專利名稱：全基因合成犬α干擾素基因及蛋白表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程生物制藥領(lǐng)域，涉及利用全基因合成技術(shù)獲得犬a(chǎn)干擾素基因及其干擾素蛋白的原核表達(dá)。
二
背景技術(shù)：
近年來，養(yǎng)犬業(yè)在我國發(fā)展迅速，犬的種類和數(shù)量也越來越多，不論是作為伴侶動 物還是兇猛靈敏的警用犬，都對現(xiàn)代社會起著不可或缺的作用，而病毒病如犬細(xì)小病毒病、 犬瘟熱、犬冠狀病毒病等都嚴(yán)重危害著犬的健康和生存，病毒病的預(yù)防和治療顯得尤為重 要。干擾素系統(tǒng)是機(jī)體對抗病毒感染的重要防御系統(tǒng)，當(dāng)干擾素系統(tǒng)被激活后，血清干擾 素可以在幾分鐘之內(nèi)擴(kuò)散到身體各器官，而細(xì)胞接觸干擾素只需幾分鐘就可產(chǎn)生抗病毒狀 態(tài)，而且，動物可以在一到三周內(nèi)對其他病毒的重復(fù)感染有抵抗作用。根據(jù)干擾素的氨基酸 序列、抗原性和細(xì)胞來源的不同可將其分為2個型1型干擾素的主要成員為a干擾素和 3干擾素，II型干擾素為、干擾素。而其中a干擾素(IFN-a)以其突出的抗病毒作用 而備受人們重視。由誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的天然犬IFN-a，因來源少、成本高、純化工藝復(fù)雜等諸多原因 而價格昂貴，極大的限制了臨床和科研的應(yīng)用，而利用基因工程技術(shù)選擇一個合適的系統(tǒng)， 使其得到高效表達(dá)，生產(chǎn)具有廉價、廣譜抗病毒活性、無毒害、無殘留等優(yōu)點(diǎn)的干擾素已經(jīng) 無疑是促使干擾素在獸醫(yī)臨床上推廣應(yīng)用的有效途徑。
三

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于對犬a(chǎn)干擾素基因序列進(jìn)行密碼子改造后，通過全基因 合成技術(shù)合成此序列并構(gòu)建高效表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)干擾素在大腸桿菌的高表達(dá)，獲得具有抗 病毒活性的犬a(chǎn)干擾素蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供一種通過全基因合成技術(shù)合成的經(jīng)過改造的核酸，其特 征在于所述核酸包含編碼犬a(chǎn)干擾素的閱讀框，并且在該閱讀框內(nèi)全部采用大腸桿菌偏 愛的密碼子。優(yōu)選的，上述閱讀框的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述核酸的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述重組載體的大腸桿菌。本發(fā)明還提供一種在原核表達(dá)系統(tǒng)中提高犬a(chǎn)干擾素表達(dá)量的方法，其包含如 下步驟(1)在不改變?nèi)產(chǎn)干擾素氨基酸序列的基礎(chǔ)上設(shè)計其編碼核酸序列，使閱讀框內(nèi) 的每個密碼子都采用大腸桿菌偏愛的密碼子；(2)人工合成步驟(1)中設(shè)計的編碼核酸； (3)將步驟(2)合成的核酸插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體；(4)將步驟(3)構(gòu)建 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下(一)犬CI干擾素基因的合成
(1)登錄GeneBank，查找編碼犬a(chǎn)干擾素成熟蛋白的基因序列；(2)利用SignalP 3. OServer軟件預(yù)測此基因序列有無信號肽及其位置；(3)利用TargetP 1. lServer軟件檢測此信號肽的功能；(4)將犬a(chǎn)干擾素的編碼密碼子與大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行比對，根據(jù)密碼子的 兼并性，將犬a(chǎn)干擾素密碼子替換為大腸桿菌偏好的密碼子；(5)將替換后的序列5'、3'端分別加上EcoRI、Xhol酶切位點(diǎn)，送生物公司進(jìn)行 全基因合成；(二)犬a(chǎn)干擾素的原核表達(dá)(1)重組質(zhì)粒 pET32a-CaIFN_ a 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)；(2)陽性重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，最佳誘導(dǎo)時間的確定及表達(dá)蛋白可溶性鑒定；(3)重組陽性菌穩(wěn)定性檢測；(三)重組犬a(chǎn)干擾素的提取(1)菌體破碎；(2)包涵體洗滌；(3)包涵體變性；(4)目的蛋白透析復(fù)性及蛋白濃度測定；(四)重組犬a(chǎn)干擾素抗病毒活性測定利用微量病變抑制法測定干擾素活性(1)培養(yǎng) MDCK 細(xì)胞；(2)接種96孔細(xì)胞板；(3)濾泡性口炎病毒(VSV)對MDCK半數(shù)致死量的測定；(4)干擾素抗VSV活性測定，將抑制50%細(xì)胞病變的干擾素的最高稀釋度定為1 個干擾素單位。
四


圖1是重組犬a(chǎn)干擾素蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳圖泳道1 誘導(dǎo)表達(dá)前；泳道2-7 誘導(dǎo)表達(dá)1,2,3,4,5,6小時；泳道7 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)。重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后在分子量32kD處有增加的蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期的蛋白分 子量一致(干擾素分子量18. OkD，加上載體本身的融合標(biāo)簽14. 3kD)，且在6小時時表達(dá)量 最高，所以選用的最佳誘導(dǎo)時間為6小時。圖2是重組犬a(chǎn)干擾素蛋白可溶性鑒定圖泳道1 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2 菌體破碎后上清；泳道3 菌體破碎后沉淀。 電泳結(jié)果顯示目的蛋白為包涵體形式表達(dá)。圖3是目的蛋白純化效果SDS-PAGE電泳圖泳道1 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；
泳道2 純化后的目的蛋白。 五
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1犬a(chǎn)干擾素基因的合成登錄GeneBank，查找編碼犬a(chǎn)干擾素成熟蛋白的基因序列(序列號為M28625)， 利用SignalP 3. OServer軟件預(yù)測此基因可能含有一段信號肽序列，為其氨基酸序列的前 30個氨基酸，利用TargetP 1. lServer軟件檢測此序列功能，發(fā)現(xiàn)其為幫助蛋白分泌的信 號肽而非蛋白結(jié)構(gòu)所必需，由于犬a(chǎn)干擾素為真核生物干擾素，但后續(xù)研究需要在原核生 物中進(jìn)行表達(dá)，真核生物的信號肽在原核生物細(xì)胞環(huán)境中由于缺少相應(yīng)的受體而不能發(fā)揮 作用，所以我們?nèi)サ粜盘栯男蛄?，剩下編碼成熟犬a(chǎn)干擾素的基因序列，其核苷酸長度為 495bp;將犬a(chǎn)干擾素的編碼密碼子與大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行比對，根據(jù)密碼子的兼并 性，在不改變氨基酸組成和排列順序的基礎(chǔ)上，對已知的編碼犬a(chǎn)干擾素的基因序列進(jìn)行 改造，替換為大腸桿菌喜好的密碼子，旨在提高基因在大腸桿菌的表達(dá)水平；然后將替換后的序列5'、3'端分別加上EcoRI、XhoI酶切位點(diǎn)，送上海英 駿生物公司進(jìn)行全基因合成，并連入原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a中，得到重組原核表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-CaIFN-a ；實(shí)施例2犬a(chǎn)干擾素蛋白的原核表達(dá)1將測序正確的重組質(zhì)粒pET32a-CaIFN- a轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)，挑取單菌落進(jìn)行雙酶 切鑒定；2陽性重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)挑取含有重組陽性質(zhì)粒的單菌落，接種到含有濃度為100mg/mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。按的比例將過夜培養(yǎng)的菌液接種于Amp+/LB液體 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3h至菌液光密度值達(dá)0. 4-0. 6，立即加入IPTG至工作濃度達(dá)ImM，繼續(xù)培養(yǎng) 5h，每lh取1ml菌液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以確定最佳誘導(dǎo)時間；3大腸桿菌表達(dá)的犬a(chǎn)干擾素的可溶性鑒定取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液，4°C，12000rpm,離心lOmin后收集菌體，棄上清，沉淀經(jīng)PBS 洗滌三次后超聲波破碎，超聲條件為功率400w，工作5秒，間隔10秒反復(fù)80次。離心，分別 取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以鑒定目的蛋白的可溶性；4重組陽性菌穩(wěn)定性檢測挑取含有重組陽性質(zhì)粒的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，每12小 時以轉(zhuǎn)接一次，傳代過程中均不添加氨芐青霉素，連續(xù)傳代25次，然后取每一代培養(yǎng)的 菌液進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳觀察表達(dá)情況；實(shí)施例3重組犬a(chǎn)干擾素的提取1菌體破碎離心收集誘導(dǎo)后的菌體，PBS洗滌三次，超聲破碎細(xì)胞，涂片鏡檢，觀察破碎效果， 棄上清，得到粗制的包涵體；2包涵體的洗滌用含2M脲的包涵體洗滌液充分洗滌包涵體，4°C，12000rpm,離心15min，棄上清；
3包涵體的變性用含8M脲的包涵體溶解液重懸沉淀，并30°C水浴使包涵體充分溶解變性，離心取 上清，即得變性蛋白液；4目的蛋白透析復(fù)性將變性蛋白液加入到透析袋中，分別放入含4M、2M、1M、0. 75M、0M脲的PBS溶液中 進(jìn)行透析，每個濃度4°C攪拌透析4h，所得蛋白液離心，上清用直徑0. 22 y m濾膜過濾除菌 及雜質(zhì)，即得到本發(fā)明重組犬a(chǎn)干擾素基因的表達(dá)蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢驗純化結(jié) 果，用Broadford法測定蛋白濃度；實(shí)施例4重組犬a(chǎn)干擾素抗病毒活性測定采用微量細(xì)胞病變抑制法MDCK接種96孔板，待長成單層后棄去生長液，加入10倍倍比稀釋的重組犬a(chǎn)干 擾素，每個稀釋度做8個重復(fù)，培養(yǎng)24小時后棄上清，用10TCID50的水皰性口炎病毒(VSV) 進(jìn)行攻毒，同時設(shè)立陰性對照(只加10倍稀釋的干擾素，不加病毒)，陽性對照(只加病毒， 不加干擾素)，空白對照(不加干擾素，不加病毒)，倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞病變，待陽 性對照孔出現(xiàn)75%病變時判定結(jié)果。實(shí)驗結(jié)果表明(1)陰性對照孔中的細(xì)胞未產(chǎn)生任何病變，說明本發(fā)明得到的 干擾素本身對細(xì)胞沒有毒害作用；(2)經(jīng)104倍稀釋的干擾素能100%抑制細(xì)胞病變，而 107倍稀釋的干擾素有4個孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，由上述結(jié)果得出犬a(chǎn)干擾素抗VSV活性為 1. 06X 107U/mL，比活性為 1. 67X 107U/mg。
權(quán)利要求
一種通過全基因合成技術(shù)合成的經(jīng)過改造的核酸，其特征在于所述核酸包含編碼犬α干擾素的閱讀框，并且在該閱讀框內(nèi)全部采用大腸桿菌偏愛的密碼子。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸，其特征在于所述閱讀框的堿基序列如SEQIDN0. 1所示。
3.一種含有如權(quán)利要求1或2所述核酸的重組載體。
4.一種含有如權(quán)利要求3所述重組載體的大腸桿菌。
5.一種在原核表達(dá)系統(tǒng)中提高犬a(chǎn)干擾素表達(dá)量的方法，其包含如下步驟(1)在不改變?nèi)產(chǎn)干擾素氨基酸序列的基礎(chǔ)上設(shè)計其編碼核酸序列，使閱讀框內(nèi)的每 個密碼子都采用大腸桿菌偏愛的密碼子；(2)人工合成步驟(1)中設(shè)計的編碼核酸；(3)將 步驟(2)合成的核酸插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體；(4)將步驟(3)構(gòu)建的重組 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用全基因合成技術(shù)獲得犬α干擾素基因及進(jìn)行干擾素蛋白的原核表達(dá)，屬于生物制藥領(lǐng)域。包括對犬α干擾素基因序列進(jìn)行密碼子的改造并全基因合成此序列，含犬α干擾素基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建，用所述含犬α干擾素基因的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌及誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白提取及變性復(fù)性，及抗病毒活性的研究。試驗所得干擾素能抵抗水皰性口炎病毒的攻擊，比活性達(dá)到1.67×107U/mg。該方法生產(chǎn)干擾素工藝簡單，表達(dá)量高，生物活性高。
文檔編號C12N15/63GK101798573SQ20101012502
公開日2010年8月11日 申請日期2010年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日
發(fā)明者姚火春, 張煒, 潘子豪, 胡偉娟 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)