專(zhuān)利名稱(chēng)：小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種口岸檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護(hù)領(lǐng)域檢測(cè)用的標(biāo)準(zhǔn)分子，特別是涉及一種小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)分子及其制備方法。
背景技術(shù)：
小麥印度腥黑穗病菌(Tilletiaindica Mitra 異名 Neovossia indica(Mitra) Mundkur)是一種擴(kuò)散較快、危害性很大的病原真菌，已有40多個(gè)國(guó)家將其列為檢疫性有害生物(0ΕΡΡ/ΕΡΡ0，1980 ;CABI/EPP0，1992)。迄今為止，除原產(chǎn)地印度外，該病已在巴基斯坦、伊拉克、尼泊爾、阿富汗、墨西哥、南非和美國(guó)等地都有報(bào)道(Warham，1986 ；Singh et al. , 1989 ；Bonde et al.，1997)，成為威脅世界小麥生產(chǎn)和貿(mào)易的最具危險(xiǎn)性的真菌病害之一。小麥印度腥黑穗病菌主要危害小麥(Triticum aestivum L.)，也可以危害硬質(zhì)小麥(T. durum Desf.)。它不僅能引起小麥減產(chǎn)，使一些田塊的損失高達(dá)89% (Matsumoto et al.，1989)，還降低小麥種子的萌發(fā)率(Goel et al.，1992)，而且更重要的是影響小麥的品質(zhì)(Singh et al.，1990)。小麥印度腥黑穗病的癥狀在田間不易被發(fā)現(xiàn)(Bonde et al., 1997)，通常對(duì)寄主造成局部侵染，沿腹溝在種皮下產(chǎn)生粉狀孢子堆，在籽粒表面形成皰斑； 只有感染嚴(yán)重時(shí)病粒的大部分或全部形成黑粉腔(Zhang et al.，1984)。對(duì)小麥印度腥黑穗病菌的鑒定，早期主要在于比較小麥印度腥黑穗病菌和水稻腥黑粉菌之間的區(qū)別。Aggarwal等、Peterson等分別對(duì)小麥印度腥黑穗病菌冬孢子形態(tài)特征進(jìn)行研究，并建立形態(tài)學(xué)鑒定方法，但由于這些方法未包括美國(guó)于1997年報(bào)道的黑麥草腥黑粉菌，從而使該方法失去了應(yīng)用價(jià)值。Castlebury等對(duì)小麥印度腥黑穗病菌和黑麥草上腥黑粉菌(當(dāng)時(shí)還未定名)等近似種進(jìn)行了比較形態(tài)學(xué)研究，認(rèn)為小麥印度腥黑穗病菌與黑麥草上的腥黑粉菌冬孢子則在大小和顏色上較為接近。章桂明等對(duì)小麥印度腥黑穗病菌及其近似種在光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下冬孢子的形態(tài)特征進(jìn)行了比較，認(rèn)為小麥印度腥黑穗病菌與黑麥草腥黑粉菌非常接近，只獲得少量孢子的情況下難以從形態(tài)學(xué)方面將兩菌區(qū)另lj。1997年后，對(duì)小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)方法的研究主要集中在區(qū)分小麥印度腥黑穗病菌與黑麥草腥黑粉菌。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中分子檢測(cè)方法需要設(shè)置陽(yáng)性參考物質(zhì)對(duì)照，以作為檢測(cè)結(jié)果判定和評(píng)價(jià)以及質(zhì)量控制的依據(jù)，對(duì)分子檢測(cè)方法有重要意義?，F(xiàn)階段小麥印度腥黑穗病菌分子檢測(cè)方法研究中所用的陽(yáng)性參考物質(zhì)通常是小麥印度腥黑穗病菌的基因組DNA。其抽提過(guò)程較復(fù)雜，制備不方便，抽提的基因組DNA穩(wěn)定性也不能滿(mǎn)足長(zhǎng)期及經(jīng)常性使用的需要，并且由于不同檢測(cè)方法或檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室間所用的基因組DNA質(zhì)量存在差異，從而制約了小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及其它分子檢測(cè)方法的推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、具有良好均勻性和穩(wěn)定性的小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子。本發(fā)明的另一目的在于提供上述標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述標(biāo)準(zhǔn)分子的檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開(kāi)了一種小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子，所述標(biāo)準(zhǔn)分子為能夠進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒，且所述質(zhì)粒含有以下序列A和序列B中的至少一種，所述序列A與Genebank中編號(hào)為AF218059的序列99. 56%同源；所述序列B與Genebank中編號(hào)為AF399888的序列99. 85%同源；。在本發(fā)明具體的實(shí)施方式中，所述序列A為kq ID No. 1所示的序列，所述序列B Skq ID No. 2所示的序列。所述質(zhì)粒優(yōu)選為T(mén)載體，更優(yōu)選為pMD19-T。本發(fā)明還公開(kāi)了上述小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，所述方法包括以小麥印度腥黑穗病菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增的引物包括下述引物對(duì) a和引物對(duì)b中的至少一對(duì)，將擴(kuò)增得到的DNA序列轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，引物對(duì)a:Seq ID No. 3 5' -TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3‘Seq ID No. 4 5' -AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3‘引物對(duì)b:Seq ID No. 5 5' -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘Seq ID No. 6 5' -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘。在本發(fā)明具體的實(shí)施方式中，是采用所述引物對(duì)a和引物對(duì)b分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 將引物對(duì)a擴(kuò)增得到的片段與pMD19-T載體進(jìn)行連接，將連接后得到的重組子以及引物對(duì)b 擴(kuò)增得到的片段分別用限制性?xún)?nèi)切酶)(bal和KpnI進(jìn)行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物的大片段，將回收的片段進(jìn)行連接。本發(fā)明還公開(kāi)了上述小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子的檢測(cè)方法，所述方法包括，利用特異性檢測(cè)引物和探針，以所述標(biāo)準(zhǔn)分子為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，并且所述探針5'端和3'端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。所述特異性檢測(cè)引物分別含有kq ID No. 7和kq ID No. 8所示的序列，探針含有kq ID No. 9所示的序列Seq ID No. 7 5' -AGCCATCACTGGAGTTGTCATG-3‘5 ‘ -CCCAGCAAGGTCACCTTTGA-3‘ 5 ‘ -CCGACCGTATCGGTCT-3‘由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于利用本發(fā)明的方法制備得到的小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子，具有可以長(zhǎng)期穩(wěn)定保存、高拷貝數(shù)、易獲得、純度高和制備方便等特點(diǎn)，并且制備簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、具有良好的均勻性和穩(wěn)定性，可以替代小麥印度腥黑穗病菌的基因組DNA用于小麥印度腥黑穗病菌的定性PCR、定量PCR檢測(cè)及分析，解決了小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)分子缺乏的難題。該標(biāo)準(zhǔn)分子適合于口岸檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護(hù)等部門(mén)使用。Seq ID No. 8Seq ID No. 9


圖1為本發(fā)明所述標(biāo)準(zhǔn)分子示意圖。圖2為以引物SZFP254-1、SZFP254-2和探針SZFPb255對(duì)本發(fā)明所述標(biāo)準(zhǔn)分子以及小麥印度腥黑穗病菌基因組DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果圖。圖3為以引物SZFP254-1、SZFP254-2和探針SZFPb255對(duì)本發(fā)明所述標(biāo)準(zhǔn)分子的實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖。圖4為以引物SZFP254-1、SZFP254-2和探針SZFPb255對(duì)本發(fā)明所述標(biāo)準(zhǔn)分子的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為本發(fā)明所述標(biāo)準(zhǔn)分子測(cè)序結(jié)果與網(wǎng)上公布的小麥印度腥黑穗病菌及其近似種線粒體2. 3kb序列比對(duì)結(jié)果。圖6為本發(fā)明所述標(biāo)準(zhǔn)分子測(cè)序結(jié)果與網(wǎng)上公布的小麥印度腥黑穗病菌及其近似種ITS序列比對(duì)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建一、實(shí)驗(yàn)材料1、供試菌株小麥印度腥黑穗病菌截獲來(lái)自印度、巴西和墨西哥小麥，黑麥草腥黑粉菌截獲來(lái)自美國(guó)小麥，上述供試菌株均由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究中心保存 (表 1)。表1供試菌株
菌林編號(hào)種名種學(xué)名來(lái)源采集曰期
Szf76小麥印度股黑穗病菌Tillemindica印度1997
Szf79*小麥印度腥黑穗病菌Tilletia indica巴西2001Szf80小麥印度腥黑穗病菌Tilletia indica墨西哥1997 Szf82小麥印度腥黑穗病菌Tilletia indica印度2001 Szf85 黑麥草腥黑粉菌Tilletiawalkeri美國(guó)2000 Szf86 黑麥草腥黑粉菌Tilletiawalkeri美國(guó)1999注標(biāo)“*”為本研究用于克隆的菌株。2、實(shí)驗(yàn)材料限制性?xún)?nèi)切酶Xbal，KpnI以及限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液，pMD19_T載體，T4DNA連接酶及其緩沖液，dNTPs, Taq DNA聚合酶及其緩沖液、DL2000Marker，Agarose Gel DNA Purification Kit 和 MiniBEST Plasmid Purification Kit 購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。DH5ci感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生物公司。TaqMan探針及引物由上海超世生物科技有限公司合成。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。
二、實(shí)驗(yàn)儀器DY-8型核酸電泳儀(北京六一儀器有限公司)，Biometra Grident PCR儀， Syngene凝膠成像系統(tǒng)，其他儀器包括離心機(jī)，恒溫水浴鍋，培養(yǎng)箱，天平等。三、制備方法1、序列獲得在GenBank中搜索小麥印度腥黑穗病菌及其近似種線粒體2. 3kb片段序列和核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列。2、引物設(shè)計(jì)根據(jù)獲得的線粒體2. 31Λ片段序列和核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，利用軟件ft"imer premier 5. 0設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物(表2)。表2供試引物
權(quán)利要求
1.一種小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)分子為能夠進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒，且所述質(zhì)粒含有以下序列A和序列B中的至少一種，所述序列A為Seq ID No. 1所示序列； 所述序列B為Seq ID No. 2所示序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)準(zhǔn)分子，其特征在于所述序列A為SeqIDNo. 1所示序列與Genebank中編號(hào)為AF218059的小麥印度腥黑穗病菌2. 3kb序列99. 56%同源；所述序列B為Seq ID No. 2所示序列與編號(hào)為AF399888的小麥印度腥黑穗病菌ITS序列99. 85% 同源。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 2任意一項(xiàng)所述的標(biāo)準(zhǔn)分子，其特征在于所述質(zhì)粒為T(mén)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的標(biāo)準(zhǔn)分子，其特征在于所述T載體為pMD19-T。
5.權(quán)利要求1 4任意一項(xiàng)所述的小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，所述方法包括以小麥印度腥黑穗病菌DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增的引物包括下述引物對(duì)a和引物對(duì)b中的至少一對(duì)，將擴(kuò)增得到的DNA序列轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，引物對(duì)a:Seq ID No. 3:5' -TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3‘ Seq ID No. 4:5' -AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3‘ 引物對(duì)b :Seq ID No. 5:5' -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘ SeqIDNo. 6:5' -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于采用所述引物對(duì)a和引物對(duì)b分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將引物對(duì)a擴(kuò)增得到的片段與PMD19-T載體進(jìn)行連接，將連接后得到的重組子以及引物對(duì)b擴(kuò)增得到的片段分別用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和KpnI進(jìn)行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物的大片段，將回收的片段進(jìn)行連接。
7.權(quán)利要求1 4任意一項(xiàng)所述的小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子的檢測(cè)方法，所述方法包括，利用特異性檢測(cè)引物和探針，以所述標(biāo)準(zhǔn)分子為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)， 并且所述探針5'端和3'端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。所述特異性檢測(cè)引物分別含有Seq ID No. 7和Seq ID No. 8所示的序列，探針含有Seq ID No. 9所示的序列Seq ID No. 7:5' -AGCCATCACTGGAGTTGTCATG-3‘ Seq ID No. 8:5' -CCCAGCAAGGTCACCTTTGA-3‘ Seq ID No. 9:5' -CCGACCGTATCGGTCT-3‘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種小麥印度腥黑穗病菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子，為能夠進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒中含有序列A和B中至少一種，A(Seq ID No.1)與小麥印度腥黑穗病菌線粒體DNA上一段2.3kb的核酸序列(AF218059)同源性為99.56％，B(Seq ID No.2)與小麥印度腥黑穗病菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的DNA序列(AF399888)同源性為99.85％。本發(fā)明還公開(kāi)了上述標(biāo)準(zhǔn)分子的制備和檢測(cè)方法。本發(fā)明構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子可以代替小麥印度腥黑穗病菌DNA作為小麥印度腥黑穗病菌分子檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照，適用于對(duì)小麥印度腥黑穗病菌的定性PCR和定量PCR檢測(cè)，適合于口岸檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護(hù)等。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102212518SQ20101014898
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者向才玉, 李小焦, 王穎, 程穎慧, 章桂明, 陳枝楠 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院