專利名稱：一種小麥矮腥黑粉菌的特異性單克隆抗體及免疫熒光檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)，涉及一種小麥矮腥黑粉菌的特異性單克隆抗體以及免疫熒光檢測(cè)法。
背景技術(shù)：
小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kilhn，簡(jiǎn)稱TCK)引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要的國(guó)際檢疫性病害，對(duì)小麥生產(chǎn)具有毀滅性危害，也是我國(guó)外來(lái)生物入侵研究的主要物種之一(王圓.小麥矮腥黑穗病菌[M].中國(guó)進(jìn)境植物檢疫有害生物選編，中華人民共和國(guó)動(dòng)植物檢疫局和農(nóng)業(yè)部植物檢疫實(shí)驗(yàn)所編，北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997，95 98)。在小麥矮腥黑穗病流行年份引起的產(chǎn)量損失一般為20 50%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)75 90%，甚至絕產(chǎn)。病菌抗逆性極強(qiáng)，其冬孢子在土中可存活3 7年，包裹在菌癭中的冬孢子甚至可保持活力長(zhǎng)達(dá)10年以上。此病害一旦發(fā)生，很難防治或根除，所以國(guó)際上有15個(gè)國(guó)家將其列為檢疫對(duì)象加以防范。我國(guó)從20世紀(jì)60年代開(kāi)始一直將此病害列為一類對(duì)外檢疫對(duì)象。在腥黑粉菌中，TCK與其近緣種小麥網(wǎng)腥黑粉菌在形態(tài)學(xué)上極為相似，難于區(qū)別。傳統(tǒng)的病害診斷、檢測(cè)方法主要是依據(jù)病原形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)的特性， 不但過(guò)程繁瑣、時(shí)間周期長(zhǎng)，而且準(zhǔn)確性差、精度不高。分子生物學(xué)手段快速、準(zhǔn)確地鑒別小麥矮腥黑粉菌具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。1996年!^erreira等(Ferreira Μ. A.， Tooley P. W. , Hatziloukas E.etc.Isolation of a species specific mitochondrial DNA sequence for identification of Tilletia indica, the Karnal bunt of wheat fungus [J], Application Environment Microbiology, 1996,62 87 ~ 93)PCR 引進(jìn)到印度腥黑穗病(Tilletia indica Mitra)的鑒定中來(lái)，他們選擇了印度腥黑粉菌線粒體DNA的一個(gè)2. 3kb的EcoR I片段進(jìn)行了克隆和測(cè)序，設(shè)計(jì)的特異性引物Til/Ti4從 25種腥黑穗病菌菌株中鑒定出了印腥。另外，Smith等(Smith 0. P.，Peterson G. L. Beck R. J. etc. Development of a PCR-based method for identification of Tilletia indica, causal agent of karnal bunt of wheat[J]. Phytopathology,1996,86 115 ~ 122)通過(guò)克隆印度腥黑粉菌線粒體DNA的Dra I片段，進(jìn)行了序列分析，設(shè)計(jì)了兩套寡核苷酸引物對(duì)Til7/Ml和 17/Μ2，能分別從印度腥黑粉菌中擴(kuò)增出大小為825bp和IlSbp特異性片段，也實(shí)現(xiàn)了對(duì)印度腥黑穗病的檢測(cè)鑒定工作。2000年Frederic等(Frederick R. D.， Snyder K. Ε. , Tooley P.W.Identification and Differentiation of Tilletia indica and T. walkeri using the Polymerase Chain Reaction[J]. Phytopathology, 2000,90 951-960.)根據(jù)線粒體的差異設(shè)計(jì)了 5對(duì)針對(duì)印度腥黑粉菌的特異性引物和3對(duì)針對(duì)黑麥草腥黑粉菌的特異性引物，分別能將印度腥黑粉菌菌株和黑麥草腥粉菌病菌株從其近緣屬種中鑒別出來(lái)。張競(jìng)宇等(張競(jìng)宇，張正光，鄭小波，等.小麥印度腥黑穗病菌的分子檢測(cè) [J].高技術(shù)通訊，2004，1 :31 36)利用核糖體ITS序列上的差異在Tilletia屬20個(gè)種中設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物T1/T2，能將T. indica和T. walkeri從其它種中區(qū)分開(kāi)來(lái)，而后又根據(jù)T. indica和T. walkeri線粒體之間的差異設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物M1/M2，可以將二者區(qū)分開(kāi)來(lái)，為了使反應(yīng)更為靈敏，建立了套式PCR技術(shù)，以便于提供更簡(jiǎn)單的鑒定方法。梁宏等(梁宏，彭友良，張國(guó)珍，等.腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌rDNA2IGS區(qū)的擴(kuò)增及其序列分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2006，36 (5) =407-412)依據(jù)核糖體的IGSl區(qū)特性，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，可以將小麥光腥黑粉菌菌株從其近緣屬種中鑒別出來(lái)。2004年高強(qiáng)(高強(qiáng).小麥矮腥黑穗病的分子檢測(cè)[D].長(zhǎng)沙，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004)利用RAPD技術(shù)找到了一條可以將小麥網(wǎng)腥黑粉菌菌株和小麥矮腥黑粉菌菌株區(qū)別于其它黑粉菌株的條帶，但是很遺憾在矮腥黑粉菌和網(wǎng)腥黑粉菌之間沒(méi)有找到有差異的條帶，沒(méi)能將二者分開(kāi)。2006年周業(yè)琴，劉素萍等(周業(yè)琴，劉素萍，周國(guó)梁，等.水稻腥黑粉病菌的單孢檢測(cè)[J]。植物檢疫，2006，20: 38 41)應(yīng)用核糖體ITS序列的通用引物Till/Til4和兩對(duì)特異性引物(Hor2/Hor9 ；Hml/ Hm5)結(jié)合建立了套式PCR技術(shù)，可以將水稻腥黑粉菌標(biāo)定出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)室陳萬(wàn)權(quán)、劉太國(guó)、 劉建華利用AFLP技術(shù)，找到了小麥矮腥黑粉菌的特異性片段，能將小麥矮腥黑粉菌從其近緣屬種中區(qū)分開(kāi)來(lái)，該技術(shù)已經(jīng)獲得國(guó)家發(fā)明專利，專利號(hào)為200510080073. 7，本實(shí)驗(yàn)室的另外三個(gè)專利涉及采用ISSR的方法獲得小麥矮腥黑穗病的特異性分子標(biāo)記，靈敏度分別可達(dá)到lng/25ul.分子檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、高通量，但是需要較高的檢測(cè)設(shè)備要求如PCR儀、電泳儀等，并且，這些方法在海關(guān)的實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中不僅耗時(shí)費(fèi)工，且其準(zhǔn)確性和可靠度在很大程度上取決于工作人員的經(jīng)驗(yàn)積累與技術(shù)水平。因此，有必要研發(fā)簡(jiǎn)單易行、靈敏準(zhǔn)確的快速診斷和檢測(cè)技術(shù)，其于鑒別病害、提高病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的準(zhǔn)確度均具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。單克隆抗體技術(shù)，是由單細(xì)胞系列產(chǎn)生的同一種抗體蛋白，其僅與抗原分子中的一個(gè)抗原決定簇結(jié)合，故與抗原性物質(zhì)反應(yīng)時(shí)相對(duì)專一，不受其它物質(zhì)干擾，能區(qū)別物種間的細(xì)微差異。利用該方法檢測(cè)病原菌具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如易于大量生產(chǎn)、可高通量檢測(cè)、免用標(biāo)記物，較易實(shí)現(xiàn)病菌的快速、實(shí)時(shí)、實(shí)地檢測(cè)(Ward et al. ,2004 ；Werres & Steffens， 1994)，促使其迅速在農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。同時(shí)，該方法涉及的儀器化程度較低、操作簡(jiǎn)便，特別是對(duì)樣本前處理要求簡(jiǎn)單易于推廣，國(guó)際上許多權(quán)威機(jī)構(gòu)將其列為優(yōu)先發(fā)展的分析技術(shù)之一。因而，單克隆抗體技術(shù)是實(shí)現(xiàn)田間快速檢測(cè)病原菌的好方法(Danks & Barker，2000 ;Dewey et al. , 1990 ；Ward et al.，2004)。自上世紀(jì) 80 年代以來(lái)，單克隆抗體技術(shù)已廣泛應(yīng)用于一些卵菌病原菌的生物學(xué)、分類學(xué)及致病性方面的研究，諸如 Phytophthora cinnamomi (Hardham et al. , 1986 ；Gabor et al. , 1993), Pythium aphanidermatum(Estrada-Garcia et al. ,1989), 及 Aphanomyces invadans(Miles et al. , 2003),且成功石if 發(fā)了水生真菌 Salmonella sp. , Escherichia coli、Listeria monocytoenes(Bokken et al. ,2003 ；Fratamico et al. , 1998 ；Kouboves et al. ,2001 ； Leonard et al.，2004)及幾種細(xì)菌病原菌單克隆抗體檢測(cè)技術(shù)(Ipbal et al.，2000)。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原 (或抗體)。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光，可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì)胞， 從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、種類。我們采用熒光免疫技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)二種小麥黑粉菌的
4區(qū)別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)小麥矮腥黑粉菌單克隆抗體檢測(cè)的空白現(xiàn)狀，提供一種特異性識(shí)別小麥矮腥黑粉菌的單克隆抗體，分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，結(jié)合免疫熒光技術(shù)，提供一種小麥矮腥黑粉菌免疫熒光檢測(cè)方法的應(yīng)用，具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速的優(yōu)
點(diǎn)ο一種雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為=CGMCC No. 5270。一種小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa KLJHN )的單克隆抗體，由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌而得。上述單克隆抗體在檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌中的應(yīng)用。一種檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板上直接或間接包被有上述單克隆抗體。一種小麥矮腥黑粉菌的酶聯(lián)免疫熒光檢測(cè)方法，步驟如下(1)用水溶解待測(cè)孢子5X105，加入粘片劑，涂于載玻片上，晾干，備用；(2)玻片用PBS洗2次，各5分鐘；(3)在玻片上加上述單克隆抗體作為一抗，4°C，孵育過(guò)夜；(4)復(fù)溫10分鐘，PBS洗5分鐘，3次；(5)在玻片上加PE_cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗孵育37°C，90分鐘，PE_cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG 1 50；(6) PBS洗5分鐘，3次，甘油緩沖液封片；(7)鏡檢，顯示邊緣黃綠色為小麥矮腥黑粉菌，暗褐色邊緣不帶亮色熒光的小麥網(wǎng)腥黑穗病菌。本發(fā)明以小麥矮腥黑粉菌冬孢子為抗原制得了專門分泌抗小麥矮腥黑粉菌冬孢子的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)特異性和血清效價(jià)檢測(cè)，該雜交瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生高特異性和高效價(jià)的小麥矮腥黑粉菌冬孢子抗單克隆抗體。本發(fā)明得到的單克隆抗體可用于檢測(cè)和鑒定小麥矮腥黑粉菌冬孢子。本發(fā)明在獲得該單克隆抗體的基礎(chǔ)上，用熒光素標(biāo)記該單克隆抗體，可實(shí)現(xiàn)在熒光顯微鏡下對(duì)兩種黑粉菌的區(qū)分，使技術(shù)人員可以快速鑒定小麥?zhǔn)欠窀腥拘←湴群诜劬?，并與其他種類致病菌區(qū)分開(kāi)。雜交瘤保藏信息雜交瘤細(xì)胞株名稱抗小麥矮腥黑粉菌冬孢子的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株 3B5-D1。分類命名抗黑粉菌(TCK)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。保藏號(hào)CGMCCNo. 5270。保藏日期2011年9月27日。保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。


圖1.本發(fā)明的單克隆抗體在免疫熒光方法檢測(cè)上的應(yīng)用及結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料小麥矮腥黑粉菌冬孢子，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放。實(shí)施例1 小麥矮腥黑粉菌冬孢子免疫小鼠1.稱量小麥矮腥黑粉菌冬孢子各0. 3mg (5 X IO5個(gè)孢子/ml)，加入675 μ 1生理鹽水與675μ1弗氏完全佐劑(美國(guó)sigma公司，貨號(hào)F5881)制得孢子懸液，放入注射筒中， 將2個(gè)注射筒接起來(lái)，來(lái)回推動(dòng)混勻得到乳化抗原。2.取4 8周齡雌性Balb/C小鼠，取200 μ 1乳化抗原以皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫。3周后，夏孢子懸液與弗氏不完全佐劑混合乳化，3周后，以弗氏不完全佐劑(美國(guó) sigma公司，貨號(hào)F5506)代替弗氏完全佐劑與菌液混合乳化，按照相同劑量及方式進(jìn)行免疫，后續(xù)免疫均按照此方案進(jìn)行。第3次加強(qiáng)免疫后，每次免疫后的第10天進(jìn)行小鼠眼下部位采血，采用間接ELISA法測(cè)定血清的效價(jià)與特異性。3.測(cè)定血清效價(jià)時(shí)，須預(yù)先準(zhǔn)備預(yù)包被有小麥矮腥黑粉菌冬孢子的酶標(biāo)板孔，具體操作如下(1)將步驟1中的冬孢子懸液，以每孔100μ 1加入酶標(biāo)板孔，放置于37°C恒溫箱中孵育16h，取出后以PBS-T (含有0. 05%的吐溫20)洗板3次，再向每孔加入200 μ 1含有
的脫脂奶粉的PBS于37°C封閉池后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2)將梯度稀釋的抗血清100 μ 1加入酶標(biāo)板孔，放置于37°C孵育lh，而后加入用 PBS稀釋1000倍的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37°C孵育Ih后取出洗板。(3)加入100 μ 1的單組份顯色底物(丹麥Kem-en-tec司，貨號(hào)4800H)，37°C孵育 IOmin0(4)以0. 2M的硫酸溶液中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm吸光度值。表1為其中一次的測(cè)定數(shù)據(jù)。表 1
包被原稀釋倍數(shù)抗體稀釋倍數(shù)1000300090002700010002.5252.4291.6970.623實(shí)施例2 小麥矮腥黑粉菌雜交瘤細(xì)胞株的篩選及單克隆抗體的制備取實(shí)施例1中血清效價(jià)較高的小鼠，以實(shí)施例1中的冬孢子懸液150 μ 1加強(qiáng)免疫，于5天后取小鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，“二步篩選法”篩選陽(yáng)性克隆，同時(shí)對(duì)于檢測(cè)出特異性抗體陽(yáng)性孔的細(xì)胞，及時(shí)地轉(zhuǎn)種并進(jìn)行克隆化。采用“有限稀釋法”進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化，將細(xì)胞懸浮液連續(xù)稀釋至統(tǒng)計(jì)上每孔加樣僅含單個(gè)細(xì)胞，接種至培養(yǎng)板，就可由此單個(gè)細(xì)胞繁殖形成同源性的細(xì)胞克隆，有多孔陽(yáng)性時(shí)，盡可能取單克隆孔進(jìn)行再次克隆化，同時(shí)轉(zhuǎn)入M孔板，繼而轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，直至所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清液均為陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選方法與實(shí)施例1中所述血清效價(jià)測(cè)定方法基本相同。唯一不同之處在于將實(shí)施例1中梯度稀釋的抗血清用陽(yáng)性細(xì)胞株的培養(yǎng)液上清進(jìn)行替換。將最終選得的陽(yáng)性細(xì)胞株(保藏號(hào)CGMCC No. 5270)，擴(kuò)大培養(yǎng)后，以體內(nèi)誘生法制備腹水。將制備的腹水中單克隆抗體經(jīng)鹽析沉淀后以蛋白A親和柱層析純化后備用。取與小麥矮腥黑粉菌冬孢子同類的小麥網(wǎng)腥黑穗病菌冬孢子、小麥光腥黑穗病菌冬孢子等，分別按照實(shí)施1的方法包被酶標(biāo)板，用于包被的冬孢子的濃度為0. 5mg/ml，將純化的單克隆抗體稀釋后加入酶標(biāo)板孔，進(jìn)行ELISA測(cè)定。根據(jù)吸光度值結(jié)果判定所篩選的單克隆抗體對(duì)這幾種孢子的交叉反應(yīng)。由表2可知，所制抗體對(duì)于小麥矮腥黑粉菌冬孢子OD值較高(0D > 0. 6，其余均較低(0D < 0. 6)。說(shuō)明本發(fā)明制備的單克隆抗體是對(duì)小麥矮腥黑粉菌的特異性抗體，可用于鑒別診斷小麥矮腥黑粉菌。表權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為CGMCC No. 5270。
2.一種小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa KLJHN )的單克隆抗體，由權(quán)利要求 1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的得。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌中的應(yīng)用。
4.一種檢測(cè)小麥矮腥黑粉菌的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板上直接或間接包被有權(quán)利要求2所述的單克隆抗體。
5.一種小麥矮腥黑粉菌的酶聯(lián)免疫熒光檢測(cè)方法，步驟如下(1)用水溶解待測(cè)孢子5X IO5孢子/毫升，加入粘片劑，涂于載玻片上，晾干，備用；(2)玻片用PBS洗2次，各5分鐘；(3)在玻片上加權(quán)利要求2所述的單克隆抗體作為一抗，4°C，孵育過(guò)夜；(4)復(fù)溫10分鐘，PBS洗5分鐘，3次；(5)在玻片上加PE-cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗孵育37°C，90分鐘，PE-cy3標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 1 50 ；(6)PBS洗5分鐘，3次，甘油緩沖液封片；(7)鏡檢，顯示邊緣黃綠色為小麥矮腥黑粉菌，暗褐色邊緣不帶亮色熒光的為小麥網(wǎng)腥黑穗病菌。
全文摘要
本發(fā)明“一種小麥矮腥黑粉菌的特異性單克隆抗體及免疫熒光檢測(cè)方法”，屬于生物檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明提供了分泌小麥矮腥黑粉菌的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞CGMCC No.5270，以及該單克隆抗體在檢測(cè)和鑒別小麥矮腥黑粉菌中的應(yīng)用，特別是采用該單克隆抗體的試劑盒以及熒光檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102399753SQ20111042471
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者劉博 , 劉太國(guó), 陳萬(wàn)權(quán), 高利 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所