專利名稱：人類激酶sbk1的新應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類激酶SBKl的新應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明涉及SBKl在診斷癌癥特別是卵巢癌中的應(yīng)用、SBKl的拮抗劑在制備診斷和/或治療癌癥的藥物中的應(yīng)用、診斷和/或治療癌癥的藥物組合物以及檢測SBKl表達(dá)的試劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是惡性腫瘤的總稱，是嚴(yán)重威脅人類健康的一大類疾病，在人類疾病中是僅次于心血管系統(tǒng)疾病的第二大死亡原因。據(jù)估計，發(fā)達(dá)國家中約有三分之一的人會在他們生命歷程的不同階段患上癌癥，其中近四分之一的患者最終死于癌癥。一直以來，人們都在不斷尋找有效的治療方法去征服癌癥。隨著人們對基因及其功能認(rèn)識的逐漸深入，對癌癥的發(fā)生、發(fā)展、遷移以及轉(zhuǎn)歸等，在分子生物學(xué)水平的發(fā)病機制研究的越來越清楚，為癌癥的早期診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。尤其是人類基因組計劃的完成，人類全部基因的鑒定和注釋，給人們呈現(xiàn)了一幅全新的藍(lán)圖，也為癌癥治療藥物新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)和新型治療藥物的研究與開發(fā)提供了巨大的動力。 藥物靶標(biāo)(drug target)即細(xì)胞內(nèi)與藥物相互作用并賦予藥物效應(yīng)的特定分子。98%以上藥物靶標(biāo)在生化性質(zhì)上都屬于蛋白質(zhì)。靶標(biāo)抗癌藥物就是針對這些靶標(biāo)，具有針對性強， 效果顯著，毒副作用小等特點。根據(jù)最新人類轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫OHnvitationalDatabase， !HnvDB)的統(tǒng)計，有注釋的人類編碼基因34057個(Yamasaki C etal, Nucleic Acids Res, 2008, 36 :D793_799)，而目前所有批準(zhǔn)上市的藥物中針對人類蛋白質(zhì)發(fā)揮作用涉及的編碼基因不到 300 個(Golden JB. Curr Opin DrugDiscov Devel. 2003,6(3) :310-316; Imming P，et al. Nat Rev Drug Discov. 2006,5(10) :821-834 ；Overington JP，et al. Nat Rev Drug Discov. 2006,5(12) :993-996 ；Chen X，et al. Nucleic Acids Res. 2002,30(1) 412-415)，其他少數(shù)靶標(biāo)分別來源于細(xì)菌、病毒、真菌或者是其他病原體，而人類基因組上預(yù)計的藥物靶標(biāo)有2000 3000個，所以大量的藥物靶標(biāo)有待于研究、開發(fā)。這些藥物靶標(biāo)從功能分類上涉及到酶類、轉(zhuǎn)錄因子、離子通道、細(xì)胞膜受體及核受體等等。在所有上市、臨床試驗以及尚在實驗室研究階段的藥物靶標(biāo)中，具有催化活性的酶類蛋白質(zhì)占到將近80% (Gao Z, et al.BMCBioinformatics. 2008,19(9) :104)。蛋白激酶屬于酶類，為磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶，將ATP的Y磷酸基轉(zhuǎn)移到底物特定的氨基酸殘基上，使蛋白質(zhì)磷酸化。研究表明，在人類基因組上共存在518個(Manning G，et al. Science，2002，298 :1912-1933)或 511 個(Park J, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(23) :8114-8119)蛋白激酶基因。這些激酶通過對蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化修飾，使該蛋白質(zhì)活性發(fā)生改變，常起著分子“開/關(guān)”的作用，控制著近30%的細(xì)胞蛋白質(zhì)的活性， 參與了幾乎所有的細(xì)胞功能，例如細(xì)胞的增殖、分化，肌細(xì)胞的收縮，細(xì)胞的內(nèi)吞以及諸多新陳代謝過程等等。蛋白激酶過度活躍是導(dǎo)致一些癌癥的病因。由于蛋白激酶在控制細(xì)胞行為的核心作用而被視為治療多種疾病的靶標(biāo)得到學(xué)術(shù)界和生物醫(yī)藥公司的廣泛研究。例如，由拜耳公司和Onyx制藥公司共同研發(fā)的抗癌藥物Sorafenib (Nexavar，BAY 43-9006)
3片劑已于2006年1月獲得FDA批準(zhǔn)用于治療晚期腎細(xì)胞癌(RCC)或腎癌。該品是多激酶抑制劑，可作用于RAF/MEK/ERK阻止細(xì)胞增殖以及作用于VEGFR-2/PDGFR-0阻止腫瘤血管生成。此外如BCR-Abl抑制劑藥物Gleevec (諾華公司)用于治療慢性粒細(xì)胞白血病 (chronicmyeloid leukemia, CML)和胃腸基質(zhì)瘤；表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑藥物 Iressa (gefitinib)和Tarceva (erlotinib)(阿斯利康公司)用于治療晚期非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)。毫無疑問，未來將會產(chǎn)生更多的阻斷激酶的抑制劑用做治療用藥。SBKl (SH3-binding domain kinase 1)基因是近年來首次克隆到的人的新的激酶基因(王平章等，人SBKl cDNA的克隆及其相互作用蛋白的篩選，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2006年4月，22(4) :313-321)。而之前，關(guān)于該激酶是否存在并不確定，盡管 Manning等在激酶物組數(shù)據(jù)庫中收錄了該基因的預(yù)測序列(Manning G，et al. Science, 2002，298 :1912-1933. http//:www. kinase, com)，而 Park 等在后來的報道中卻忽略掉了該基因(ParkJ，et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(23) :8114-8119)。分析表明，人的SBKl基因含有四個外顯子，編碼區(qū)(ORF)長1275bp，編碼4M個氨基酸，在不同的物種之間具有較高的保守性，如編碼區(qū)與鼠的核苷酸序列同源性達(dá)87. 7%，而氨基酸序列同源性達(dá)95. 7%，在羧基端均有一個PV富集區(qū)，推測其能與含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供SBKl的拮抗劑在制備診斷和/或治療癌癥特別是卵巢癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的是提供一種多克隆抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種診斷和/或治療癌癥特別是卵巢癌的藥物組合物。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測SBKl表達(dá)的試劑在制備用于檢測癌癥特別是卵巢癌的組合物中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，SBKl包括SBKl基因或SBKl蛋白等。所述SBKl蛋白為如SEQ ID N0: 2所示的氨基酸序列，其具有4 個氨基酸。所述SBKl基因為編碼本發(fā)明的SEQ ID NO 2 的多核苷酸序列，其可以為SEQ ID NO :2所示氨基酸的編碼序列，或者除了上述氨基酸序列的編碼序列之外，還可以包括非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。所述多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的 DNA0其中優(yōu)選的基因為SEQ ID NO 1所示的多核苷酸，其序列全長1610個核苷酸，編碼序列為第336 1610位核苷酸?；蛘?，更優(yōu)選一種分離的核苷酸序列，其只包含編碼SBKl蛋白序列，例如SEQ ID NO 1所示的編碼序列核苷酸336 1610。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明的SBKl的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ ID NO :1所示的編碼序列，也可以由于遺傳密碼的簡并性，不完全等同于上述核苷酸的編碼序列。本發(fā)明的SBKl核苷酸序列可以依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴增技術(shù)將cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，并選取合適的寡核苷酸引物擴增得到。這樣得到的多核苷酸可以克隆進(jìn)合適的載體中，并用DNA分析技術(shù)進(jìn)行序列描述。也可以通過標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)得到，例如， 使用可以按本領(lǐng)域熟知的固相亞磷酸酰胺三酯法在DNA合成儀上合成。本發(fā)明的SBKl蛋白可以通過常規(guī)方法獲得，例如通過轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用適當(dāng)?shù)姆椒?如溫度變動或化學(xué)特質(zhì)誘導(dǎo))誘導(dǎo)啟動子，然后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，可用離心法收集細(xì)胞，并用任何已知的方法，如凍融法、超聲處理法、溶菌酶溶解法或機械破碎法破碎細(xì)胞。可以用各種已知的方法從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的 SBKl蛋白，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取法、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維層析法、疏水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法及高壓液柱層析法。在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明通過免疫組織化學(xué)檢測，在膀胱、肺、肝臟、睪丸、子宮、結(jié)腸、口腔舌腺、胃淋巴結(jié)、卵巢、皮膚、前列腺、乳腺、腎臟、食道、胃體、胰腺的癌癥組織中均檢測到SBKl的表達(dá)；同時統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)證明本發(fā)明的SBKl在漿液性卵巢癌組織中與正常組織相對比明顯高表達(dá)。因此，本發(fā)明的SBKl可作為癌癥特別是卵巢癌診斷的一個新的指標(biāo)。同時，本發(fā)明SBKl有可能作為癌癥特別是卵巢癌治療的一個新靶點，例如抑制本發(fā)明SBKl的基因或蛋白，可以用于治療癌癥。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供SBKl的拮抗劑在制備診斷和/或治療癌癥特別是卵巢癌的藥物中的應(yīng)用。由于拮抗劑(例如蛋白、核酸、碳水化合物)可以與本發(fā)明的 SBKl結(jié)合并抑制或封閉本發(fā)明的SBKl的生物活性，所以本發(fā)明的拮抗劑可以用于診斷和/ 或治療癌癥。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述的拮抗劑可以為抗SBKl或其抗原性片段的特異性單克隆或多克隆抗體。這里所述的“特異性”是指抗體能結(jié)合于本發(fā)明的SBKl基因產(chǎn)物或片段。優(yōu)選那些能與本發(fā)明的SBKl的基因產(chǎn)物結(jié)合但不識別且不與其它非相關(guān)抗原分子結(jié)合的抗體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明的單克隆抗體或多克隆抗體可以通過本發(fā)明的SBKl的全長或其抗原性的片段作為抗原進(jìn)行免疫獲得，所述抗原性片段例如位于SEQ IDNO 2的第5 M位氨基酸。所述抗原性片段序列短、易于合成，而且經(jīng)生物信息學(xué)分析以及實驗證明其抗原性比較好。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述的拮抗劑可以為針對本發(fā)明的SBKl的反義 RNA。反義RNA能與本發(fā)明的SBKl的mRNA分子特異性地互補結(jié)合，從而抑制SBKl的表達(dá)和功能。通常反義RNA由15 20個核苷酸組成，可由人工合成及以表達(dá)載體兩種方式得到。后者是利用基因重組技術(shù)，在適當(dāng)?shù)膯幼雍娃D(zhuǎn)錄終止子間反向插入一段靶基因，從而得到反義表達(dá)的RNA。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述的拮抗劑可以為小干擾RNA(SiRNA)。所謂 siRNA，就是包含19個堿基的小片段RNA，在導(dǎo)入細(xì)胞或組織后，可以特異地誘發(fā)與其同源的靶基因mRNA發(fā)生降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)受到抑制，從而控制與靶基因有關(guān)的功能。所述siRNA可以通過諸如化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄或用RNase III消化長片段雙鏈RNA等體外制備方法或siRNA表達(dá)載體、siRNA表達(dá)框架等體內(nèi)表達(dá)方法來制備，并利用各種方法提高本發(fā)明RNA的穩(wěn)定性。本發(fā)明的SBKl可作為癌癥特別是卵巢癌診斷的一個新的指標(biāo)，利用前述針對 SBKl或其片段的多克隆抗體或單克隆抗體可檢測樣品中SBKl的表達(dá)或表達(dá)水平，從而為診斷腫瘤提供新的診斷依據(jù)?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的任何方法檢測本發(fā)明的SBKl在核酸水平的表達(dá)，例如經(jīng)與用放射性同位素標(biāo)記的反義RNA或DNA探針與擴增后的DNA序列雜交，這樣可根據(jù)放射性的有無及強度來定性或定量檢測SBKl的表達(dá)水平。也可以采用非放射性標(biāo)記物。也可使用衍生于PCR方法檢測，例如逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。逆轉(zhuǎn)錄PCR不僅可以檢測DNA，也能對RNA進(jìn)行分析和研究。作為選擇，可以原位直接從活組織檢查或切除術(shù)得到的患者組織的組織切片(固定和/或冰凍)上來檢測本發(fā)明SBKl多核苷酸的表達(dá)，此時不需要純化核酸。這些分析技術(shù)包括DNA或RNA印跡分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、原位雜交分析以及聚合酶鏈反應(yīng)。這些分析既可揭示SBKl表達(dá)的定量方面的情況，也可揭示SBKl表達(dá)和/或組合物的定性方面的情況。例如可以采用Southern雜交分析來檢測本發(fā)明的多核苷酸在核酸水平的表達(dá)水平。也可以在蛋白質(zhì)水平檢測本發(fā)明SBKl的表達(dá)水平。檢測方法也是本領(lǐng)域已知的，例如利用本發(fā)明SBKl蛋白特異性的單克隆抗體或多克隆抗體，利用直接或間接酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫熒光法、Western blot、免疫組織化學(xué)等進(jìn)行檢測。在ELISA中， 常用的酶為辣根過氧化物酶(horserad-ishPeroxidase，HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatease, AP) 0也可以使用葡萄糖氧化酶、β _D_半乳糖苷酶和脲酶等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，針對不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于鄰苯二胺 (OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS等。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。免疫印跡(Western blot)是借助SDS 存在下高分辨率的PAGE電泳將抗原根據(jù)其分子量大小不同而有效分成許多蛋白區(qū)帶，將分離后的蛋白帶經(jīng)不同途徑轉(zhuǎn)移至一種固相支持體如硝酸纖維膜或PVDF膜上，然后以抗體為探針，與附著于固相支持體的靶蛋白抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)，結(jié)合于固相支持體的抗體可用酶標(biāo)的二抗如堿性磷酸酶或辣根過養(yǎng)化物酶偶聯(lián)的第二抗體等檢測。免疫印跡可鑒定出混合物中未知蛋白及其分子質(zhì)量。免疫組織化學(xué)是在組織切片中進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，可以檢測抗原在組織中的含量和定位。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種多克隆抗體，其與SEQ IDNO 2的第 5 M位氨基酸特異性結(jié)合。經(jīng)本發(fā)明的實驗檢驗，SEQ ID NO 2的第5 M位氨基酸可以有效產(chǎn)生抗體。上述抗體不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No. 4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法來制備。例如，純化的本發(fā)明SBKl蛋白或其具有抗原性的片段，可被施用于動物(例如小鼠、豚鼠、雞、兔、山羊、綿羊、馬等動物等)以誘導(dǎo)含有多克隆抗體的抗血清的產(chǎn)生，必要時在免疫時可加入佐劑，以增強免疫效果。為了使實驗結(jié)果真實可靠，需要對抗血清進(jìn)行純化?？寡寮兓墒褂脦追N不同的方法，常用的是蛋白A/G結(jié)合法和抗原親和純化法。制備本發(fā)明的SBKl或其片段的單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域已知的方法，例如以蛋白或其片段作為抗原免疫動物(例如小鼠、豚鼠、雞、兔、山羊、綿羊、馬等動物)，取免疫動物的脾細(xì)胞作為能夠產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞(免疫細(xì)胞)，與同系動物的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。篩選能夠產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行單克隆化。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供一種診斷和/或治療癌癥特別是卵巢癌的藥物組合物。該藥物組合物包含針對SBKl或其片段的抗體、反義RNA、siRNA等拮抗劑，還可以包含一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。所述載體或賦形劑可以包括生理鹽水、
6等滲葡萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇及上述溶液的組合。所述藥物組合物還可以進(jìn)一步包含滲透促進(jìn)劑、抗氧化劑和/或蛋白酶抑制劑等。為治療目的，所述藥物組合物可以采用適當(dāng)?shù)闹苿┬问讲⑼ㄟ^適當(dāng)?shù)慕o藥途徑來施用。至于本發(fā)明的藥物組合物在診斷方面的應(yīng)用，可以利用所述藥物對來自受試者的樣品進(jìn)行檢測，所述樣品來自脫離受試者的組織切片；檢測的具體方法例如通過直接或間接酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫熒光法、Western blot、免疫組織化學(xué)等測定SBKl蛋白在靶組織中的表達(dá)水平；或者，例如經(jīng)與用放射性或非放射性同位素標(biāo)記的反義RNA或DNA探針與擴增后的DNA序列雜交，進(jìn)行檢測，也可使用衍生于PCR方法檢測，例如逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。 作為選擇，可以原位直接從活組織檢查或切除術(shù)得到的患者組織的組織切片(固定和/或冰凍)上來檢測本發(fā)明SBKl多核苷酸的表達(dá)，此時不需要純化核酸。這些分析技術(shù)包括 DNA或RNA印跡分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、原位雜交分析以及聚合酶鏈反應(yīng)分析。本發(fā)明還提供檢測SBKl的基因或蛋白的表達(dá)的試劑在制備用于檢測腫瘤的組合物中的應(yīng)用。所述的組合物可以為藥物組合物、檢測制劑或試劑盒。所述試劑可以為蛋白、 核酸、碳水化合物等，優(yōu)選為抗體、反義RNA或小干擾RNA(SiRNA)。例如，所述的檢測SBKl 的基因(編碼SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的多核苷酸序列)的表達(dá)的試劑可以包括 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 所示的引物。所述的檢測 SBKl 的蛋白(SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列)的表達(dá)的試劑可以包括針對SEQID NO :2所示的氨基酸序列的單克隆抗體或多克隆抗體；優(yōu)選所述多克隆抗體為純化的多克隆抗體；優(yōu)選所述的多克隆抗體針對SEQ ID NO 2所示序列的第5 M位氨基酸。本發(fā)明的SBKl的基因或蛋白可以作為診斷指標(biāo)。因此，可以利用限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、熒光原位雜交法(FISH)等方法或它們的組合，檢測體內(nèi)因本發(fā)明的SBKl表達(dá)不足或過量所致的病理狀態(tài)。同樣，也可以使用本發(fā)明SBKl蛋白的抗體，通過放射性免疫分析、競爭性結(jié)合法、Western印跡分析法或酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)達(dá)到相同的目的。


圖1顯示人SBKl的cDNA序列以及所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列。圖2顯示SBKl在人的不同組織中RT-PCR結(jié)果。圖3顯示SBKl在不同細(xì)胞系中RT-PCR結(jié)果。圖4顯示SBKl在不同的細(xì)胞系中Wfestern blot檢測結(jié)果。圖5顯示免疫組化染色結(jié)果，其中，左邊圖片為正常卵巢組織，右邊圖片為漿液性卵巢癌組織。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實驗指南》(2002年第三版[美]薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中未標(biāo)明來源的試劑和材料均可商購獲得。
實施例1、人SBKl的編碼區(qū)核苷酸序列以及氨基酸序列按照現(xiàn)有技術(shù)(例如王平章等，人SBKl cDNA的克隆及其相互作用蛋白的篩選， 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2006年4月，22(4) :313-321)的記載，PCR擴增獲得SBKl cDNA序列，該cDNA序列片段長1610bp (參見SEQ ID NO 1及圖1所示)，包含一個1275bp 的完整0RF，編碼4 個氨基酸(參見SEQ IDNO :2所示)。在起始密碼子ATG之前存在同一讀框內(nèi)終止密碼子(In-framestop code) TGA，參見圖1中方框標(biāo)注。蛋白序列包含完整的激酶結(jié)構(gòu)域(SEQID NO 2所示第52 316位氨基酸)，含有保守的ATP結(jié)合位點(SEQ ID NO :2所示第82位賴氨酸，參見圖1中方框標(biāo)注的第82位賴氨酸K)以及保守的催化區(qū)活性位點(SEQ ID NO 2所示174位天冬氨酸，參見圖1中方框標(biāo)注的第174位天冬氨酸D)。 蛋白序列羧端含有一個富含PV的區(qū)域(參見圖1中下劃線標(biāo)注的氨基酸序列)，推測該區(qū)域與含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合，其中方框標(biāo)注的氨基酸序列為推測的與SH3結(jié)構(gòu)域作用的核心區(qū)域，斜體標(biāo)注的核苷酸序列為PCR的引物序列。實施例2、人SBKl基因的表達(dá)譜分析為保證擴增的特異性和敏感性，本實施例中的表達(dá)譜分析采用巢式PCR方法，即設(shè)計外側(cè)和內(nèi)側(cè)2套PCR引物，先使用外側(cè)PCR引物(上游引物為5’ -CCCAAGATCCGGTCAT TACAACTCCACA-3，(SEQ ID NO :3)，下游引物 5，-TCAGACGCAGATCTCGATGGCCGTGGC-3，(SEQ ID NO 4))進(jìn)行擴增，模板采用Ιμ 組織或細(xì)胞系cDNA;然后取PCR產(chǎn)物2μ1，以內(nèi)側(cè)引物(上游引物為 5，-AGCATCACCAACAGCCTCTCCTCC-3，(SEQ ID NO :5)，下游引物為 5，-CCGG TGAGCACGCAGAAGATGAG-3，(SEQ ID NO :6))進(jìn)行擴增，20 μ 1 擴增體系。巢式 PCR 條件采用 Touchdown-PCR方法為94°C變性30秒，從65°C依次降低到60°C退火30秒，每個循環(huán)退火溫度降低0. 5°C，共10個循環(huán)，然后以60°C退火共20個循環(huán)，均72°C延伸30秒。各組織 cDNA模板均商購獲得，例如購自北京諾賽基因組研究中心有限公司研發(fā)課題組，也可按照現(xiàn)有技術(shù)的方法自行制備獲得。各細(xì)胞系RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄分別采用TRIzoI及RT-PCR試劑盒(Invitrogen)根據(jù)配套的說明書進(jìn)行操作處理，采用GAPDH作為內(nèi)參。RT-PCR表達(dá)譜分析結(jié)果參見圖2。圖2各泳道分別為1乙狀結(jié)腸，2左心竇，3膽囊，4結(jié)腸癌，5胃癌，6子宮，7十二指腸，8皮膚癌，9肺，10陰莖，11肌肉，12盲腸，13肺癌， 14闌尾，15膀胱，16睪丸，17胎盤，18食道，19淋巴結(jié)，20前列腺，M表示Marker,自上而下片斷大小分別為2000、1000、750、500、250、100bp。圖2上部分圖片為SBKl的擴增結(jié)果，擴增產(chǎn)物為452bp，下部分為內(nèi)參GAPDH的擴增結(jié)果。取部分PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗證為SBKl的表達(dá)序列。圖3為各細(xì)胞系cDNA為模板的PCR電泳結(jié)果，各泳道分別為1MRC5，2HeLa, 3H520, 4H1299, 5Dul45,6U251, 7HepG2,8A549,9HT29,10293T, 11MCF7,12 有引物無模板對照。從圖2和圖3可以看出，SBKl在RNA水平上在各細(xì)胞系中均有表達(dá)，但是只在少數(shù)組織內(nèi)有明顯的PCR條帶。實施例3、內(nèi)源性SBKl的檢測(1)多肽合成及抗體制備、純化。采用DNAstar軟件對SBKl蛋白質(zhì)序列進(jìn)行抗原性分析，并選取特異性的親水區(qū)域CPEPEPPRSLTCCGPGTAPG(SEQ ID NO :2所示第5 24位氨基酸)作為設(shè)計抗原的肽段，由上海華大天源生物科技有限公司進(jìn)行肽段的合成。使用匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)作為載體蛋白與抗原肽進(jìn)行偶聯(lián)，純化的偶聯(lián)肽與弗氏完全佐劑(FCA) 進(jìn)行乳化，免疫兔子以制備兔抗血清。按常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。使用ELISA方法檢測血
8清效價。制備成功的兔抗血清，使用溴化氰活化瓊脂糖凝膠4B偶聯(lián)抗原肽制備親和層析柱對抗體進(jìn)行純化。純化后的抗體即可用于Western blot檢測。(2) Western blot檢測內(nèi)源性SBK1。各細(xì)胞系根據(jù)各自培養(yǎng)要求分別使用含10% 血清的DMEM或1640培養(yǎng)基(HyClone)進(jìn)行培養(yǎng)。各取約100萬個培養(yǎng)細(xì)胞使用100 μ 1 細(xì)胞裂解液(1XPBS,1%NP40,0. 5% sodiumdeoxycholate, 0. 1 % SDS)裂解細(xì)胞，離心取上清用于Astern blot檢測。按標(biāo)準(zhǔn)WWfestern blot程序進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作。一抗使用上述純化的兔抗人SBKl抗體，二抗使用HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(Santa Cruz)。使用 Pierce公司的發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行檢測。結(jié)果參見圖4所示，圖4中各泳道分別為1SBK1過表達(dá)產(chǎn)物對照，2HD9，3Dul45， 4H520, 5HeLa, 6HepG2, 7MG63,8U251,9A5490 SBKl 分子量大小為 50KD，Beta-ACTIN 分子量 43KD。上部分圖片為SBKl的檢測，下部分圖片為內(nèi)參Beta-ACTIN的檢測。由圖4可以看到，盡管表達(dá)強弱不一，SBKl在各細(xì)胞系中均有所表達(dá)，以肺癌細(xì)胞 H520表達(dá)最為明顯。這進(jìn)一步證明了內(nèi)源性的SBKl蛋白的存在。實施例4、免疫組化染色檢測腫瘤及邊緣組織組合芯片(型號為CC00-11-016)購買自陜西超英生物科技有限公司。該芯片各組織取材于60例病例，點陣總數(shù)為96個。每種組織包含3個獨立病例來源的癌組織和3個正?；虬┡越M織的點陣。免疫組化染色過程先使用微波加熱法進(jìn)行抗原修復(fù)，以10%正常山羊血清 (PBS)封閉，室溫15分鐘，將切片傾斜，將血清吸去后直接滴加用PBS稀釋的一抗(實施例 3制備得到的純化的兔抗人SBKl抗體)工作液，37°C孵育1小時或4°C過夜。PBS洗5分鐘X3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(Santa Cruz))工作液37°C， 30 40分鐘。PBS洗5分鐘X 3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素工作液，37 °C， 30 40分鐘孵育，PBS洗后，DAB顯色(陽性顯色可見棕黃色)。使用自來水充分沖洗終止顯色，蘇木精復(fù)染(染核，呈藍(lán)色)，酒精脫水，二甲苯透明處理，最后使用中性樹膠封片。組織芯片免疫組化染色結(jié)果表明，在全部的膀胱、肺、肝臟、睪丸、子宮、結(jié)腸、口腔舌腺、胃淋巴結(jié)、卵巢、皮膚、前列腺、乳腺、腎臟、食道、胃體、胰腺的癌癥組織及其癌旁組織 (或正常組織)中，全部的漿液性卵巢腺癌(病理診斷均為III期)組織中，與正常卵巢組織相對，SBKl明顯高表達(dá)(參見圖5)。
權(quán)利要求
1.針對SEQID NO :2所示的氨基酸序列或編碼該序列的核苷酸序列的拮抗劑在制備診斷和/或治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的核苷酸序列為SEQID NO :1所示的序列或SEQ ID NO 1所示序列的第336 1610位核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述的癌癥為卵巢癌。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的應(yīng)用，其中所述的拮抗劑為siRNA、反義RNA或抗體； 所述的抗體優(yōu)選為單克隆抗體或多克隆抗體，所述多克隆抗體優(yōu)選為純化的多克隆抗體。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述的多克隆抗體針對SEQIDN0:2所示序列的第5 M位氨基酸。
6.一種診斷和/或治療癌癥的藥物組合物，該藥物組合物包含針對SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列或編碼該序列的多核苷酸序列的拮抗劑，以及一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中所述的拮抗劑為siRNA、反義RNA或抗體；優(yōu)選所述的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；優(yōu)選所述多克隆抗體為純化的多克隆抗體；優(yōu)選所述的多克隆抗體針對SEQ ID NO 2所示序列的第5 M位氨基酸。
8.如權(quán)利要求6或7所述的藥物組合物，其中所述的癌癥為卵巢癌。
9.檢測SEQID NO :2所示的氨基酸序列或編碼該氨基酸序列的核苷酸序列的表達(dá)的試劑在制備用于檢測癌癥的組合物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述的癌癥為卵巢癌； 所述的組合物為藥物組合物、檢測制劑或試劑盒；優(yōu)選所述的檢測編碼SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列的表達(dá)的試劑包括 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 所示的引物；優(yōu)選所述的檢測SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的表達(dá)的試劑包括針對SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的單克隆抗體或多克隆抗體；優(yōu)選所述多克隆抗體為純化的多克隆抗體；優(yōu)選所述的多克隆抗體針對SEQ ID NO 2所示序列的第5 M位氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及人類激酶SBK1的新應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明涉及SBK1在診斷癌癥特別是卵巢癌中的應(yīng)用、SBK1的拮抗劑在制備診斷和/或治療癌癥特別是卵巢癌的藥物中的應(yīng)用、診斷和/或治療癌癥特別是卵巢癌的藥物組合物以及檢測SBK1表達(dá)的試劑在制備用于檢測癌癥特別是卵巢癌的組合物中的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102169121SQ20101011463
公開日2011年8月31日 申請日期2010年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月25日
發(fā)明者王平章, 石太平, 郭帥, 馬大龍 申請人:北京諾賽基因組研究中心有限公司