專利名稱：：從基因組dna中快速擴(kuò)增目的基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種關(guān)于基因克隆的方法。
背景技術(shù)：
：目前，擴(kuò)增目的基因常用方法有兩種PCR擴(kuò)增和基因合成。傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增比較繁瑣，因?yàn)榛蚪M中含有內(nèi)含子，以及一些特殊基因的低拷貝數(shù)，加上其他一些不能確定的因素，要從基因組DNA中直接擴(kuò)增獲得目的基因幾乎是不可能的，所以一般都是經(jīng)過組織RNA提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后應(yīng)用傳統(tǒng)的PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的基因。而其中的RNA提取操作過程要求嚴(yán)格，且很容易失?。患由弦恍┖心康幕虻慕M織很難得到，所以此種方法有一定的局限性。應(yīng)用化學(xué)合成的方法雖然可以得到目的基因，但是如果所需基因片段較長合成費(fèi)用將會很昂貴。隨著人類基因組計(jì)劃以及一些真核生物基因組測序的完成，從基因組數(shù)據(jù)庫查找所需基因的信息已不是難事，利用各種PCR技術(shù)擴(kuò)增或是合成目的基因也已成為研究熱點(diǎn)ο
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種快速從基因組DNA中擴(kuò)增目的基因的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采用以下技術(shù)方案從基因組DNA中快速擴(kuò)增目的基因的方法，其包括如下步驟①基因組DNA制備；②設(shè)計(jì)基因外顯子的擴(kuò)增引物；③外顯子擴(kuò)增，分別擴(kuò)增各個外顯子；④基因片段擴(kuò)增。進(jìn)一步的技術(shù)方案是，設(shè)計(jì)基因外顯子的擴(kuò)增引物的具體過程是，先查到基因的外顯子序列信息，針對每個外顯子分別設(shè)計(jì)重疊引物(設(shè)計(jì)方式遵從一般引物設(shè)計(jì)規(guī)則即可)。第一個外顯子的反向引物和最后一個外顯子的正向引物分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)。外顯子擴(kuò)增的擴(kuò)增程序選用touch-downPCR程序。再進(jìn)一步的技術(shù)方案是，基因片段擴(kuò)增的具體過程是，將步驟③中擴(kuò)增得到的所有外顯子膠回收純化后等體積混合后作為模板，用第一個外顯子的反向引物和最后一個外顯子的正向引物擴(kuò)增得到目的基因片段，擴(kuò)增程序選用touch-downPCR程序。本發(fā)明即是通過一種特殊的引物設(shè)計(jì)方法，首先從基因組中擴(kuò)增出所需的外顯子，純化后混合，再用兩端引物，在Touch-down的程序中擴(kuò)增出所需的目的基因。這種基因拼接的方法，避免了RNA制備、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過程，因此可以快速準(zhǔn)確的在數(shù)小時內(nèi)完成基因克隆，同時應(yīng)用這種方法可以克隆任一知道序列信息的cDNA序列，且擴(kuò)增長度不受限制。申請人已利用該技術(shù)成功克隆長度1540bp的人a-葡萄糖苷酶基因片段及長度1365bp的人MICA基因，具體過程在后續(xù)具體實(shí)施方式中詳述。圖1為外顯子擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)原理示意圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明的基因擴(kuò)增方法作進(jìn)一步的具體說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一人a_葡萄糖苷酶基因片段擴(kuò)增1.人基因組DNA的制備健康人的血液樣本由四醫(yī)大兒科實(shí)驗(yàn)室惠贈，全血基因組DNA提取試劑盒(溶液型)購自長沙聯(lián)博志達(dá)生物技術(shù)公司。基因組DNA提取方法按照試劑盒說明操作，所得人基因組DNA于_20°C保存?zhèn)溆谩?.人a-葡萄糖苷酶基因第25到第36個外顯子的擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)根據(jù)查到的人a_葡萄糖苷酶基因的外顯子序列信息(NM_004668.2)，針對12個外顯子分別設(shè)計(jì)重疊引物，具體操作如圖1所示(僅為原理示意圖)12個外顯子設(shè)計(jì)引物序列如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>其中Hgluex25F,Hgluex36R兩引物(即第一個外顯子的反向引物和最后一個外顯子的正向引物)分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)以方便克隆到后面用到的載體中，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)分別為XhoI和SacI。3.外顯子擴(kuò)增應(yīng)用上述引物先分別擴(kuò)增12個外顯子，體系如下50μ1體系ddH2037μ125mMMg2+3μ110XPCRbuffer5μ1IOmMdNTP1μ1引物1Ιμ引物21μ1模板1.5μ1Pfu酶0·5μ1引物1和引物2分別指待擴(kuò)增外顯子的正向引物和反向引物，模板即步驟1中所制備的基因組DNA。擴(kuò)增程序均選用touch-downPCR程序。即94°C5min預(yù)變性，退火溫度從64-54°C每降一度為一循環(huán)共10個循環(huán)(其中解鏈溫度為94°C30s，退火30s，延伸溫度為72°Clmin)，然后于54°C循環(huán)25圈，72°C延伸lOmin。4.人a-葡萄糖苷酶基因片段(2860bp_4399bp)擴(kuò)增將上步擴(kuò)增得到的12個外顯子膠回收純化后等體積混合后作為模板，用引物Hgluex25F,Hgluex36R擴(kuò)增得到人a_葡萄糖苷酶基因片段(2860bp_4399bp)。反應(yīng)體系同上，擴(kuò)增程序選用touch-downPCR程序。即94°C5min預(yù)變性，退火溫度從64_54°C每降一度為一循環(huán)共10個循環(huán)(其中解鏈溫度為94°Clmin，退火lmin，延伸溫度為72°C2min)，然后于54°C循環(huán)25圈，72°C延伸lOmin。實(shí)施例二人MICA基因的克隆1.人基因組DNA的制備人基因組DNA的制備方法同實(shí)施例一。2.人MICA基因克隆的引物設(shè)計(jì)根據(jù)查到的人a_葡萄糖苷酶基因的外顯子序列信息(NM_000247.1)，針對6個外顯子分別設(shè)計(jì)重疊引物，設(shè)計(jì)原理如附圖1所示。6個外顯子設(shè)計(jì)引物序列如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.外顯子擴(kuò)增應(yīng)用上述引物先分別擴(kuò)增6個外顯子，體系如下50μ1體系ddH2037μ125mMMg2+3μ110XPCRbuffer5μ1IOmMdNTP1μ1引物1Ιμ引物21μ1模板1.5μ1Pfu酶0·5μ1引物1和引物2分別指待擴(kuò)增外顯子的正向引物和反向引物，模板即本實(shí)施例步驟1中所制備的基因組DNA。擴(kuò)增程序均選用touch-downPCR程序。即94°C5min預(yù)變性，退火溫度從62-52°C每降一度為一循環(huán)共10個循環(huán)(其中解鏈溫度為94°C30s，退火30s，延伸溫度為72°Clmin)，然后于52°C循環(huán)25圈，72°C延伸lOmin。4.人MICA基因(1365bp)擴(kuò)增將上步擴(kuò)增得到的6個外顯子膠回收純化后等體積混合后作為模板，用引物HMICAexlF,HMICAex6R擴(kuò)增得到人MICA基因。反應(yīng)體系同上，擴(kuò)增程序選用touch-downPCR程序。即94°C5min預(yù)變性，退火溫度從62-52°C每降一度為一循環(huán)共10個循環(huán)(其中解鏈溫度為94°Clmin，退火lmin，延伸溫度為72°C2min)，然后于54°C循環(huán)25圈，72°C延伸IOmin0上述兩個是實(shí)例中touch-downPCR程序的溫度和時間參數(shù)可以根據(jù)實(shí)際需要調(diào)iF.ο以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案。不脫離本發(fā)明精神和范圍的任何修改或局部替換，應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。權(quán)利要求從基因組DNA中快速擴(kuò)增目的基因的方法，其特征在于，包括如下步驟①基因組DNA制備；②設(shè)計(jì)基因外顯子的擴(kuò)增引物；③外顯子擴(kuò)增，分別擴(kuò)增各個外顯子；④基因片段擴(kuò)增。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從基因組DNA中快速擴(kuò)增目的基因的方法，其特征在于，設(shè)計(jì)基因外顯子的擴(kuò)增引物的具體過程是，先查到基因的外顯子序列信息，針對每個外顯子分別設(shè)計(jì)重疊引物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從基因組DNA中快速擴(kuò)增目的基因的方法，其特征在于，第一個外顯子的反向引物和最后一個外顯子的正向引物分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從基因組DNA中快速擴(kuò)增目的基因的方法，其特征在于，外顯子擴(kuò)增的擴(kuò)增程序選用touch-downPCR程序。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從基因組DNA中快速擴(kuò)增目的基因的方法，其特征在于，基因片段擴(kuò)增的具體過程是，將步驟③中擴(kuò)增得到的所有外顯子膠回收純化后等體積混合后作為模板，用第一個外顯子的反向引物和最后一個外顯子的正向引物擴(kuò)增得到目的基因片段，擴(kuò)增程序選用touch-downPCR程序。全文摘要本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種關(guān)于基因克隆的方法?；蚪MDNA中快速擴(kuò)增目的基因的方法，其包括如下步驟①基因組DNA制備；②設(shè)計(jì)基因外顯子的擴(kuò)增引物；③外顯子擴(kuò)增，分別擴(kuò)增各個外顯子；④基因片段擴(kuò)增。本發(fā)明即是通過一種特殊的引物設(shè)計(jì)方法，首先從基因組中擴(kuò)增出所需的外顯子，純化后混合，再用兩端引物，在Touch-down的程序中擴(kuò)增出所需的目的基因。這種基因拼接的方法，避免了RNA制備、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過程，因此可以快速準(zhǔn)確的在數(shù)小時內(nèi)完成基因克隆，同時應(yīng)用這種方法可以克隆任一知道序列信息的cDNA序列，且擴(kuò)增長度不受限制。文檔編號C12N15/10GK101798570SQ201010124950公開日2010年8月11日申請日期2010年3月9日優(yōu)先權(quán)日2010年3月9日發(fā)明者劉磊,支旭勃,王俊,郭海榮申請人:珠海市英平生物科技有限公司