用于鑒別小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌的冬孢子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用激光掃描共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope,CLSM)鑒別小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌的冬孢子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kuhn, TCK)是引起的小麥矮腥黑粉病(Wheat dwarf bunt disease, DB)的一種系統(tǒng)侵染性病害，是麥類(lèi)黑粉病中危害最大、極難防治的國(guó)內(nèi)外重要檢疫性病害之一。該病菌與其近似種小麥網(wǎng)腥黑穗病菌(T.cariesTul.，TCT)、小麥光腥黑穗病菌(T.foeyida.，TFL)在形態(tài)學(xué)上極為相似，不易區(qū)分，這給進(jìn)境美國(guó)小麥的TCK檢疫帶來(lái)相當(dāng)困難。在20世紀(jì)80年代末90年代初，經(jīng)中美兩國(guó)有關(guān)專(zhuān)家多年努力和協(xié)商，最后根據(jù)1986年Stoekwell提出TCK冬孢子具有特異的自發(fā)熒光特性，解決了進(jìn)境美國(guó)小麥中的TCK鑒定問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明嘗試應(yīng)用激光共聚焦顯微掃描術(shù)(CLSM)，探討了 TCK和TFL冬孢子的自發(fā)熒光特性，以克服目前應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)TCK存在的缺點(diǎn)，提高進(jìn)口小麥TCK檢疫水平。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0005]1、用于鑒別小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌的冬孢子的方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0006](I)制片:將小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌的冬孢子分別涂片，干燥后，在鏡檢部位滴加油鏡鏡頭油，再加蓋玻片；
[0007](2)觀察:將制好的玻片放置于激光共聚焦掃描顯微鏡下，選取合適的掃描模式和掃描參數(shù)進(jìn)行掃描觀察并拍照；
[0008]所述掃描模式為xyz掃描模式；
[0009]所述掃描參數(shù)包括激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)；
[0010]其中，小麥矮腥黑穗病菌的激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為510?550nm ;
[0011]小麥光腥黑穗病菌的激發(fā)光波長(zhǎng)為530nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為550?600nm ;或激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為510?550nmo
[0012]2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，小麥光腥黑穗病菌的激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為510?550nm。
[0013]本文應(yīng)用共聚焦激光掃描顯微術(shù)(CLSM)對(duì)小麥矮腥黑穗病(TCK)和小麥光腥黑穗病菌(TFL)冬孢子的自發(fā)熒光特性進(jìn)行了研究。研究表明:在這兩種冬孢子中，它們各自都含有自發(fā)熒光物質(zhì)，而且TCK (激發(fā)光488nm/發(fā)射光510?550nm) ;TFL (激發(fā)光530nm/發(fā)射光550?600nm，激發(fā)光488nm/發(fā)射光510?550nm，但是激發(fā)光488nm/發(fā)射光510?550nm好一些)下焚光分布均勾，大體形態(tài)清楚；但層切掃描發(fā)現(xiàn)自發(fā)焚光在這兩種冬孢子的空間分布存在明顯差異:TCK冬孢子的自發(fā)焚光物質(zhì)主要分布在外孢壁和網(wǎng)脊上，而在原生質(zhì)中分布少；TFL冬孢子的自發(fā)熒光物質(zhì)主要分布在孢壁，原生質(zhì)中分布少。應(yīng)用CLSM在實(shí)際TCK檢測(cè)工作中，能克服熒光顯微鏡存在的檢測(cè)重復(fù)性較差、可靠性小的缺點(diǎn)，提升了 TCK檢驗(yàn)檢疫的技術(shù)水平。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是小麥中TCK和TFL冬孢子在Leica TCS SP5 CLSM系統(tǒng)488nm激發(fā)下的自發(fā)熒光連續(xù)層切掃描圖片:A.TCK冬孢子；B.TFL冬孢子(Ibar = 5 μπι)。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明所述的制品，但并不以此限制本發(fā)明的范圍。如無(wú)特殊說(shuō)明，下述所采用的試劑與材料均可商購(gòu)獲得，所采用的方法均為常規(guī)操作。
_6] 生物材料的來(lái)源
[0017]小麥矮腥黑穗病菌、小麥光腥黑穗病菌菌癭收集自申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室被侵染的小麥植株。
_8] 主要儀器設(shè)備
[0019]Leica TCS SP5 CLSM 系統(tǒng)
[0020]實(shí)施例1.利用本發(fā)明所述方法鑒別TCK和TFL冬孢子
[0021]I材料與方法
[0022]1.1供試材料
[0023]供試病原菌:小麥矮腥黑穗病菌、小麥光腥黑穗病菌菌癭各3株。
[0024]玻片制作:按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18085 一 2000給出的方法制作冬孢子涂片，干燥后，在鏡檢部位加I滴無(wú)熒光物質(zhì)的油鏡鏡頭油，加蓋玻片，制成用于共聚焦激光掃描顯微鏡自發(fā)熒光檢測(cè)的玻片。
[0025]CLSM系統(tǒng):采用高性能的Leica TCS SP8，整個(gè)系統(tǒng)主要由I臺(tái)倒置熒光相差顯微鏡、I組由半導(dǎo)體激光器、氬離子氣體激光器、氦氖離子氣體激光器組成多波長(zhǎng)激光器、以及I臺(tái)控制系統(tǒng)運(yùn)行的工作站構(gòu)成。
[0026]1.2自發(fā)熒光的逐層掃描(xyz掃描)觀察方法
[0027]選取xyz掃描模式，選用激發(fā)波長(zhǎng)488nm/530nm激發(fā)光和系統(tǒng)已設(shè)定好的相應(yīng)程序，分別激發(fā)TCK和TFL冬孢子，進(jìn)行光學(xué)切片，z軸層切掃描分析。
[0028]1.3圖像分析
[0029]根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果所獲得的圖像，觀察自發(fā)熒光在TCK和TFL冬孢子各自的空間分布情況以及小麥中TCK和TFL冬孢子各自的自發(fā)熒光特性。
[0030]2 結(jié)果
[0031]2.1 TCK和TFL冬孢子的xyz掃描
[0032]以488nm/530nm波長(zhǎng)激發(fā)光分別對(duì)TCK和TFL冬孢子進(jìn)行光學(xué)切片，z軸層切掃描，各自獲得30張不同層面的連續(xù)光學(xué)切片掃描圖像。
[0033]2.2 TCK和TFL冬孢子各自的自發(fā)熒光特性
[0034]經(jīng)過(guò)對(duì)小麥中TCK和TCT冬孢子的xy λ和xyz掃描顯示，在兩種冬孢子中，它們各自都含有自發(fā)焚光物質(zhì)，而且都能在488nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)下，在510?550nm范圍中得到相應(yīng)發(fā)射光，熒光光分布均勻，大體形態(tài)清楚，同時(shí)在明場(chǎng)下可觀察到其不同層面的清晰結(jié)構(gòu)。但層切掃描發(fā)現(xiàn)自發(fā)焚光在這兩種冬孢子的空間分布存在明顯差異:TCK冬孢子的自發(fā)熒光物質(zhì)主要分布在外孢壁和網(wǎng)脊上，而在原生質(zhì)中分布少；TFL冬孢子的自發(fā)熒光物質(zhì)主要分布在孢壁，原生質(zhì)中分布少。
[0035]3 討論
[0036]本文首次應(yīng)用CLSM技術(shù)手段，通過(guò)激光共聚焦xyz掃描，描述了 TCK和TFL這兩種冬孢子各自的自發(fā)熒光特性，進(jìn)一步揭示了為何在普通落射熒光顯微鏡(激發(fā)濾片485nm，屏障濾片520nm)下會(huì)觀測(cè)到TCK冬孢子網(wǎng)紋呈黃色或黃綠色，或呈鑲邊現(xiàn)象(僅網(wǎng)紋邊緣具焚光)。而在對(duì)TFL的研究中，一般使用普通光學(xué)顯微鏡區(qū)分，由小麥光腥黑粉菌和小麥網(wǎng)腥黑粉菌引起的普通腥黑穗病除少數(shù)受基因調(diào)控的孢子壁不同之外，這兩種真菌非常相似。它們雜交可以產(chǎn)生一系列的形態(tài)變異個(gè)體，現(xiàn)已觀察到介于光腥黑粉菌和網(wǎng)腥黑粉菌冬抱子形態(tài)之間所有過(guò)渡的自然變異個(gè)體，形態(tài)上的中間類(lèi)型可能代表種間雜種，一般的形態(tài)學(xué)鑒定方法很難將它們區(qū)別開(kāi)。采用CLSM技術(shù)，可準(zhǔn)確、快速鑒別TFL。
[0037]在熒光顯微分析技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的共聚焦激光掃描顯微術(shù)是一種現(xiàn)代的先進(jìn)技術(shù)，由于使用的是激光作為光源，通過(guò)點(diǎn)掃描和高靈敏接收，并進(jìn)行數(shù)字成像，其原理和成像方式與前者有本質(zhì)區(qū)別，后者特別適宜對(duì)弱自發(fā)熒光的觀察。在TCK實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中和原先的熒光顯微術(shù)相比較，使用高性能的共聚焦激光掃描顯微鏡，能夠獲得清晰的數(shù)字掃描圖像，重復(fù)性好，結(jié)果的可靠性較好。因此隨著共聚焦激光掃描顯微鏡在檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)不斷地普及，在TCK檢測(cè)工作中應(yīng)用CLSM，是檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)水平質(zhì)的飛躍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于鑒別小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌的冬孢子的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)制片:將小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌的冬孢子分別涂片，干燥后，在鏡檢部位滴加油鏡鏡頭油，再加蓋玻片； (2)觀察:將制好的玻片放置于激光共聚焦掃描顯微鏡下，選取合適的掃描模式和掃描參數(shù)進(jìn)行掃描觀察并拍照； 所述掃描模式為xyz掃描模式； 所述掃描參數(shù)包括激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)； 其中，小麥矮腥黑穗病菌的激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為510?550nm ; 小麥光腥黑穗病菌的激發(fā)光波長(zhǎng)為530nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為550?600nm ;或激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為510?550nm。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，小麥光腥黑穗病菌的激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為 510 ?550nm。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種用于鑒別小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌的冬孢子的方法，涉及細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括如下步驟：(1)制片：將小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌的冬孢子分別涂片，干燥后，在鏡檢部位滴加油鏡鏡頭油，再加蓋玻片；(2)觀察：將制好的玻片放置于激光共聚焦掃描顯微鏡下，選取合適的掃描模式和掃描參數(shù)進(jìn)行掃描觀察并拍照；所述掃描模式為xyz掃描模式；所述掃描參數(shù)包括激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)；其中，小麥矮腥黑穗病菌的激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為510～550nm；小麥光腥黑穗病菌的激發(fā)光波長(zhǎng)為530nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為550～600nm；或激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為510～550nm。采用所述方法可以快速鑒別出小麥矮腥黑穗病菌和小麥光腥黑穗病菌的冬孢子。
【IPC分類(lèi)】C12R1/645, C12Q1/04
【公開(kāi)號(hào)】CN105039491
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510404497
【發(fā)明人】高利, 蔚慧欣, 陳萬(wàn)權(quán), 劉太國(guó), 劉博
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
【公開(kāi)日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年7月10日