小麥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的實時熒光定量鑒定方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及植物病害檢測技術，特別是一種小麥黑穗菌（Tilletiacontroversa Kilhn)的實時巧光定量鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 小麥矮腥黑穗病菌（Tilletiacontroversa肺hn，簡稱TCK)引起的小麥矮腥黑 穗病是一種重要的國際檢疫性病害，對小麥生產(chǎn)造成嚴重的危害，也是我國外來生物入侵 研究的主要物種之一（王圓，1997)。在其流行年份，小麥矮腥黑穗病引起的產(chǎn)量損失一般 為20 %~50 %，嚴重時可達75 %~90 %，甚至絕產(chǎn)。病菌抗逆性極強，其冬抱子在±中可 存活3~7年，包裹在菌瘦中的冬抱子甚至可保持活力長達10年W上。此病害一旦發(fā)生， 很難防治或根除，所W國際上有15個國家將其列為檢疫對象。我國在20世紀60年代把此 病害列為檢疫對象。在腥黑粉菌中，TCK與其近緣種小麥網(wǎng)腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌等在 形態(tài)學上極為相似，難于區(qū)別。
[0003] 傳統(tǒng)的病害診斷、檢測方法主要是依據(jù)病原形態(tài)學、生理學和生物化學的特性，不 但過程繁瑣、時間周期長，而且準確性差、精度不高。因此，利用分子生物學手段快速、準確 地鑒別小麥矮腥黑粉菌具有重要的意義。
[0004] 1996年化rreira等首次將PCR技術引進到印度腥黑穗病的鑒定中來，他們選擇 了印腥線粒體DNA的一個2. 3化的EcoRl片段進行了克隆和測序，設計的特異性引物TI1/ TI4從25種腥黑穗病菌菌株中鑒定出了印腥。另外，Smith等通過克隆印腥線粒體DNA的 化al片段，進行了序列分析，設計了兩套寡核巧酸引物對T117/M1和T117/M2能分別從印 腥中擴增出大小為825bp和118bp特異性片段，也實現(xiàn)了對印度腥黑穗病的檢測鑒定工作。 2000年化ederick根據(jù)線粒體的差異設計了 5對針對印度腥黑穗病的特異性引物和3對針 對黑麥草腥黑穗病的特異性引物，分別能將印度腥黑穗病菌株和黑麥草腥黑穗病菌株從其 近緣屬種中鑒別出來。張競宇等利用核糖體ITS序列上的差異在Tilletia屬20個種中設 計了一對特異性引物T1/T2,能將T.indica和T.walkeri從其它種中區(qū)分開來，而后又根 據(jù)T.indica和T.wa化eri線粒體之間的差異設計了一對特異性引物M1/M2,可W將二者區(qū) 分開來，為了使反應更為靈敏，建立了套式PCR技術，W便于提供更簡單的鑒定方法。2004 年高強利用RATO技術找到了一條可W將小麥網(wǎng)腥黑穗病菌株和小麥矮腥黑穗病菌株區(qū)別 于其它黑粉菌株的條帶，但是很遺憾在矮腥黑粉菌和網(wǎng)腥黑粉菌之間沒有找到有差異的條 帶，沒能將二者分開。梁宏等人依據(jù)核糖體的IGS1區(qū)特性，設計了一對特異性引物，可W將 小麥光腥黑穗病菌株從其近緣屬種中鑒別出來。
[0005] 發(fā)明人前期研究中獲得TCK差異片段66化p(SeqIDNo. 1)，并根據(jù)所得差異片段 獲得TCKScar標記及引物，見專利號201110051404.X記載。該標記能用于常規(guī)PC鑒定 TCK菌，能夠特異性地將TCK從近似菌種中鑒定出來。但是發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該專利中的標記引 物及PCR方法不能很好地應用于預警小麥矮腥黑穗病W及篩選抗TCK小麥品種方面，可能 是因為感染TCK且未表現(xiàn)病征的病株中，提取DM后，TCK的DM所占比例太小，也就是濃 度太低，而普通PCR的靈敏性不足于檢測到如此低濃度的模板。眾所周知，實時定量PCR在 靈敏度方面顯著優(yōu)越于普通PCR，因此發(fā)明人嘗試將該Scar標記引物用于實時定量PCR來 擴增TCK樣本，但是無論是在實時巧光定量方法中還是在化qMan水解探針法定量PCR中， 都擴增不出信號。
[0006] 為了能順利利用實時定量PCR方法鑒定小麥矮星黑穗病，有必要通過設計篩選適 合于實時定量PCR方法的特異性PCR引物，優(yōu)化PCR反應體系得出一套靈敏性高、特異性好 的實時定量檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明根據(jù)上述領域的現(xiàn)狀及需求，根據(jù)前期研究中篩選到的TCK差異基因片 段SeqIDNo.l，設計出TCK特異性引物及探針，基于AB口 500巧光定量擴增儀，優(yōu)化 Real-TimePCR反應體系，成功地建立SYBRGreenI巧光染料法定量PCR檢測體系檢測TCK。
[0008] 本發(fā)明建立的實時定量SYBRGreenI巧光染料法檢測TCK的技術方案如下；
[0009] 小麥黑穗菌（Tilletiacontroversa肺hn)的實時巧光定量鑒定方法，包括如下 步驟：
[0010] (1)獲得TCK陽性質(zhì)粒標準品的實時定量標準曲線，其中Ct值為縱坐標，起始模板 拷貝數(shù)為橫坐標；
[0011] 似提取待測樣品的DNA;
[0012] (3)W所述待測樣品的DNA為模板進行實時巧光定量PCR反應，
[0013] (4)根據(jù)所述實時巧光定量PCR反應獲得的Ct值W及所述實時定量標準曲線得到 所述待測樣品中TCK的拷貝數(shù)；
[0014] 其特征在于；所述實時巧光定量PCR反應采用的引物如下：
[00 巧]上游引物 ACGACCGACTTTCCGAGAGC，
[0016] 下游引物 GTGTGGGACGAAGGCATCAA。
[0017] 所述實時巧光定量PCR反應的體系如下：
[0018] 2XUII.raSYBRMix山rc: 10|.il lOuM上游引物; 0.4|il lOuM下游引物： 0.4山
[0019] 模板； 2|j.l
[0020] 加入滅菌蒸饋水至20y1。
[002。 所述實時巧光定量PCR反應的體系程序如下；95°C10分鐘，95°C15秒，60°C60秒， 40個循環(huán)。
[0022] 用于鑒定小麥黑穗菌（Tilletiacontroversa肺hn)的實時巧光定量試劑盒，其 特征在于；包括除DNA模板之外的用于實時巧光定量PCR反應的試劑和標準曲線方程說明 書；
[0023] 所述試劑中的引物如下：
[0024]上游引物 ACGACCGACTTTCCGAGAGC，
[00巧]下游引物 GTGTGGGACGAAGGCATCAA;
[0026] 所述標準曲線方程為TCK陽性質(zhì)粒標準品的實時定量標準曲線的方程，所述標準 曲線的縱坐標為Ct值，橫坐標為所述TCK陽性質(zhì)粒標準品的起始模板拷貝數(shù)。
[0027] 本發(fā)明根據(jù)前期篩選到的TCK和TCT差異基因片段，設計特異于TCK的特異 性引物，基于AB口500巧光定量擴增儀，優(yōu)化Real-TimePCR反應體系，成功地建立 SYBRGreenI巧光染料法定量PCR檢測體系。檢測中利用陽性梯度稀釋標準品的Ct值繪制 成標準曲線，再根據(jù)檢測樣品的Ct值就可W準確地測定祀標病原菌的起始模板的拷貝數(shù)。 同時RT-PCR不需要內(nèi)標，避免了兩種模板（TCK和TCT)之間的干擾和競爭，是一種準確、可 靠的科學定量方法。標準曲線法需要有較高的PCR擴增效率。該檢測體系對重組質(zhì)粒的檢 測靈敏度可達0.Ifg，比常規(guī)PCR的靈敏度高出2~3個數(shù)量級，可用于小麥矮腥黑穗病的 無癥早期診斷和小麥矮腥黑穗菌與其近源種小麥網(wǎng)腥黑穗菌的鑒定，為病害流行學研究W 及鑒定提供新了更靈敏的手段。
[002引本發(fā)明還根據(jù)獲得的特異性引物，W及引物和探針的組合提供了用于鑒定TCK的 試劑盒。
【附圖說明】
[0029] 圖1SYGRgreen法實時擴增曲線
[0030] 圖2SYGRgreen法標準曲線
[0031] 標準曲線方程為；Y= -3. 226X+37. 104R2 = 0. 994
[0032] 圖3SYGRgreen法標準曲線與樣本擴增
[003引圖4SYGRgreen法標準曲線與樣本擴增標準曲線圖[0034]圖5小麥矮腥黑粉菌特異性引物驗證
[003引 1~5小麥矮腥黑粉菌TCK1~TCK5 ;6~7小麥網(wǎng)腥黑粉菌TCT1~TCT2 ; 8~9小麥光腥黑粉菌TFL1~TFL2 ; 10~11小麥條誘菌；12小麥葉誘菌；13小麥白粉菌； 14小麥桿誘菌；15小麥赤霉菌；16雙蒸水
【具體實施方式】
[0036] 1.實驗主要試劑
[0037] 表一使用試劑清單
[0038]
【主權(quán)項】
1?小麥黑穗菌（TilletiacontroversaKUhn)的實時焚光定量鑒定方法，包括如下步 驟： (1) 獲得TCK陽性質(zhì)粒標準品的實時定量標準曲線，其中Ct值為縱坐標，起始模板拷貝 數(shù)為橫坐標； (2) 提取待測樣品的DNA; (3) 以所述待測樣品的DNA為模板進行實時熒光定量PCR反應， (4) 根據(jù)所述實時熒光定量PCR反應獲得的Ct值以及所述實時定量標準曲線得到所述 待測樣品中TCK的拷貝數(shù)； 其特征在于：所述實時熒光定量PCR反應采用的引物如下： 上游引物ACGACCGACITTCCGAGAGC， 下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，所述實時熒光定量PCR反應的體系如下：
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，所述實時熒光定量PCR反應的體系程序如下： 95°C10 分鐘，95°C15 秒，60°C60 秒，40 個循環(huán)。
4. 用于鑒定小麥黑穗菌（TilletiacontroversaKUhn)的實時焚光定量試劑盒，其 特征在于：包括除DNA模板之外的用于實時熒光定量PCR反應的試劑和標準曲線方程說明 書； 所述試劑中的引物如下： 上游引物ACGACCGACITTCCGAGAGC， 下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA; 所述標準曲線方程為TCK陽性質(zhì)粒標準品的實時定量標準曲線的方程，所述標準曲線 的縱坐標為Ct值，橫坐標為所述TCK陽性質(zhì)粒標準品的起始模板拷貝數(shù)。
【專利摘要】本發(fā)明“小麥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的實時熒光定量鑒定方法及試劑盒”，涉及植物病害檢測技術。包括如下步驟：(1)獲得TCK陽性質(zhì)粒標準品的實時定量標準曲線，其中Ct值為縱坐標，起始模板拷貝數(shù)為橫坐標；(2)提取待測樣品的DNA；(3)以所述待測樣品的DNA為模板進行實時熒光定量PCR反應，(4)根據(jù)所述實時熒光定量PCR反應獲得的Ct值以及所述實時定量標準曲線得到所述待測樣品中TCK的拷貝數(shù)；其特征在于：所述實時熒光定量PCR反應采用的引物如下：上游引物ACGACCGACTTTCCGAGAGC下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA；還提供了基于該方法的試劑盒。
【IPC分類】C12R1-645, C12Q1-68, C12Q1-04
【公開號】CN104774919
【申請?zhí)枴緾N201510017724
【發(fā)明人】高利, 陳萬權(quán), 蔚慧欣, 劉太國, 劉博
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年1月14日