肽的核酸序列：
[0254] 順式烏頭酸脫羧酶-接頭-烏頭酸酶A的核酸序列（SEQ ID No :8)與氨基酸序列










[0679] 順式烏頭酸脫羧酶-接頭-Yacol的核酸序列（SEQ ID No :14)與氨基酸序列（SEQ ID No :15) 〇



[0810] 通過(guò)使用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的方法，例如重組技術(shù)，可產(chǎn)生融合多肽以及編碼融 合多肽的核酸分子。
[0811] 可將編碼一融合多肽的序列有效連接至適合的啟動(dòng)子以產(chǎn)生表達(dá)盒。在一例子 中，表達(dá)盒包括編碼序列，其有效連接至啟動(dòng)子。在另一例子中，表達(dá)盒包括多個(gè)編碼序列， 其全部為與一啟動(dòng)子可操作的連接。于那例子中，較佳為將一核糖體結(jié)合位點(diǎn)合并至各個(gè) 編碼序列的5'端。若需要，根據(jù)于宿主細(xì)胞中的最適密碼子使用，使編碼序列進(jìn)行密碼子 優(yōu)化。
[0812] 如于此所使用，用語(yǔ)"啟動(dòng)子"意指一核苷酸序列，其包含在一所要求的宿主細(xì)胞 中起始可操作連接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄的組件。至少，一激活子包含RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。其 可更包含一或多個(gè)，根據(jù)定義，為增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子組件，或一或多個(gè)控制啟動(dòng)子開(kāi)/關(guān)的 狀態(tài)的調(diào)控組件。啟動(dòng)子可為可誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子。
[0813] 可將用以表達(dá)上述融合多肽的表達(dá)盒引入適合的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生經(jīng)基因修飾的 細(xì)胞。選擇陽(yáng)性轉(zhuǎn)型株，且通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域中已知的方法，例如，免疫印跡法或酶活性分析， 可確認(rèn)融合多肽的表達(dá)。之后可將經(jīng)修飾的細(xì)胞培養(yǎng)于用以衣康酸產(chǎn)生的適合的培養(yǎng)基 中。例如，培養(yǎng)基可包含葡萄糖、甘油或檸檬酸用以制造衣康酸的前驅(qū)物。參見(jiàn)，例如，US Patent No. 8, 192, 965。在一足夠的培養(yǎng)期間后，可從培養(yǎng)基分離衣康酸。
[0814] 適合的宿主細(xì)胞，包括，但不限于，黑曲菌（Aspergillus niger)、土曲菌、大腸桿 菌、南極類(lèi)酵母真菌（Pseudozyma antarctica)、解脂耶氏酵母菌（Yarrowia Iipotica)與 啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞。
[0815] 上述經(jīng)基因修飾的細(xì)胞可具有一突變內(nèi)生性的icd基因（編碼出異檸檬酸 脫氫酶（isocitrate dehydrogenase))，以使其相較于其野生型相對(duì)物（wild-type counterpart)，表達(dá)較低程度的異檸檬酸脫氫酶。異檸檬酸脫氫酶將異檸檬酸轉(zhuǎn)化 成α -酮戊二酸（a -ketoglutarate)。icd基因存在于各種種類(lèi)的微生物中，包括 土曲菌（GenBank Accession Nos. XM_001210553 與 XP_001210553)、克氏檸檬酸桿菌 (Citrobacter koseri) (GenBank Accession Nos. NC_009792 與 YP_001453397)、發(fā)酵乳桿 菌（Lactobacillus fermentum)(GenBank Accession Nos. NC_010610 與 ΥΡ_001843755)、 啤酒酵母菌（GenBank Accession Nos. NM_001182876 與 NP_014361)、解脂耶氏酵母菌 (GenBank Accession Nos. XM_503571 與 XP_503571)及大腸桿菌（GenBank Accession Nos. NC_000913 與 NP_415654)。也參見(jiàn) US Patent Ν〇·8，143,036。產(chǎn)生具有突變的內(nèi)生性 icd 基因的微生物的方法，為本技術(shù)領(lǐng)域所已知。例如，通過(guò)同源重組，突變（例如，插入、刪除、 點(diǎn)突變）的icd基因可被引入。作為一例子，大腸桿菌icd基因的編碼區(qū)域如下所示：
[0816] 大腸桿菌異檸檬酸脫氫酶的核苷酸序列（SEQ ID No : 16)與氨基酸序