一種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑，該試劑通過(guò)對(duì)等溫環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增所使用的引物組中的前內(nèi)引物標(biāo)記一種抗原同時(shí)對(duì)后內(nèi)引物標(biāo)記另一種抗原，能夠在擴(kuò)增霍亂弧菌特異性目的基因的同時(shí)對(duì)該基因進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后使用配套的膠體金試紙能夠快速檢測(cè)目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而檢測(cè)霍亂弧菌。本發(fā)明的檢測(cè)試劑操作簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高。
【專利說(shuō)明】—種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于核酸檢測(cè)的試劑，具體講，涉及一種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]霍亂弧菌是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。屬于國(guó)際檢疫傳染病。人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過(guò)污染的水源或飲食物經(jīng)口傳染。在一定條件下，霍亂弧菌進(jìn)入小腸后，依靠鞭毛的運(yùn)動(dòng)，穿過(guò)粘膜表面的粘液層，可能藉菌毛作用粘附于腸壁上皮細(xì)胞上，在腸粘膜表面迅速繁殖，經(jīng)過(guò)短暫的潛伏期后便急驟發(fā)病。該菌不侵入腸上皮細(xì)胞和腸腺，也不侵入血流，僅在局部繁殖和產(chǎn)生霍亂腸毒素，此毒素作用于粘膜上皮細(xì)胞與腸腺使腸液過(guò)度分泌，從而患者出現(xiàn)上吐下瀉，瀉出物呈“米泔水樣”并含大量弧菌，此為本病典型的特征。該病曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高。快速檢測(cè)霍亂弧菌是有效控制和預(yù)防霍亂的有效手段。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedisothermal amplification)是一種新型的核酸檢測(cè)技術(shù)，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下,在60°C~65°C恒溫?cái)U(kuò)增，60分鐘左右即可實(shí)現(xiàn)IO9~IOltl倍的核酸擴(kuò)增，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)除了高特異性、高靈敏度外，操作十分簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè) 備要求低，一臺(tái)水浴鍋或恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)。其擴(kuò)增結(jié)果可以通過(guò)凝膠電泳、肉眼觀察焦磷酸鎂沉淀或加入熒光物質(zhì)后的顏色改變來(lái)做初步的判斷。但該方法也有一定的缺陷，主要表現(xiàn)在擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)環(huán)節(jié)，凝膠電泳檢測(cè)容易造成污染，焦磷酸鎂沉淀檢測(cè)靈敏度較差，熒光物質(zhì)變色方法受到熒光物質(zhì)的成本或者需要使用檢測(cè)儀器的限制。因此，在產(chǎn)物檢測(cè)環(huán)節(jié)的限制，影響了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明公開(kāi)了一種新型的等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑。該方法具有本發(fā)明的相對(duì)傳統(tǒng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)具有靈敏度更高，結(jié)果判斷更準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供一種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑。
[0007]本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供一種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)方法。
[0008]本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提供這種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。
[0009]發(fā)明的主要技術(shù)方案為:
1.等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑的組成為:(I)核酸恒溫標(biāo)記擴(kuò)增反應(yīng)試劑
核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中含有前外引物、后外引物、前促環(huán)引物、后促環(huán)引物、前內(nèi)引物、后內(nèi)引物、dNTPs溶液、具有鏈置換活性的DNA聚合酶(如'Bst DNA聚合酶等)、MgSO4、無(wú)菌雙蒸水以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的緩沖液。
[0010]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的緩沖液的最終工作濃度為20 mM Tris-HClUO mMKClUO mM(NH4)2SO4,2 mM MgSO4 以及質(zhì)量濃度為 0.1% Triton X-100，緩沖液的 pH 值為 8.8。
[0011]其中前外引物、后外引物、前促環(huán)引物、后促環(huán)引物、前內(nèi)引物、后內(nèi)引物均為人工合成的脫氧核糖核酸分子，其中前外引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:1、后外引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:2、前促環(huán)引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:3、后促環(huán)引物的核苷酸序列為SEQ ID N0:4、前內(nèi)引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:5、后內(nèi)引物的核苷酸序列為SEQ IDN0:6，上述引物分別與待測(cè)基因的相應(yīng)位置互為反義互補(bǔ)序列，上述引物能夠在等溫條件下以環(huán)介導(dǎo)的方式檢測(cè)待測(cè)基因。將前內(nèi)引物的5’端標(biāo)記上生物素基團(tuán)，將后內(nèi)引物的5’端標(biāo)記上異硫氰酸熒光素基團(tuán)。
[0012]各引物的具體核苷酸序列如下:
SEQ ID NO:1 5’ - GGGCATACAGTCCTCATCCAG -3’，
SEQ ID NO:2 5’ - GATGATCTTGGAGCATTCCCA -3’，
SEQ ID NO:3 5’ - CAAAATGAACTCGATACCATCCAT -3’，
SEQ ID NO:4 5’ - TATGGATTGGCAGGTTTCCC -3’，
SEQ ID NO:5 5’- acgatgtaattgttcatcaagcaccttttgctttaggtgggattccatactc -V ,
SEQ ID NO:6 5’ - ttagatattgctccagcagcagatgttttcttccctccaagctctatgctc -3’。
[0013](2)標(biāo)記核酸膠體金檢測(cè)試紙條
該試紙條的組成包括樣品墊、金膠墊、醋酸纖維素膜(膜上由相應(yīng)的抗體組成的檢測(cè)線和質(zhì)控線)和吸水墊等，具體組成參見(jiàn)附圖1。該膠體金檢測(cè)試紙的金膠墊上含有標(biāo)記后抗生物素抗體的金顆粒，膠體金檢測(cè)試紙層析膜的檢測(cè)線上包被有抗異硫氰酸生物素抗體，膠體金檢測(cè)試紙層析膜的質(zhì)控線上包被有能和金顆粒上標(biāo)記的抗生物素抗體結(jié)合的二抗。
[0014]2.使用等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑的具體步驟為:
(I)將待檢測(cè)的DNA溶液，加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中；在對(duì)照PCR管中分別加入陽(yáng)性對(duì)照試劑和陰性對(duì)照試劑，將上述PCR管在60~65°C下擴(kuò)增反應(yīng)30~60分鐘，優(yōu)選條件為60°C下擴(kuò)增反應(yīng)60分鐘。
[0015](2)利用標(biāo)記核酸膠體金檢測(cè)試紙條，檢測(cè)PCR管中反應(yīng)后的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0016]下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的解釋和說(shuō)明:
等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑能夠在60~65°C下將霍亂弧菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，在擴(kuò)增的同時(shí)，由于前內(nèi)引物和后內(nèi)引物分別標(biāo)記有生物素基團(tuán)和異硫氰酸熒光素基團(tuán)，因此在DN A擴(kuò)增產(chǎn)物上同時(shí)含有生物素基團(tuán)和異硫氰酸熒光素基團(tuán)。
[0017]上述擴(kuò)增產(chǎn)物滴加在核酸膠體金檢測(cè)試紙條的樣品墊上，在層析作用下，擴(kuò)增產(chǎn)物在經(jīng)過(guò)金膠墊時(shí)雙標(biāo)記的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物由于攜帶有生物素基團(tuán)和異硫氰酸熒光素基團(tuán)，因此能夠和標(biāo)記有金顆粒的抗生物素抗體結(jié)合形成核酸抗體復(fù)合物；核酸抗體復(fù)合物在醋酸纖維素膜上層析，經(jīng)過(guò)檢測(cè)線時(shí)該復(fù)合物由于帶有異硫氰酸熒光素基團(tuán)，因此能夠和檢測(cè)線上的抗異硫氰酸熒光素抗體結(jié)合，形成復(fù)合物，該復(fù)合物由于攜帶有有色的標(biāo)記物(納米金顆粒呈紅色)，此時(shí)檢測(cè)線呈現(xiàn)紅色；當(dāng)核酸抗體復(fù)合物或者單獨(dú)的標(biāo)記抗生物素抗體經(jīng)過(guò)質(zhì)控線時(shí)，由于質(zhì)控線上含有能夠結(jié)合抗生物素抗體的二抗，所以只要有標(biāo)記的抗生物素抗體層析至質(zhì)控線，無(wú)論該抗體是否結(jié)合有標(biāo)記的核酸，均能夠形成二抗和標(biāo)記抗體的復(fù)合物，該復(fù)合物由于攜帶有有色的標(biāo)記物(納米金顆粒呈紅色)，此時(shí)質(zhì)控線呈現(xiàn)紅色。
[0018]本發(fā)明的相對(duì)傳統(tǒng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)具有靈敏度更高，結(jié)果判斷更準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。首先，本發(fā)明的新型恒溫環(huán)介導(dǎo)核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑，使用標(biāo)記的引物，使得環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物攜帶了兩種抗原標(biāo)記物。這樣的雙標(biāo)記核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，能夠被制備好的膠體金試紙條檢測(cè)出來(lái)。當(dāng)含有雙標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的樣本在膠體金試紙上層析時(shí)，雙標(biāo)記產(chǎn)物能夠結(jié)合攜帶有有色顆粒標(biāo)記的抗體，在檢測(cè)線上呈現(xiàn)紅色，這樣目的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)試紙上檢測(cè)線的顏色改變顯示出來(lái)。即使有很少的擴(kuò)增產(chǎn)物也能夠進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)，因此有效地提高了檢測(cè)靈敏度。其次，檢測(cè)反應(yīng)的結(jié)果通過(guò)膠體金檢測(cè)試紙的檢測(cè)線得到，相對(duì)于濁度觀察法和熒光燃料變色法讀取結(jié)果更加準(zhǔn)確，避免了由于檢驗(yàn)人員主觀判斷帶來(lái)的結(jié)果偏差。上述檢測(cè)方法擴(kuò)大了該檢測(cè)試劑的應(yīng)用范圍，使之可以廣泛應(yīng)用于野外現(xiàn)場(chǎng)等特殊環(huán)境。此方法操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短，同時(shí)也降低了檢測(cè)成本，使得檢測(cè)結(jié)果更加快速、可靠，具有免疫與核酸診斷試劑各自的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)由于操作簡(jiǎn)單、快速、低廉的成本和防止核酸擴(kuò)增物對(duì)實(shí)驗(yàn)室的污染，對(duì)于病原體的檢測(cè)具有重大意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]附圖1膠體金試紙條的組成。
[0020]該試紙條的組成包括樣品墊(I)、金膠墊(2)、醋酸纖維素膜(3)、質(zhì)控線(4)、檢測(cè)線(5)和吸水墊(6)。該膠體金檢測(cè)試紙的金膠墊上含有標(biāo)記后抗生物素抗體的金顆粒，膠體金檢測(cè)試紙層析膜的檢測(cè)線上包被有抗異硫氰酸生物素抗體，膠體金檢測(cè)試紙層析膜的質(zhì)控線上包被有能和金顆粒上標(biāo)記的抗生物素抗體結(jié)合的二抗。
[0021]附圖2霍亂弧菌標(biāo)記擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果
加入的擴(kuò)增DNA模板如下，I號(hào)條為霍亂`弧菌DNA模板標(biāo)準(zhǔn)品其中含目的基因約IO6拷貝；2號(hào)條為霍亂弧菌DNA模板標(biāo)準(zhǔn)品`其中含目的基因約10°拷貝；3號(hào)條為待測(cè)樣品；4號(hào)條為副溶血弧菌DNA模板標(biāo)準(zhǔn)品；5號(hào)條為加入的雙蒸水進(jìn)行陰性對(duì)照。
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)地闡述本發(fā)明。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】?jī)H對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋和說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行限制。
[0024]實(shí)施例1:霍亂弧菌DNA基因組梯度稀釋標(biāo)記擴(kuò)增檢測(cè)
取濃度已知的霍亂弧菌DNA基因組對(duì)其進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋至霍亂弧菌DNA中的目的基因終濃度為10°拷貝/UL，取霍亂弧菌DNA模板標(biāo)準(zhǔn)品制備的陽(yáng)性參照物，陰性參照物，以及霍亂弧菌DNA梯度稀釋液(在PCR管中霍亂弧菌特異性目的基因的終濃度分別為IO6拷貝、IO5拷貝、IO4拷貝、IO3拷貝、IO2拷貝、IO1拷貝和10°拷貝)，做為模板進(jìn)行標(biāo)記擴(kuò)增檢測(cè)。
[0025]等溫?cái)U(kuò)增中的各組分構(gòu)成比例如下:
【權(quán)利要求】
1.一種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑，其特征在于，所述的檢測(cè)試劑包括霍亂弧菌等溫環(huán)介導(dǎo)核酸標(biāo)記擴(kuò)增反應(yīng)液，該反應(yīng)液中含有前外引物、后外引物、前促環(huán)引物、后促環(huán)引物、5’端標(biāo)記生物素基團(tuán)的前內(nèi)引物、5’端標(biāo)記異硫氰酸熒光素基團(tuán)的后內(nèi)引物、dNTPs溶液、具有鏈置換活性的DNA聚合酶(如'Bst DNA聚合酶)、MgSO4、無(wú)菌雙蒸水以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑，其特征在于，使用的前外引物、后外引物、前促環(huán)引物、后促環(huán)引物、前內(nèi)引物和后內(nèi)引物的序列如下:
SEQ ID NO:1 5’ - GGGCATACAGTCCTCATCCAG -3’，
SEQ ID NO:2 5’ - GATGATCTTGGAGCATTCCCA -3’，
SEQ ID NO:3 5’ - CAAAATGAACTCGATACCATCCAT -3’，
SEQ ID NO:4 5’ - TATGGATTGGCAGGTTTCCC -3’，
SEQ ID NO:5 5’ -acgatgtaattgttcatcaagcaccttttgctttaggtgggattccatactc _3’ ,
SEQ ID NO:6 5’ - ttagatattgctccagcagcagatgttttcttccctccaagctctatgctc -3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑，其特征在于，使用該試劑，能夠在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物DNA上標(biāo)記生物素基團(tuán)和異硫氰酸熒光素基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑，其特征在于，將提取得到的待測(cè)DNA溶液作為擴(kuò)增模板加入到裝有核酸恒溫標(biāo)記擴(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，在60~65°C下擴(kuò)增反應(yīng)30~60分鐘，優(yōu)選60°C下擴(kuò)增反應(yīng)60分鐘。`
5.一種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑所使用的膠體金檢測(cè)試紙，其特征在于，膠體金檢測(cè)試紙的金膠墊上含有標(biāo)記后抗生物素抗體的金顆粒，膠體金檢測(cè)試紙層析膜的檢測(cè)線上包被有抗異硫氰酸生物素抗體，膠體金檢測(cè)試紙層析膜的質(zhì)控線上包被有能和金顆粒上標(biāo)記的抗生物素抗體結(jié)合的二抗。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種新型等溫環(huán)介導(dǎo)霍亂弧菌核酸標(biāo)記檢測(cè)試劑所使用的膠體金檢測(cè)試紙，其特征在于，將待測(cè)標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物滴加在檢測(cè)試紙的樣品墊上，當(dāng)檢測(cè)線和質(zhì)控線都呈現(xiàn)紅色時(shí)表明DNA樣品中含有霍亂弧菌的待測(cè)基因，當(dāng)檢測(cè)線無(wú)色而質(zhì)控線呈現(xiàn)紅色表明DNA樣品中不含有霍亂弧菌的待測(cè)基因。
【文檔編號(hào)】C12Q1/10GK103667505SQ201310737363
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】王馨, 關(guān)淳, 柴宏森, 祁軍, 劉寅, 韓靜娜, 姜智賢, 葉正 申請(qǐng)人:天津國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心