一種黃芪注射液初生代謝成分的含量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物含量檢測方法，尤其是一種黃芪注射液的含量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃芪注射液是近幾年開發(fā)的中藥制劑，具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾 利濕之功，主要用于治療心氣虛損、血脈痰之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虛濕困之肝 炎。本品作為臨床常用藥物，國內(nèi)目前有十幾家生產(chǎn)廠家生產(chǎn)。中國藥典和部頒標準中黃 芪藥材和黃芪注射液的定量指標成分為黃芪甲苷，傳統(tǒng)檢測黃芪注射液中有效成分的方法 選擇高效液相色譜法（HPLC)，盡管該方法具有許多優(yōu)點，但仍然在以下缺陷：1、色譜分離 損失：常用ODS色譜柱在分離過程損失極性較大的水溶性成分；2、缺乏通用型檢測器：只能 在同一張譜圖下檢測出某類或某幾類化學成分；3、標準品難分離：不易獲得，為成分的鑒 定和定量分析帶來的困難，同時也提高了工業(yè)生產(chǎn)成本。
[0003]定量質(zhì)子核磁共振（quantitative proton nuclear magnetic resonance，c^H-NMR)技術(shù)是一種日益成熟的儀器分析方法，現(xiàn)已在化學、食品、農(nóng)業(yè)以及軍 事領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，可用于標準物質(zhì)的純度檢測，也可用于混合物中各種成分的含量測 定。dH-NMR用于藥物分析的最大優(yōu)勢在于可同時提供化合物結(jié)構(gòu)確證的定性信息和含量 測定的定量信息。與HPLC方法相比，該方法無需待測物對照品、樣品預(yù)處理步驟簡單、專屬 性強、測試速度快、不破壞樣品等優(yōu)點。dH-NMR常用定量方法為絕對定量法，即以含量已 知的內(nèi)標物與待測物制成混合溶液同時測定圖譜，通過二者峰面積的比值確定待測物的含 量。在對混合物中的成分進行定量分析時，其關(guān)鍵在于定量峰的選擇，選擇各個成分中完 全獨立、無干擾的特征信號峰才可用于該化合物的含量測定。在將iH-NMR指紋圖譜技術(shù)引 入中藥注射液的化學成分表征中所面臨的難題是^H-NMR圖譜的化學位移值范圍通常比較 窄（0-12ppm)，在該區(qū)間內(nèi)質(zhì)子信號峰相互重疊嚴重，不易尋找到完全獨立的信號峰用于化 合物定量。解卷積（Global Spectral Deconvolution，GSD)是一種新興的1H-NMR圖譜處 理方法，通過對全譜反褶積的精確校正，準確鑒別復(fù)雜峰形，為譜圖中每個復(fù)雜峰整合重疊 信號，分離出重疊的信號峰，并提供完整的峰值和偶合常數(shù)J。解卷積處理方法的優(yōu)勢在于 iH-NMR譜在有雜質(zhì)峰、信號重疊和信噪比不高的情況，仍然可以使用積分面積確定化合物 的濃度。
[0004] 2014年9月3號公開的CN104181186A專利申請中報道有關(guān)黃芪注射液的屯-匪1? 指紋圖譜的構(gòu)建方法，僅定性描述了黃芪注射液中的25種成分，但是對各個成分的定量分 析未能闡明。然而特征性成分的含量測定是中藥注射液質(zhì)量控制的重要組成部分。因此， 針對黃芪注射液中的特征性成分，尤其是初生代謝產(chǎn)物，尋找一種高效、準確的定量方法具 有非常重要的應(yīng)用價值。本發(fā)明運用iH-NMR圖譜表征黃芪注射液中的初生代謝產(chǎn)物，包括 氨基酸、有機酸和糖類化合物；應(yīng)用解卷積方法抽提特征性成分的質(zhì)子信號定量峰；建立 多指標成分的含量測定方法及方法學考察程序；應(yīng)用該方法測定不同廠家不同批次黃芪注 射液樣品的 1H-NMR譜，比較特征性成分的含量差異。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種黃芪注射液初生代謝成分的含量檢測 方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] -種黃芪注射液初生代謝成分的含量檢測方法，基于解卷積（GSD)定量核磁共振 技術(shù)對黃芪注射液的中藥成分進行含量測定，具體步驟為：
[0008] (1)黃芪注射液樣品溶液的制備
[0009] 將黃芪注射液樣品凍干后精密稱取10mg，加入0. 6ml重水（D20,含內(nèi)標TSP 0. 2078mg/ml)，轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中，加封直接用于1H-NMR測試；
[0010] (2) iH-NMR指紋圖譜的測定
[0011] 將核磁管置于核磁共振儀中，采用水峰抑制脈沖序列測定黃芪注射液樣品溶液的 iH-NMR指紋圖譜和對照品溶液的 1H-NMR圖譜，其中測試參數(shù)及條件為：抑水峰序列zgcppr， 觀測頻率600. 23MHz，測定溫度298K，譜寬7211. 5Hz，90°脈沖寬度13. 8700 y s，采樣數(shù)據(jù) 點65536,掃描次數(shù)16次，延遲時間15s，接受增益114 ;
[0012] (3)質(zhì)子信號峰的定性鑒別
[0013] 黃芪注射液溶液的1H-NMR圖譜上質(zhì)子信號峰分布在S 0-5. 5之間，其中 S 0. 0-3. 2是氨基酸和有機酸質(zhì)子特征信號區(qū)，S 3. 3-5. 5是糖基質(zhì)子特征信號區(qū)，根據(jù)質(zhì) 子信號峰的化學位移值和偶合裂分情況，結(jié)合黃芪注射液的二維核磁圖譜信息，共鑒定出 20種初生代謝成分和4種次生代謝成分，分別為
[0014] 表1黃芪注射液初生代謝成分1H-NMR歸屬
[0015]
【主權(quán)項】
1. 一種黃芪注射液中初生代謝成分的含量檢測方法，其特征在于：基于定量核磁共振 技術(shù)和解卷積處理方法對黃芪注射液中的多種成分同時進行含量測定，具體步驟為： (1) 黃芪注射液樣品溶液的制備 將黃芪注射液樣品凍干后精密稱取l〇mg，加入0.6ml含內(nèi)標TSPO. 2078mg/ml的D20， 轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中，加封直接用于1H-NMR測試； (2) 4-鳩?指紋圖譜的測定 將核磁管置于核磁共振儀中，采用水峰抑制脈沖序列測定黃芪注射液樣品溶液的iH-NMR指紋圖譜和對照品溶液的1H-NMR圖譜，其中測試參數(shù)及條件為：抑水峰序列zgcppr， 觀測頻率600. 23MHz，測定溫度298K，譜寬7211. 5Hz，90°脈沖寬度13. 8700ys，采樣數(shù)據(jù) 點65536,掃描次數(shù)16次，延遲時間15s，接受增益114 ; (3) 質(zhì)子信號峰的定性鑒別 黃芪注射液溶液的1H-NMR圖譜上質(zhì)子信號峰分布在S0-5. 5之間，其中S〇. 0-3. 2是 氨基酸和有機酸質(zhì)子特征信號區(qū)，S3. 3-5. 5是糖基質(zhì)子特征信號區(qū)，根據(jù)質(zhì)子信號峰的化 學位移值和偶合裂分情況，結(jié)合黃芪注射液的二維核磁圖譜信息，共鑒定出20種初生代謝 產(chǎn)物和4種次生代謝成分； (4) iH-NMR多成分的含量測定 以3-(三甲基甲硅烷基）丙酸-d4鈉鹽為內(nèi)標化合物，應(yīng)用以下公式測定黃芪注射液 中8種初生代謝成分乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸的濃度：
其中Px和PTSP分別為化合物和TSP的濃度，Ax和ATSP分別是化合物定量峰和TSP甲基 峰的積分面積，隊和NTSP分別代表化合物定量峰和TSP甲基峰的質(zhì)子個數(shù)，MMTSP分別是 化合物和TSP的分子量； (5) iH-NMR譜的處理和解卷積參數(shù)設(shè)置 采用MetresNova軟件對得到的屯-匪1?指紋圖譜依次進行相位調(diào)整、基線校正、定標和 解卷積處理，解卷積參數(shù)設(shè)置中J-Tolerance的設(shè)定值為0. 4Hz，即可根據(jù)步驟（4)所述方 法測定黃芪注射液8種初生代謝成分的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃芪注射液中初生代謝成分的含量檢測方法，其特征在于： 所述步驟（3)中20種初生代謝成分和4種次生代謝成分，分別為：
CN10469802：1A ，丨入，丨，T 3/3 貝
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種黃芪注射液初生代謝成分的含量檢測方法，基于定量核磁共振技術(shù)和解卷積(GSD)處理方法對黃芪注射液中的多種初生代謝成分同時進行含量測定，具體步驟為：(1)黃芪注射液樣品溶液的制備；(2)1H-NMR指紋圖譜的測定；(3)質(zhì)子信號峰的定性鑒別；(4)1H-NMR多成分的含量測定；(5)1H-NMR譜的處理和解卷積參數(shù)設(shè)置；所述方法具有簡便易行、穩(wěn)定性好、精密度高、重現(xiàn)性好、專屬性強等特點，在全面檢測黃芪注射液質(zhì)量方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】G01N24-08
【公開號】CN104698021
【申請?zhí)枴緾N201510031725
【發(fā)明人】姜苗苗, 王躍飛, 陳燕燕, 李曉男
【申請人】天津中醫(yī)藥大學
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年1月22日