專利名稱：一種鹵蟲卵中海藻糖含量的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種海藻糖含量的檢測方法，特別是一種鹵蟲卵中海藻糖含量的檢測
方法，屬于生物化學技術領域。
背景技術：
卣蟲(Artemia)屬于甲殼動物亞門(Crustacea)鰓足綱(Branchiopoda)無甲目 (Anostraca)鹵蟲科(Artemidae)，是具有重要經(jīng)濟意義的水生甲殼動物，幾乎分布于世界 各地的所有鹽田和高鹽鹽湖。無論兩性生殖還是孤雌生殖，卣蟲均有兩種生產(chǎn)方式，一是卵 胎生，二是卵生。以卵生方式所產(chǎn)的滯育卵稱為休眠卵，休眠卵為含有3000 4000個細胞 的胚胎，外包復雜的胚膜和外殼，能抵御各種不良環(huán)境，并且在干燥狀態(tài)下可以長期保存。 在適宜水分及溫度下可以恢復新陳代謝，孵化為無節(jié)幼體。在鹵蟲生活史中休眠卵的形成 對鹵蟲應對惡劣環(huán)境、種群繁殖起著重要的作用。 鹵蟲卵被作為基礎研究的材料廣泛應用于水生生物學、發(fā)育生物學、遺傳學、生理 學、毒理學、放射生物學、生態(tài)學等學科的研究中，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用的餌料生物。隨 著水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展以及科學研究的逐步深入，鹵蟲卵基礎生物學研究倍受關注。
海藻糖(Trehalose)，又名蘑菇糖、覃糖，它的分子式為C12H220u 2H^，化學名 a -D-吡喃葡萄糖基a -D-吡喃葡萄糖苷(a -D-glycopyranosyl-a -D-glycopyranosid e)，是由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基縮合而成的非還原性雙糖。廣泛存在于細菌、酵 母、真菌、藻類和昆蟲中。海藻糖具有獨特的生物學功能，可以保護蛋白質，生物膜及敏感細 胞的細胞壁免受干旱、冷凍和滲透壓的變化而造成的傷害，可作為不穩(wěn)定藥品、食品和化妝 品的穩(wěn)定劑、多種食品和藥品甜味劑、種子的包衣、冷凍干燥菌株的保護劑等；海藻糖還可 保護DNA防止放射線引起的損傷。 生物化學特性與鹵蟲卵的休眠密切相關，鹵蟲卵在開始休眠時合成具有保護作用 的化合物。研究發(fā)現(xiàn)鹵蟲休眠卵內(nèi)貯存有大量的海藻糖，含量分別約為干卵重的15% 17 % 。海藻糖對膜結構及對卵的超微結構的完整性具有重要的保護作用，可以抵御干燥對 膜造成的破壞。 海藻糖含量的測定在海藻糖工業(yè)生產(chǎn)和應用研究中起到了相當重要的作用，選用 適當?shù)臏y定方法將對生產(chǎn)者和研究者起到事半功倍的效果。現(xiàn)在應用的海藻糖分析方法主 要有紙層析法、薄層層析法、高效液相色譜法、氣相色譜法、蒽酮比色法、酶法等方法。
1、紙層析法 現(xiàn)在，紙層析法在生物化學特別是在糖類的分析中仍得到廣泛的應用。紙層析法 的關鍵是選用合適的展開劑和顯色劑，用于海藻糖分析的展開劑主要有 正丁醇醋酸水=4 : i : 2(v/v) 正丁醇乙醇丙酮水=5 : 4 : 3 : 2(v/v) 醋酸乙酯甲酸醋酸水=30 : 7.5 : 7.5 : 5(v/v) 正丁醇醋酸水=5 : i : 2(v/v)
正丁醇甲酸水=15 : 3 : 2(v/v)
酚水的上層飽和液 顯色劑可用由AgN03的水-丙酮飽和溶液(水丙酮=1 : 200(v/v))與含lgNaOH
晶體的ioog乙醇水溶液(乙醇水=i : i(wWt))兩種溶液組成的顯色劑。 2、薄層層析法 現(xiàn)在海藻糖的定性定量分析，國外主要借助于高效液相色譜，但在我國高效液相
色譜還不普遍的情況下，這一方法的應用往往受到實驗室條件的限制，并且對于菌株篩選、 培養(yǎng)及提取過程中大量的海藻糖進行快速定性定量分析，完全依賴于高效液相色譜也不是 一個高效經(jīng)濟的方法，而用薄層層析法來對海藻糖進行定性定量分析則是十分便利的。應
用時采用硅膠GF254(200X50)板，選用正丁醇吡啶水=15 : 3 : 2(v/v)為展開劑，以 lg酚、5mL的98%濃硫酸溶于100mL95X乙醇中作為顯色劑，同樣能很好的將海藻糖與葡萄
糖、蔗糖等小分子糖分開。同樣還可以用正丁醇乙醇水=2 : i : 1為展開劑、10%
15%硫酸溶液為顯色劑進行海藻糖的定性定量分析。
3、高效液相色譜法 高效液相色譜是理想的高效、快速進行海藻糖定性定量分析的方法。通常采用的 色譜柱是氨基鍵合相柱，檢測裝置為示差折光檢測器。如采用進樣量為5ii L、250X4. 6mm M^柱為色譜柱、乙腈水=7 : 3為流動相、流速為lmL/min、柱溫為室溫、示差折光檢測 器(HP1047A)為檢測器進行海藻糖定性定量分析。 此外，高效陰離子交換-脈沖安培法在海藻糖的定量分析中的應用也有報道。該 方法屬于高效液相色譜的一種，它的基本原理是若將糖溶液的pH提高至12 14，中性糖類
化合物的羥基會發(fā)生完全的或部分的解離而形成氧負離子，可以進行陰離子交換。
4、氣相色譜法 氣相色譜也可以用于糖組分的分離與檢測上，因為糖是不揮發(fā)性物質，所以，必需 制成相應的揮發(fā)性衍生物。氣相色譜來分析糖類時，用得最多的揮發(fā)性化合物是TMS(三 甲基硅烷基)衍生物。Glaever等用氣相色譜對海藻糖進行了測定，測定條件及步驟如下 He氣為載氣，注射器和檢測器溫度分別為25(TC和30(TC，柱溫在19(TC保持2min，接著以 30°C /min的速率升至250°C ，再在此溫度下保持10min，將海藻糖樣品(先經(jīng)過冷凍干燥) 溶解于20 i！ L的二甲基酰胺中，然后再加20 ii L的二 (三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺(含 1%三甲基氯硅烷)進行三甲基硅烷化。
5、蒽酮比色法 蒽酮比色法是目前常用的定糖方法，其原理是糖類(包括多糖)在硫酸作用下脫 水生成糠醛或羥甲基糠醛，然后蒽酮與糠醛或羥甲基糠醛經(jīng)脫水縮合產(chǎn)生藍綠色曲糠醛衍 生物，顏色的深淺即可作為定量的依據(jù)。
6、酶法 海藻糖的酶法測定是近年發(fā)展起來的一種測定方法，它的基本原理是通過海藻糖 酶對海藻糖的特異性水解，產(chǎn)生的葡萄糖再用葡萄糖氧化酶_過氧化物酶系統(tǒng)進行檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種鹵蟲卵中海藻糖含量的檢測方法。該方法
4通過超聲細胞破碎儀，選擇合適的超聲破碎條件，處理鹵蟲卵細胞，然后利用薄層層析法， 選擇合適的展開劑和顯色劑，定性定量檢測出海藻糖的含量。
本發(fā)明過程中涉及的技術方案詳述如下 —種鹵蟲卵中海藻糖含量的檢測方法，包括超聲破碎細胞、破碎后細胞處理、薄層
層析法檢測，步驟如下 (1)超聲破碎細胞 將質量濃度為1_10%的鹵蟲卵水混合物，用超聲細胞破碎儀處理，破碎條件為功 率200-300W，超聲細胞破碎儀循環(huán)破碎20-30min，每個循環(huán)超聲細胞破碎儀工作5_10s間 歇5-10s，得鹵蟲卵漿液；
(2)破碎后細胞處理 將經(jīng)過步驟(1)制得的鹵蟲卵槳液在5000 10000r/min的條件下離心處理10 20min，取上清液即為胞槳海藻糖溶液；
(3)薄層層析法檢測 將經(jīng)過步驟(2)得到的胞漿海藻糖溶液在層析板上點樣，樣品經(jīng)過展開劑在層析 板上展開后，干燥，然后噴顯色劑顯色，得海藻糖樣品顯色斑，再通過以下方法之一測得海 藻糖的濃度 a、將海藻糖樣品顯色斑與海藻糖標準濃度顯色斑的顏色深淺進行對比得出海藻 糖的濃度； b、通過洗脫測定法測得海藻糖的濃度；
c、原位掃描法測得海藻糖的濃度；
然后根據(jù)公式
海藻糖的濃度x樣品體積
X 1 (JU%
鹵蟲卵質量 計算得到鹵蟲卵海藻糖含量； 上述展開劑為正丁醇吡啶水按體積比4 :3:i混合，上述顯色劑為硫酸 甲醇按體積比i:4混合。 上述點樣的點樣量為2 4uL。
上述干燥條件為106。C干燥30min。 所述的海藻糖樣品顯色斑與海藻糖標準濃度顯色斑的顏色深淺進行對比通過制 作海藻糖標準濃度梯度，得到海藻糖標準濃度顏色梯度顯色斑，將海藻糖樣品顯色斑顏色 與海藻糖標準濃度顏色梯度顯色斑進行對比獲得海藻糖樣品的濃度。如可將海藻糖標準濃 度梯度設置為由1. Omg/ml開始，每升高0. lmg/ml增加一個標準樣，直到2. Omg/ml止的含 有11個標準樣的濃度梯度，然后經(jīng)展開與顯色，得到含有11個標準樣的海藻糖標準濃度顏 色梯度顯色斑，然后將海藻糖樣品與海藻糖標準濃度顏色梯度顯色斑對照，得到海藻糖樣 品的濃度。 所述的洗脫測定法或原位掃描法均為本領域常規(guī)檢測技術。洗脫測定法，將展開 后的組分顯色斑處的吸附劑刮下，用適宜溶劑將組分洗脫溶出，然后用適當方法進行定量 測定，常用方法為比色法、紫外_可見分光光度法，也可用電化學分析法等對海藻糖的濃度進行測定；原位掃描法，將展開后的薄層板放在光密度計內(nèi)，以一定波長的光照射，同時使 顯色斑移過光路，由于顯色斑對光的吸收，可繪出峰形曲線，由峰面積與海藻糖標準濃度樣 品的吸收相比較而求出海藻糖的濃度。
本發(fā)明有益效果如下 1、本發(fā)明采用超聲波破碎方法破碎鹵蟲卵，比起傳統(tǒng)化學法去除卵殼或者通過研 磨等物理方法，有著破碎徹底、破碎時間短，不會引入其他干擾物質的優(yōu)點。在本發(fā)明所述 的超聲波條件下處理，海藻糖釋放徹底，整個過程簡單、便捷，不會引入其他有機溶劑，有利 于后期海藻糖的檢測。經(jīng)研究，超聲波功率太高或者工作時間太長，可導致多聚物降解、酶 失活、脂質過氧化等，產(chǎn)生雜質多，點樣后展開效果和顯色效果差，不利于后期對海藻糖的 檢測；功率太低或者工作時間太短，不利于細胞完全破碎，海藻糖不能完全釋放出來，影響 檢測的準確度。 2、本發(fā)明中的展開劑和顯色劑可以使海藻糖展開充分，顯色效果明顯，使直接進 行肉眼觀察比色成為可能，如采用傳統(tǒng)展開劑和顯色劑只能定性判斷，無法定量檢測。薄層 層析中顯色劑和展開劑的選擇直接關系到顯色的效果，直接影響海藻糖檢測的準確度。采
用展開劑為正丁醇吡啶水按體積比4 : 3 : i混合，其他比例不能使海藻糖充分展開， 顯色點較長，不利于觀察；顯色劑為硫酸甲醇按體積比i : 4混合，其他比例顯色的顏色 較淺，影響準確度。選擇合適的展開劑和顯色劑。


圖1為采用傳統(tǒng)展開劑展開后的結果； 圖2為采用傳統(tǒng)顯色劑顯色后的結果； 圖3為采用本發(fā)明中展開劑和顯色劑后的結果； 圖4為實施例1的檢測結果； 圖5為實施例2的檢測結果； 圖6為實施例3的檢測結果； 其中圖1-6下端為點樣處，上端為海藻糖顯色點，左列是標準品，右列是樣品。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發(fā)明技術方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不僅限 于此。 正丁醇購自天津市廣成化學試劑有限公司，純度為99% ;吡啶購自天津市科密歐 化學試劑有限公司，純度為99. 5%;硫酸購自萊陽市康德化工有限公司，純度為95-98%;甲 醇購自山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司，純度為99.9% ;鹵蟲卵購自濱州港友發(fā)水產(chǎn)有 限公司；超聲細胞破碎儀為寧波新芝生物科技股份有限公司JY92-2D型超聲細胞破碎儀。
實施例1 稱取鹵蟲卵產(chǎn)品5g，用蒸餾水配成400mL的溶液。用超聲細胞破碎儀處理，破碎條 件為功率200W，工作時間10s，間歇時間10s，總過程30min。破碎后的鹵蟲細胞溶液10000r/ min離心10min，選取上清液點樣。點樣時，選擇海藻糖標準樣濃度為lmg/ml，點樣量2ul ; 鹵蟲樣品的點樣量2ul。
選擇展開劑為正丁醇吡啶水按體積比4 : 3 : i，配20mi，放入層析缸層析，
結束后選擇顯色劑為硫酸甲醇按體積比l : 4，配25ml，用噴射裝置噴灑在層析板上。放 入烘箱，106t:烘干30min，即可顯色。如圖4所示。左邊是海藻糖標準品，右邊是樣品，通過 對比顯色斑顏色深淺，得到卵胞液中海藻糖濃度約為1. 5g/L，干卵細胞中海藻糖含量約為 1. 5*0. 4/5 = 12%。
實施例2 稱取鹵蟲卵產(chǎn)品lg，用蒸餾水配成100ml的溶液。用超聲細胞破碎儀處理，破碎條 件為功率300W，工作時間5s，間歇時間5s，總過程20min。破碎后的鹵蟲細胞溶液5000r/ min離心20min，選取上清液點樣。點樣時，選擇海藻糖標準樣濃度為lmg/ml，點樣量2ul ; 鹵蟲樣品的點樣量2ul。
選擇展開劑為正丁醇吡啶水按體積比4 : 3 : i，配20mi，放入層析缸層析，
結束后選擇顯色劑為硫酸甲醇按體積比l : 4，配25ml，用噴射裝置噴灑在層析板上。放 入烘箱，106t:烘干30min，即可顯色。如圖5所示。左邊是海藻糖標準品，右邊是樣品，通 過對比顯色斑顏色深淺，得到卵胞液中海藻糖濃度約為lg/L，干卵細胞中海藻糖含量約為 1*0. 1/1 = 10%。
實施例3 稱取鹵蟲卵產(chǎn)品0. 5g，用蒸餾水配成40ml的溶液。用超聲細胞破碎儀處理，破碎 條件為功率250W，工作時間8s，間歇時間8s，總過程25min。破碎后的鹵蟲細胞溶液8000r/ min離心15min，選取上清液點樣。點樣時，選擇海藻糖標準樣濃度為lmg/ml，點樣量4ul ; 鹵蟲樣品的點樣量3ul。
選擇展開劑為正丁醇吡啶水按體積比4 : 3 : i，配20mi，放入層析缸層析，
結束后選擇顯色劑為硫酸甲醇按體積比l : 4，配25ml，用噴射裝置噴灑在層析板上。放 入烘箱，106t:烘干30min，即可顯色。如圖6所示。左邊是海藻糖標準品，右邊是樣品，通過 對比顯色斑顏色深淺，得到卵胞液中海藻糖濃度約為1. 3g/L，干卵細胞中海藻糖含量約為 1. 3*0. 04/0. 5 = 10%。
實施例4 如實施例1所述，不同之處在于，通過制作海藻糖標準濃度梯度，得到海藻糖標準 濃度顏色梯度顯色斑(制作方法同海藻糖樣品顯色斑的制作方法)，將海藻糖樣品顯色斑 顏色與海藻糖標準濃度顏色梯度顯色斑進行對比獲得海藻糖樣品的濃度。海藻糖標準濃度 梯度設置為由1. Omg/ml開始，每升高0. lmg/ml增加一個標準樣，直到2. Omg/ml止的含有 ll個標準樣的濃度梯度。
實施例5 如實施例1所述，不同之處在于，通過洗脫測定法測得海藻糖的濃度將展開后的 組分顯色斑處的吸附劑刮下，用水將層析板上樣品顯色斑處的海藻糖洗脫溶出，然后用電 化學分析法對海藻糖的濃度進行測定；測得海藻糖的濃度為1.49g/L，經(jīng)計算，得海藻糖的 含量為1. 49*0. 4/5 " 12%。
實施例6 如實施例1所述，不同之處在于，通過原位掃描法測得海藻糖的濃度為1. 49g/L， 經(jīng)計算，得海藻糖的含量為1. 49*0. 4/5 "12%。
權利要求
一種鹵蟲卵中海藻糖含量的檢測方法，包括超聲破碎細胞、破碎后細胞處理、薄層層析法檢測，步驟如下(1)超聲破碎細胞將質量濃度為1-10％的鹵蟲卵水混合物，用超聲細胞破碎儀處理，破碎條件為功率200300W，超聲細胞破碎儀循環(huán)破碎20-30min，每個循環(huán)超聲細胞破碎儀工作5-10s間歇5-10s，得鹵蟲卵漿液；(2)破碎后細胞處理將經(jīng)過步驟(1)制得的鹵蟲卵漿液在5000～10000r/min的條件下離心處理10～20min，取上清液即為胞漿海藻糖溶液；(3)薄層層析法檢測將經(jīng)過步驟(2)得到的胞漿海藻糖溶液在層析板上點樣，樣品經(jīng)過展開劑在層析板上展開后，將層析板干燥，然后向干燥后的層析板噴顯色劑顯色，得到海藻糖樣品顯色斑，再通過以下方法之一測得海藻糖的濃度a、將海藻糖樣品顯色斑與海藻糖標準濃度顯色斑的顏色深淺進行對比得出海藻糖的濃度；b、通過洗脫測定法測得海藻糖的濃度；c、原位掃描法測得海藻糖的濃度；然后根據(jù)公式計算得到鹵蟲卵海藻糖含量；上述展開劑為正丁醇∶吡啶∶水按體積比4∶3∶1混合，上述顯色劑為硫酸∶甲醇按體積比1∶4混合。FSA00000075750800011.tif
2. 如權利要求1所述的鹵蟲卵中海藻糖含量的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中點樣 的點樣量為2 4uL。
3. 如權利要求1所述的鹵蟲卵中海藻糖含量的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中干燥 條件為106。C干燥30min。
4. 如權利要求l所述的鹵蟲卵中海藻糖含量的檢測方法，其特征在于，步驟(3)a方法 中，所述的海藻糖樣品顯色斑與海藻糖標準濃度顯色斑的顏色深淺進行對比通過制作海藻 糖標準濃度梯度，得到海藻糖標準濃度顏色梯度顯色斑，將海藻糖樣品顯色斑顏色與海藻 糖標準濃度顏色梯度顯色斑進行對比獲得海藻糖樣品的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海藻糖含量的檢測方法，特別是一種鹵蟲卵中海藻糖含量的檢測方法，屬于生物化學技術領域。一種鹵蟲卵中海藻糖含量的檢測方法，包括超聲破碎細胞、破碎后細胞處理、薄層層析法檢測。本發(fā)明的檢測方法是通過超聲破碎鹵蟲卵細胞，利用薄層層析法定性定量測定海藻糖含量。與傳統(tǒng)方法相比，具有前處理簡單，結果直觀明顯，檢測快速便捷等優(yōu)點。
文檔編號G01N1/28GK101793884SQ20101013904
公開日2010年8月4日 申請日期2010年4月6日 優(yōu)先權日2010年4月6日
發(fā)明者徐汝意, 李丕武, 王瑞明, 王騰飛, 馬春玲 申請人:山東輕工業(yè)學院