專利名稱：一種制備降低食物過敏原反應(yīng)的融合蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域的DNA重組技術(shù)和應(yīng)用，具體 涉及一種利用基因工程技術(shù)獲得相應(yīng)生物蛋白降低食物過敏性的的方法。
背景技術(shù)：
過敏是全世界各地普遍存在的一個問題，而食物過敏是過敏性疾病的一種，而且 是嚴(yán)重過敏性疾病的誘因。流行病學(xué)研究顯示，約33 %的過敏反應(yīng)由食物誘發(fā)，食物過敏已 成為重要的食品安全問題，引起了廣泛的關(guān)注。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，在美國約有2% 2. 5% 人(600萬 700萬)經(jīng)歷過食物過敏，嬰幼兒發(fā)生率約4% 6 %，兒童和成人約1 % -2 %。 在英國，食物過敏反應(yīng)的發(fā)生率成人為1. 4% 1.9%，兒童占5%。大約有1000萬人發(fā)病， 其中100萬人反應(yīng)嚴(yán)重。荷蘭白種人食物過敏發(fā)生率成人為1.4%，兒童為5% 7%。重 慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院在一年內(nèi)對314名2歲以下兒童進(jìn)行食物過敏流行病調(diào)查，確診的食 物過敏發(fā)病率為5.2%。食物過敏有兩種類型一種是速發(fā)型過敏反應(yīng)，表現(xiàn)為吃了致過敏的食物2h內(nèi)出 現(xiàn)蕁麻疹、血尿、哮喘發(fā)作等。嚴(yán)重的過敏反應(yīng)伴隨著呼吸困難，嚴(yán)重者會虛脫休克，甚至危 及生命。隨著食品種類的增多，近年來過敏性疾病呈持續(xù)上升趨勢。目前，各種類型的食物過敏沒有特效藥，治療的唯一有效措施是嚴(yán)格避免特定食 物抗原的攝入。同時，由于食品的種類繁多，地區(qū)、季節(jié)、個人飲食習(xí)慣都各不相同，因而治 療和診斷帶來困難。同時，雖然并非所有的蛋白質(zhì)都會引起過敏，但是食物中90%的過敏原 是蛋白質(zhì)，因而預(yù)防食物過敏的重要途徑是預(yù)防食物中的蛋白質(zhì)過敏。大多數(shù)蛋白質(zhì)引起 的食物過敏是由于蛋白質(zhì)內(nèi)部的二硫鍵。因此將蛋白中的二硫鍵還原可以降低食物中的過 敏原性。生物體中的硫氧還蛋白系統(tǒng)能夠還原蛋白質(zhì)的二硫鍵。硫氧還蛋白體系在生物體 中廣泛存在，是除了谷胱甘肽體系以外的另一個保持細(xì)胞內(nèi)還原勢的蛋白體系。完整的硫 氧還蛋白系統(tǒng)包括硫氧還蛋白(Trx)硫氧還蛋白還原酶(TrxR)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADPH)。其中硫氧還蛋白是一種12-13kD的小分子蛋白，含有一個保守活性區(qū)域(WCGPC)， 還原型Trx在細(xì)胞氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御上有著重要的作用。硫氧還蛋白還原酶是一 種NADPH依賴的飽含F(xiàn)AD結(jié)構(gòu)域的二聚體酶，屬于吡啶核苷酸_ 二硫化物氧化還原酶家族 成員，其在體系中維持Trx的還原型。在NADPH的存在下，硫氧還蛋白被硫氧還蛋白還原酶 還原，然后，被還原的硫氧還蛋白接著去還原目標(biāo)蛋白中的二硫鍵。已有的研究證明，大腸 桿菌中的硫氧還蛋白體系可以還原牛奶中的β-乳球蛋白和小麥醇溶蛋白，還原后的蛋白 被證明有效地降低了過敏原性。但是該種蛋白體系尚未在食品工業(yè)中作為食品添加劑而投 入應(yīng)用，同時，硫氧還蛋白體系中含有兩種蛋白，在實(shí)際操作中多有不便。絲狀真菌黑曲霉是一種重要的工業(yè)微生物和模式真菌，其基因組全序已經(jīng)公布， 它被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，用于生產(chǎn)檸檬酸和各種不同的工業(yè)用酶。在進(jìn)一步開發(fā)生產(chǎn)燃 料和化學(xué)品的生物過程中，黑曲霉是一個萬能的細(xì)胞工廠，因?yàn)樗苣褪艿蚉H值，可以利 用廣泛的碳源，并有相對較高的轉(zhuǎn)化率。而作為細(xì)胞兩大抗氧化體系之一的硫氧還蛋白體系，在黑曲霉發(fā)酵過程中，對不利條件的耐受上，起到很大的作用。研究發(fā)現(xiàn)，麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)中的TrxR和Trx之間存在一 個由22個氨基酸組成的天然連接肽(ffieles et al.，1995 ；Wang et al.，1998)，可用于其 他微生物Trx系統(tǒng)的酶融合。近年來，蛋白質(zhì)融合技術(shù)的發(fā)展日益完善，并被廣泛用于獲 得雙功能或多功能的蛋白質(zhì)或特殊功能的抗體?；谥丿B延伸術(shù)(splicing-by-overlap extension，S0E)的基因首尾相連融合方法(Horton et al.，1989 ；Lu et al. ,2006),目前 常被用于融合蛋白的構(gòu)建，其優(yōu)點(diǎn)是不會引入任何額外的氨基酸殘基，也無需對連接方向 進(jìn)行識別。因此，利用黑曲霉中的硫氧還蛋白體系來研究開發(fā)高效、便利的食品添加劑，對于 降低加工食品的變應(yīng)原性至關(guān)重要，而尋找適當(dāng)?shù)腡rx系統(tǒng)進(jìn)行改良，是推進(jìn)這一研究的 重要方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種制備降低食物過敏原反應(yīng)的融合蛋白的方法，它利 用SOE (splicing-by-overlap extension，基于重疊延伸術(shù))法得到含有黑曲霉硫氧還蛋 白基因和硫氧還蛋白還原酶基因的融合蛋白基因，再進(jìn)一步得到含有融合基因的重組菌 株，通過將二者的基因進(jìn)行融合改良，并通過和食品中蛋白的孵育以還原食品蛋白中的二 硫鍵，從而降低食品過敏原反應(yīng)。為此本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它包括以下步驟硫氧還 蛋白體系中硫氧還蛋白基因Trx和硫氧還蛋白還原酶基因TrxR的獲得，設(shè)計融和肽序列， 利用融合肽序列將基因Trx和TrxR融合，然后獲得含有融合基因的重組菌株，最后進(jìn)行異 源表達(dá)純化。本發(fā)明的技術(shù)方案具體依次通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)硫氧還蛋白體系相關(guān)基因的獲得根據(jù)荷蘭帝斯曼公司報道的黑曲霉硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶的疑似基因 序列，用PCR方法分別從黑曲霉基因組中擴(kuò)增出An-TrxR和An-Trx。并根據(jù)基因序列設(shè)計 帶酶切位點(diǎn)NdeI和HindIII的引物。(2)設(shè)計融和肽序列根據(jù)硫氧還蛋白還原酶和硫氧還蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)，設(shè)計融合肽序列(Link A, LinkB)。Link A為根據(jù)麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)中的TrxR和Trx之間的 22aa的天然連接肽基因序列設(shè)計的。Link B為人工設(shè)計的柔性肽(GGGGS)3。(3)含有硫氧還蛋白體系融合基因的重組菌株的構(gòu)建利用SOE法分別用Link A和Link B將An-TrxR和An-Trx序列融合。用內(nèi)切酶 NdeI和HindIII分別切開融合基因的產(chǎn)物和質(zhì)粒Pet_29b。將融合序列與質(zhì)粒相連。并轉(zhuǎn) 入宿主菌BL21中表達(dá)。(4)異源表達(dá)純化利用Pet29b含有的6個組氨酸標(biāo)簽，通過鎳柱親和層析純化硫氧還蛋白體系的融
合蛋白ο本發(fā)明根據(jù)黑曲霉所具有的較高的抗逆能力的特點(diǎn)，利用硫氧還蛋白體系能夠還 原二硫鍵，并且蛋白中的二硫鍵是引起食物過敏的主要原因的這一原理，利用SOE法將硫氧還蛋白體系中的硫氧還蛋白(Trx)和硫氧還蛋白還原酶(TrxR)進(jìn)行融合，以降低食品中 蛋白過敏原反應(yīng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，其將在工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用意義的AnTrx體系的兩個蛋白的 基因克隆，并將二者的基因進(jìn)行融合改良，通過和食品中蛋白的孵育以還原食品蛋白中的 二硫鍵，從而降低其過敏原反應(yīng)。同時，通過基因融合的改良使得An-TrxR和An-Trx在作 為一種食品添加劑時，在食品工業(yè)應(yīng)用上得到簡便。


圖1為本發(fā)明中親本AnTrx/AnTrxR及RMT、TMR、RGT、TGR四種融合蛋白表達(dá)后的 SDS-PAGE圖譜，M 分子量標(biāo)記。圖2為本發(fā)明中室溫下DTT還原AnTrx和融合蛋白中AnTrx部分后，其還原牛胰 島素的活性(0D650)圖。圖3中左圖為本發(fā)明中親本蛋白(AnTrx、AnTrxR)與融合蛋白RMT和RGT對麥醇 溶蛋白二硫鍵的還原，利用mBBr標(biāo)記還原后的巰基并經(jīng)SDS-PAGE電泳后熒光顯色圖，右圖 泳道4 8與左圖相同，但經(jīng)考馬思亮藍(lán)R250染色。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明所述的一種制備降低食物過敏原反應(yīng)的融合蛋白的方法依次包括以下步 驟LAnTrx基因的克隆(1)從NCBI中找到黑曲霉(A. niger)基因組中類黑曲霉硫氧還蛋白相關(guān)的序列號 (CAK43619)。(2)菌株總DNA的提取接種黑曲霉(Aspergillus niger) 3. 4523菌株孢子懸浮 液到馬鈴薯培養(yǎng)基PDA平板上，在25°C下培養(yǎng)3天后，通過液氮研磨法提取總DNA。(3)設(shè)計一對引物，從黑曲霉基因組中得到含有內(nèi)含子的AnTrx序列。正向引物AACACCCATATGTCTCACAAGGTTCACG(序列表中第1 個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG(序列表中第2個序列)以黑曲霉基因組為模板，擴(kuò)增含有內(nèi)含子的AnTrx的片段(456bp)。PCR采用50μ 1 體系，包括50ng黑曲霉基因組、0. 2μΜ引物、0. 2mM dNTP、2. 5mMMgCl2、1 Xtaq聚合酶緩沖液 和1. 5U taq聚合酶和1. 5Upfu聚合酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C 變性30s、65°C退火30s和72°C延伸45s ；循環(huán)后72°C再延伸7min。擴(kuò)增得到456bp的片 段，割膠回收，與pGEMT-easy載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化及鑒定后送樣測序，確定得到的序列為含有 內(nèi)含子的硫氧還蛋白序列。(4)設(shè)計一對引物，利用基因重疊延伸法(SOE)法獲得無內(nèi)含子的AnTrx基因序 列。正向引物ATCATATGTCTCACAAGGTTCAC GACATCACCTCTAAGGCCGAGTTCGCCGAGA (序列表中第 3 個序列)
反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG(序列表中第4個序列)利用該引物從已經(jīng)得到的含有內(nèi)含子的AnTrx序列中得到無內(nèi)含子的AnTrx序 列。無內(nèi)含子的AnTrx片段的擴(kuò)增以含有內(nèi)含子的AnTrx基因組為模板，擴(kuò)增無內(nèi)含 子的部分片段(324bp)。PCR采用50μ 1體系，包括50ng含內(nèi)含子的AnTrxDNA、0. 2μΜ引 物、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2、1 X taq聚合酶緩沖液和1. 5Utaq聚合酶和1. 5Upfu聚合酶。 混勻后先94°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C延伸45s ； 循環(huán)后72°C再延伸7min。擴(kuò)增得到308bp的片段，割膠回收，與pGEMT-easy載體連接，經(jīng) 轉(zhuǎn)化及鑒定后送樣測序，確定得到的序列為無內(nèi)含子的硫氧還蛋白序列。2. AnTrxR基因的克隆(1)從NCBI中找到黑曲霉(A. niger)基因組中類黑曲霉硫氧還蛋白相關(guān)的序列號 (CAK43946)。(2)菌株總DNA的提取接種黑曲霉(Aspergillus niger) 3. 4523菌株孢子懸浮 液到馬鈴薯培養(yǎng)基PDA平板上，在25°C下培養(yǎng)3天后，通過液氮研磨法提取總DNA。(3)設(shè)計引物，從黑曲霉基因組中得到含有內(nèi)含子的AnTrxR序列。正向引物AACACCCATATGTCTCACAAGGTTCACG(序列表中第5 個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG(序列表中第6個序列)含有內(nèi)含子的AnTrxR片段的擴(kuò)增以黑曲霉基因組為模板PCR采用50 μ 1體系， 包括50ng含內(nèi)含子的黑曲霉基因組DNA、0. 2μΜ引物、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2UXtaq聚 合酶緩沖液和1. 5U taq聚合酶和1. 5Upfu聚合酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個 循環(huán)94°C變性30s、65°C退火60s和72°C延伸30s ；循環(huán)后72°C再延伸7min。擴(kuò)增得到 1240bp的片段。(4)利用基因重疊延伸法(SOE)法獲得無內(nèi)含子的AnTrxR基因序列從已經(jīng)得到的含有內(nèi)含子的AnTrxR序列中擴(kuò)增得到無內(nèi)含子的AnTrxR序列，由 于整個基因序列中含有兩個內(nèi)含子，因此分為兩段擴(kuò)增無內(nèi)含子的部分片段al和bl，需設(shè) 計a、b、c三對引物，用引物a組得到去除第一個內(nèi)含子的片段，用引物b組得到去除第二個 內(nèi)含子的片段，所得到得兩個片度互相有重疊的部分，再利用引物c組，將兩個重疊的區(qū)域 融合在一起以后得到無內(nèi)含子的AnTrxR基因。引物a組正向引物ATAGCTCTCATATGGTGCACACCAACGTCGTTATCATCGGCTCCGGCCCCGCCGCCCACA (序列表中 第7個序列)反向引物CAATGCAGCCGGATCCGGCACTGGTGATGGCCTGGC(序列表中第8 個序列)引物b組正向引物GCCATCACCAGTGCCGGATCCGGCTGCATTGCCGCTC(序列表中第9 個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG(序列表中第10個序列)引物c組正向引物AACACCCATATGTCTCACAAGGTTCACG(序列表中第11 個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG(序列表中第12個序列)
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無內(nèi)含子的AnTrxR片段的擴(kuò)增以含有內(nèi)含子的AnTrxR基因組為模板，由于中間 含有兩個內(nèi)含子，因此分為兩段擴(kuò)增無內(nèi)含子的部分片段al和bl。①片段al的擴(kuò)增PCR采用50μ 1體系，包括50ng含內(nèi)含子的AnTrx DNA.0. 2μΜ 引物a組、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2、1 X taq聚合酶緩沖液和1. 5U taq聚合酶和1. 5Upfu 聚合酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C 延伸60s ；循環(huán)后72°C再延伸7min。擴(kuò)增得到937bp的片段。②片段bl的擴(kuò)增PCR采用50μ 1體系，包括50ng含內(nèi)含子的AnTrx DNA.0. 2μΜ 引物b組、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2、1 X taq聚合酶緩沖液和1. 5U taq聚合酶和1. 5Upfu 聚合酶。混勻后先94°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C 延伸30s ；循環(huán)后72°C再延伸7min。擴(kuò)增得到195bp的片段，割膠回收后得到兩個片段。③再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用50 μ 1體系，包括25ng a片段的DNA、25ng b片段 的DNA、0. 2μΜ 引物 c 組、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2、1 Xtaq聚合酶緩沖液和 1. 5U taq聚合 酶和1. 5Upfu聚合酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退 火30s和72°C延伸60s ；循環(huán)后72°C再延伸7min。擴(kuò)增得到bp的片段。與pGEMT-easy載 體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化及鑒定后送樣測序，確定得到的序列為無內(nèi)含子的硫氧還蛋白序列。3.連接AnTrxR基因和AnTrx基因的連接肽的基因序列連接肽的基因序列分別為Link A和Link B, Link A為根據(jù)麻風(fēng)分枝桿菌 (Mycobacterium leprae)中的TrxR和Trx之間的22aa的天然連接肽基因序列設(shè)計的，Link B為人工設(shè)計的柔性肽(GGGGS)3。以引物組A1-A3為例，首先利用Al組，將AnTrxR基因序列的末端添加部分前半部 分融合肽序列LinkerA，再利用A2組將AnTrx基因的前端添加后半部分融合肽LinkerA序 列，AnTrx的前端序列和前面的AnTrxR末端的融合肽序列略有重疊。之后利用重疊延伸法， 也就是SOE法，用A3組的引物，將前面得到的兩個含有融合肽序列的AnTrxR和AnTrx融合 后連接在一起，得到還有融合肽LinkerA的融合蛋白序列。設(shè)計引物組B1-B3、C1-C3、D1_D3的原理與設(shè)計引物組A1-A3相同。① Linker A GCTAACGAAACAACAGAGGAAACTGGAGACGTTGACAGTACCGACACAACCGATTGGAGCACTGCG (序 列表中第13個序列)② LinkerB GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATC (序列表中第 14 個序列)③利用SOE法重疊延伸得到融合序列。設(shè)計引物Al 正向引物AACACCCATATGTCTCACAAGGTTCACG (序列表中第 15 個序列)反向引物GTCGGTACTGTCAACGTCTCCAGTTTCCTCTGTTGTTTCGTTAGCAAGCAGAGGGTTGGACTTGTA (序 列表中第16個序列)A2
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正向引物ACTGGAGACGTTGACAGTACCGACACAACCGATTGGAGCACTGCGATGTCTCACAAGGTTCACGACA( 序列表中第17個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG (序列表中第 18 個序列)A3:正向引物AACACCCATATGTCTCACAAGGTTCACG (序列表中第 19 個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG (序列表中第 20 個序列)Bl 正向引物ACTGGAGACGTTGACAGTACCGACACAACCGATTGGAGCACTGCGATGGTGCACACCAACGTCGTTA( 序列表中第21個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG (序列表中第 22 個序列)B2 正向引物AACACCCATATGTCTCACAAGGTTCACG (序列表中第 23 個序列)反向引物GTCGGTACTGTCAACGTCTCCAGTTTCCTCTGTTGTTTCGTTAGCTGCAAGCAGAGCCTGGATCTTC( 序列表中第24個序列)B3 正向引物AACACCCATATGTCTCACAAGGTTCACG (序列表中第 25 個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG (序列表中第 26 個序列)Cl 正向引物AACACCCATATGTCTCACAAGGTTCACG (序列表中第 27 個序列)反向引物CCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCAAGCAGAGGGTTGGACTTGTA (序列表中第 28個序列)C2 正向引物GCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCCATGTCTCACAAGGTTCACGA (序列表中第 29 個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG (序列表中第 30 個序列)
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C3 正向引物AACACCCATATGTCTCACAAGGTTCACG (序列表中第 31 個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG (序列表中第 32 個序列)Dl:正向引物GCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCCATGGTGCACACCAACGTCGTTA (序列表中第 33個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG (序列表中第 34 個序列)D2 正向引物AACACCCATATGTCTCACAAGGTTCACG (序列表中第 35 個序列)反向引物CCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGCAAGCAGAGCCTGGATCTTC (序列表中第 36個序列)D3 正向引物AACACCCATATGTCTCACAAGGTTCACG (序列表中第 37 個序列)反向引物TGGAAGCTTTGCAAGCAGAGCCTGG (序列表中第 38 個序列)4.以已經(jīng)得到的AnTrx和AnTrxR基因序列為模板，分別克隆得到含有部分連接肽 序列的基因片段，再對兩者進(jìn)行融合。蛋白質(zhì)融合技術(shù)包括首尾相連的融合(end-to-end fusion)與插入式融 合(insertion fusion)，融合后的蛋白組分會因相互作用而增強(qiáng)或削弱各自的活性 (Trujillo et al.，1997)。因此，蛋白質(zhì)融合需要選擇合適的連接肽和融合技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化， 盡可能使融合的蛋白組分正向互作。設(shè)計以下RMT、TMR、RGT、TGR四種融合基因是因?yàn)橛脙煞N融合肽分別首位顛倒地 連接AnTrxR基因和AnTrx基因，用兩種融合肽是為了考察這兩種融合肽哪一種對融合蛋白 的催化效率的影響更好一些，首位顛倒地連接是因?yàn)橄胍疾霢nTrxR在N端和在C端融合 的活性是否有所變化，以及AnTrx在N端和在C端的活性是否有所變化。同時，對于整個 AnTrx體系來說，也想通過設(shè)計這四種融合蛋白，想了解究竟是AnTrxR放在融合蛋白N端的 體系酶活高還是將AnTrxR放在融合蛋白C端的體系酶活高。(1)融合基因RMT (用LinkerA連接AnTrxR和AnTrx)的獲得①末端含有連接肽序列的AnTrxR的基因(Ml)序列的獲得以不含有內(nèi)含子的 AnTrxR基因組為模板，PCR采用50 μ 1體系，包括50ng不含內(nèi)含子的AnTrxRDNA、0. 2 μ M引 物 Al 組、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2、1 X taq 聚合酶緩沖液和 1. 5U taq 聚合酶和 1. 5Upfu 聚 合酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C延
9伸60s ；循環(huán)后72°C再延伸7min。②首端含有連接肽序列的AnTrx的基因(M2)的獲得以不含有內(nèi)含子的AnTrx基 因組為模板，PCR采用50 μ 1體系，包括50ng不含內(nèi)含子的AnTrxR DNA,0. 2 μ M引物A2組、 0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2,1 X taq聚合酶緩沖液和1. 5Utaq聚合酶和1. 5Upfu聚合酶?；?勻后先94°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C延伸30s ；循 環(huán)后72°C再延伸7min。③RMT的獲得將M1、M2分別融合以Ml和M2基因?yàn)槟０澹琍CR采用50μ 1體系， 包括 25ngMl 和 25ng M2、0. 2 μ M 引物 A3 組、0. 2mM dNTP、2. 5mMMgCl2、1 X taq 聚合酶緩沖液 和1. 5U taq聚合酶和1. 5Upfu聚合酶。混勻后先94°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C 變性30s、65°C退火30s和72°C延伸IOOs ；循環(huán)后72°C再延伸7min。擴(kuò)增得到1494bp的 片段。(2)融合基因TMR (用LinkerA連接AnTrx和AnTrxR)的獲得①首端含有連接肽序列的AnTrxR的基因(Ml’)的獲得以不含有內(nèi)含子的 AnTrxR基因組為模板，PCR采用50 μ 1體系，包括50ng不含內(nèi)含子的AnTrxRDNA、0. 2 μ M引 物 Bl 組、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2、1 X taq 聚合酶緩沖液和 1. 5U taq 聚合酶和 1. 5Upfu 聚 合酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C延 伸60s ；循環(huán)后72°C再延伸7min。②末端含有連接肽序列的AnTrx的基因(M2’ )序列的獲得以不含有內(nèi)含子的 AnTrx基因組為模板，PCR采用50 μ 1體系，包括50ng不含內(nèi)含子的AnTrxDNA、0. 2 μ M引物 Β2 組、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2、1 X taq 聚合酶緩沖液和 1. 5U taq 聚合酶和 1. 5Upfu 聚合 酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C延伸 30s ；循環(huán)后72°C再延伸7min。③TMR的獲得將M1，、M2，分別融合以Ml，和M2，基因?yàn)槟０澹琍CR采用50 μ 1 體系，包括 25ng Ml，禾口 25ng M2，、0. 2 μ M 引物 B3 組、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2UXtaq 聚 合酶緩沖液和1. 5U taq聚合酶和1. 5Upfu聚合酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個 循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C延伸IOOs ；循環(huán)后72°C再延伸7min。擴(kuò)增得到 1494bp的片段。(3)融合基因 RGT (Linker B 連接 AnTrxR 和 AnTrx)的獲得①末端含有連接肽序列的AnTrxR的基因(Gl)序列的獲得以不含有內(nèi)含子的 AnTrxR基因組為模板，PCR采用50 μ 1體系，包括50ng不含內(nèi)含子的AnTrxRDNA、0. 2 μ M引 物 Cl 組、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2、1 X taq 聚合酶緩沖液和 1. 5U taq 聚合酶和 1. 5Upfu 聚 合酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C延 伸60s ；循環(huán)后72°C再延伸7min。②首端含有連接肽序列的AnTrx的基因(G2)的獲得以不含有內(nèi)含子的AnTrx基 因組為模板，PCR采用50 μ 1體系，包括50ng不含內(nèi)含子的AnTrxR DNA、0. 2 μ M引物C2組、 0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2,1 X taq聚合酶緩沖液和1. 5Utaq聚合酶和1. 5Upfu聚合酶?；?勻后先94°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C延伸30s ；循 環(huán)后72°C再延伸7min。③RGT的獲得將G1、G2分別融合以Gl和G2基因?yàn)槟０?，PCR采用50μ 1體系，包括 25ng Gl 和 25ng G2、0. 2 μ M 引物 B3 組、0. 2mM dNTP、2. 5mMMgCl2l X taq 聚合酶緩沖液 和1. 5U taq聚合酶和1. 5Upfu聚合酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C 變性30s、65°C退火30s和72°C延伸IOOs ；循環(huán)后72°C再延伸7min。擴(kuò)增得到1467bp的 片段。(4)融合基因 TGR(LinkerB 連接 AnTrx 和 AnTrxR)的獲得①首端含有連接肽序列的AnTrxR的基因(G1’)的獲得以不含有內(nèi)含子的 AnTrxR基因組為模板，PCR采用50 μ 1體系，包括50ng不含內(nèi)含子的AnTrxR DNA,0. 2 μ M 引物 Dl 組、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2、1 X taq 聚合酶緩沖液和 1. 5Utaq 聚合酶和 1. 5Upfu 聚合酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C 延伸60s ；循環(huán)后72°C再延伸7min。②末端含有連接肽序列的AnTrx的基因(G2’ )序列的獲得以不含有內(nèi)含子的 AnTrx基因組為模板，PCR采用50 μ 1體系，包括50ng不含內(nèi)含子的AnTrxDNA、0. 2 μ M引物 D2 組、0. 2mM dNTP、2. 5mM MgCl2、1 X taq 聚合酶緩沖液和 1. 5U taq 聚合酶和 1. 5Upfu 聚合 酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C延伸 30s ；循環(huán)后72°C再延伸7min。③TGR的獲得將G1，、G2，分別融合以G1，和G2，基因?yàn)槟０澹琍CR采用50 μ 1 體系，包括 25ng G1，禾口 25ng G2，、0. 2 μ M 引物 D3 組、0. 2mM dNTP、2. 5mMMgCl2、1 X taq 聚 合酶緩沖液和1. 5U taq聚合酶和1. 5Upfu聚合酶?；靹蚝笙?4°C變性5min，此后經(jīng)35個 循環(huán)94°C變性30s、65°C退火30s和72°C延伸IOOs ；循環(huán)后72°C再延伸7min。擴(kuò)增得到 1467bp的片段。應(yīng)用這種方法，分別得到融合基因RMT、TMR、RGT、TGR05.原核表達(dá)載體 pET-AnTrx、pET-AnTrxR、pET-RMT、pET-TMR、pET-RGT、pET-TGR 的 構(gòu)建pET-AnTrx構(gòu)建擴(kuò)增得到的AnTrx序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII消化后 插入原核表達(dá)載體pET-29b+中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-AnTrx。pET-AnTrxR、pET-RMT、pET-TMR、pET-RGT、pET-TGR 的構(gòu)建同上。6.重組質(zhì)粒的擴(kuò)增及目的蛋白表達(dá)將重組質(zhì)粒pET-AnTrx、pET-AnTrxR、pET-RMT、pET-TMR、pET-RGT、pET-TGR 用熱擊 轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ε. coli DH5 α，經(jīng)過菌落PCR鑒定及酶切鑒定及測序后，提取陽 性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ε. coli BL21 (DE3)，于37°C、150r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD6tltl = 0. 8)，而后加入0. 5mM IPTG后，其中含質(zhì)粒pET-AnTrx、pET-AnTrxR的轉(zhuǎn)化菌株在30°C和 160r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。含質(zhì)粒pET-RMT、pET-TMR、pET-RGT、pET-TGR的轉(zhuǎn)化菌株 在25°C和160r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。7.重組蛋白的可溶性分析通過離心收集步驟4中誘導(dǎo)后的菌液，進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎，運(yùn)行程序?yàn)闉槌晻r 間15s、間隙時間15s及全程時間20min。4°C下IOOOOg離心收集上清后，用不連續(xù)的十二 烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行分析。取20 μ 1破碎上清 液，加入5. OyL 5Χ 上樣緩沖液[60mM Tris-HCl，pH 6. 8 ；25% (w/v)甘油；2% (w/v) SDS, 14. 4mM β-巰基乙醇和0. 溴酚藍(lán)]。不連續(xù)凝膠中濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12.5%。各泳道的上樣量為15 μ L，在HoeferminiVE垂直電泳系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)上進(jìn)行電泳。樣品在濃縮膠中的電流保持12mA，在分離膠中的電流保持18mA。電 泳結(jié)束后。凝膠在染色液(1. 20g考馬撕亮藍(lán)R250、250mL乙醇、80mL乙酸和670mL dd_H20) 中染色過夜，然后在脫色液(250mL乙醇、80mL乙酸和670mL dd_H20)中脫色，直至背景無色。8.蛋白純化由于重組蛋白帶有6XHis標(biāo)簽，可采用Ni2+親和層析進(jìn)行純化。(1)取誘導(dǎo)后菌液50ml，4°C下5000r/min離心IOmin收集菌體，沉淀懸浮于25ml Binding Buffer (50mM Tris_HCl，pH 7. 8,500mM NaCl 和 5mM 咪唑)中，冰浴下超聲波破碎 菌體，4°C下12000r/min離心25min，取上清4°C保存?zhèn)溆谩?2)采用 AKTA purifier (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)純化系統(tǒng)對目的蛋白 進(jìn)行純化。上樣前，使用10倍柱體積的Binding Buffer以5ml/min的流速平衡鎳柱；流速 為lml/min上樣，再次以Binding Buffer以5ml/min的流速平衡鎳柱5_10個體積；梯度洗 脫，依次以10%、20%、30%和100%的Elution Buffer洗脫5個柱體積，流速為5ml/min， 進(jìn)行0D280蛋白吸收峰收集洗脫液。收集洗脫峰通過SDS-PAGE分析檢測純度。最后發(fā)現(xiàn) AnTrx和AnTrxR在10% Elution Buffer中洗脫后的蛋白純度最高，而融合蛋白在20%的 Elution Buffer的洗脫濃度中蛋白的純度最高。(3) SDS-PAGE鑒定獲得的純化部分用S印hadex G_25脫鹽。圖1為本發(fā)明中AnTrx 與AnTrxR單獨(dú)表達(dá)和融合表達(dá)后的SDS-PAGE圖譜。(a)泳道1 7分別為空載體對照與 獨(dú)立表達(dá)的AnTrxR、AnTrx, RMT, TMR、RGT及TGR的細(xì)胞破碎液。(b)圖a中泳道2_7表達(dá) 產(chǎn)物純化后的圖譜。M 分子量標(biāo)記。9、融合蛋白的重構(gòu)由于AnTrxR含有輔酶FAD，但其在E. coli BL21(DE3)內(nèi)的大量表達(dá)，以及后面的 純化步驟，使得其中的AnTrxR部分為脫輔基酶，為了重構(gòu)AnTrxR部分，從而進(jìn)行后期的活 性測定，將々111^11 、冊1\1]\ 、1 11和161 和其輔酶？40(5丨811^ St. Louis,USA) 一同孵育。將 FAD濃縮液加入已經(jīng)純化過的融合蛋白溶液中，使其最終濃度為蛋白濃度的5倍。在黑暗中 孵肓20分鐘。再利用HiTrap (GE Healthcare)脫鹽柱除去FAD并將蛋白溶液轉(zhuǎn)換成0. IM 的磷酸鹽緩沖液，pH7. O (Williams et. al.，1967 ；Thon et. al.，2007)10、AnTrx、AnTrxR 及融合蛋白 RMT RGT TMR TGR 的酶活測定。(1)用濁度法測定AnTrx的活性及融合蛋白中AnTrx部分的活性。由于Trx可被二硫蘇糖醇(DTT)還原且還原型的Trx可還原牛胰島素α鏈和β 鏈之間的二硫鍵而使游離的β鏈成為不溶于水的沉淀，故采用濁度法(Holmgren，1979) 測定AnTrx的活性。配制新鮮的牛胰島素反應(yīng)液(1. 25mg/mL牛胰島素.0. IM PBS, 2. OmM EDTA-Na2, pH 7.0)。將10 μ L 200mM DTT加入100 μ L樣品液中，室溫下孵育30min，然后加 入到500 μ L牛胰島素反應(yīng)液中，蛋白樣品的終濃度為4 μ Μ。室溫下測定650nm的吸收光 值，每分鐘測定一次，共測定13次。酶活力用第13分鐘的OD值表示。結(jié)果見圖2。圖2顯 示的曲線為為本發(fā)明中室溫下用DTT還原AnTrx和融合蛋白中AnTrx部分后，其對牛胰島 素的還原活性(OD65tl)。結(jié)果分析
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13分鐘時OD65tl的讀數(shù)AnTrx: 0.046TGR 0. 04TMR 0. 035RGT 0. 024RMT 0. 0125無論將AnTrx融合在C端還是N端，融合蛋白中AnTrx部分的催化活性總是降低， RMT和RGT中AnTrx部分的催化活性分別是親本蛋白活性的27. 和52. 1%，TMR和TGR 中同一部分的催化活性分別是親本的76. 和87. 0%。顯然，處于融合白N端的AnTrx的 催化活性高于處于其C端的AnTrx的活性。(2)用DTNB還原法測定AnTrxR及其融合蛋白中的AnTrxR部分的活性以單獨(dú)表達(dá)的 AnTrxR 還原 DTNB (Sigma) (Arner et al. , 1999 ；Luthman &Holmgren, 1982)。反應(yīng)液為IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)，含2 μ M AnTrxR0DTNB的反應(yīng)濃 度變化范圍從0. 2 2mM。將反應(yīng)液和DTNB混合之后，加入終濃度為0. 05mM NADPH(Roche, Shanghai, china)啟動反應(yīng)。利用分光光度計測定其在412nm的吸收光值(OD412)變化。在 NADPH的存在下，Inmol的DTNB被AnTrxR還原成為2 μ mol的NTB。其酶活單位定義每分 鐘釋放2 μ moINTB定義為一個酶活單位(消光系數(shù)ε 412nm = 2X13. θπιΤαιΓ1)。結(jié)果分析表1 =AnTrxR和融合蛋白中的AnTrxR部分還原DTNB后的動力學(xué)常熟。 其中RMT和RGT中AnTrxR部分的催化效率比親本AnTrxR要高，而TMR和TGR中 AnTrxR的催化效率比親本AnTrxR要低。由于AnTrxR是整個體系第一步反應(yīng)中的關(guān)鍵酶， 而TMR和RMT中AnTrxR部分的催化效率過低，因此在后面考察對小麥醇溶蛋白的二硫鍵的 還原時直接考察親本(AnTrxR、AnTrx)、RMT和RGT。由此，得到的結(jié)論是兩個融合肽的總體效果相差不大，且當(dāng)AnTrxR融合在N端時 AnTrxR的催化效率大大提高。雖然融合蛋白RMT和RGT中的AnTrx部分的活性較親本略 低，但是由于其第一步反應(yīng)中的酶AnTrxR的催化效率的大幅度提高，其在NADPH的存在下 可以具備整個AnTrx體系的活性，并且在工業(yè)應(yīng)用上也更為簡便，便于其整個進(jìn)行后面的 工業(yè)應(yīng)用。
11、小麥醇溶蛋白的還原根據(jù)小麥蛋白的不同溶解性分離獲得麥醇溶蛋白。將小麥粉Ig溶于5mL70%酒精 之中，室溫下?lián)u蕩過夜后11，000乂8高速離心201^11。收集上清液，并在室溫下?lián)]發(fā)過夜后 冷凍干燥，獲得麥醇溶蛋白粉劑(Sim et al.2008)。不同AnTrx系統(tǒng)還原麥醇溶蛋白二硫鍵的活力測定，均采用100 μ L反應(yīng)體系，含 127. 5μ g麥醇溶蛋白和5μ L 6mM NADPH，酶的含量為獨(dú)立表達(dá)的AnTrx和AnTrxR各10 μ g 或融合表達(dá)的RGT 20 μ g或RMT 20 μ g，并設(shè)陰性對照(反應(yīng)體系中任何待測酶樣)和陽性 對照(反應(yīng)體系中加20 μ L 0. 05mM DTT，化學(xué)還原二硫鍵)。將各反應(yīng)液在室溫下孵育3h 后，利用巰基特異熒光分子探針(mBBr)與巰基結(jié)合后在熒光下顯色的原理(Buchanan et al. ,1997 ；del Val et al.，1999)，鑒定二硫鍵被還原的程度，方法是在20 μ L醇溶蛋白溶 液中加入8 μ L 30mM mBBr (Sigma)，室溫下黑暗放置20min，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳和熒光 顯色分析(結(jié)果見圖3)。圖3給出經(jīng)親本酶和融合酶處理后的麥醇溶蛋白被還原二硫鍵與mBBr結(jié)合后的 熒光顯色結(jié)果。左圖的泳道1 3 分別為純化后的AnTrxR/AnTrx、RMT, RGT加NADPH(不 含醇深蛋白)。泳道4:只有小麥醇溶蛋白(不含酶)，陰性對照。泳道5:用DTT還原小麥 醇溶蛋白的陽性對照。泳道6 8 分別為純化后的AnTrxR/AnTrx、RMT, RGT加NADPH和 醇溶蛋白。右圖泳道4 8與左圖相同，但考馬思亮藍(lán)R250染色。圖3所示結(jié)果表明麥 醇溶蛋白中富含的二硫鍵，在被DTT化學(xué)還原后，顯示出很強(qiáng)的亮度。在NADPH存在的情況 下，親本蛋白AnTrx/AnTrxR與融合蛋白RMT和RGT分別同麥醇溶蛋白孵育3h后，三者的顯 色強(qiáng)度差別并明顯，但均弱于上述陽性對照。由此說明，親本蛋白與融合蛋白RMT、RGT對麥 醇溶蛋白二硫鍵的還原程度相近。
權(quán)利要求
一種制備降低食物過敏原反應(yīng)的融合蛋白的方法，其特征在于它包括以下步驟硫氧還蛋白體系中硫氧還蛋白基因Trx和硫氧還蛋白還原酶基因TrxR的獲得，設(shè)計融和肽序列，利用融合肽序列將基因Trx和TrxR融合，然后獲得含有融合基因的重組菌株，最后進(jìn)行異源表達(dá)純化。
2.根據(jù)如權(quán)利要求1所述的一種制備降低食物過敏原反應(yīng)的融合蛋白的方法，其特征 在于所述硫氧還蛋白體系為黑曲霉硫氧還蛋白體系。
3.根據(jù)如權(quán)利要求1所述的一種制備降低食物過敏原反應(yīng)的融合蛋白的方法，其特征 在于所述融合基因表達(dá)后的融合蛋白N端的AnTrx的催化活性高于處于其C端的AnTrx的 活性。
4.根據(jù)如權(quán)利要求1所述的一種制備降低食物過敏原反應(yīng)的融合蛋白的方法，其特征 在于所述融合基因表達(dá)后的融合蛋白N端的AnTrxR的催化活性高于處于其C端的AnTrxR 的活性。
5.根據(jù)如權(quán)利要求1所述的一種制備降低食物過敏原反應(yīng)的融合蛋白的方法， 其特征在于所述融合肽序列為Link A和Link B，所述Link A為根據(jù)麻風(fēng)分枝桿菌 (Mycobacterium leprae)中的TrxR和Trx之間的22aa的天然連接肽基因序列設(shè)計的，所 述Link B為人工設(shè)計的柔性肽(GGGGS) 3。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備降低食物過敏原反應(yīng)的融合蛋白的方法，它包括以下步驟硫氧還蛋白體系中硫氧還蛋白基因Trx和硫氧還蛋白還原酶基因TrxR的獲得，設(shè)計融和肽序列，利用融合肽序列將基因Trx和TrxR融合，然后獲得含有融合基因的重組菌株，最后進(jìn)行異源表達(dá)純化。本發(fā)明將在工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用意義的AnTrx體系的兩個蛋白的基因克隆，并將二者的基因進(jìn)行融合改良，通過和食品中蛋白的孵育以還原食品蛋白中的二硫鍵，從而降低其過敏原反應(yīng)。同時，通過基因融合的改良使得An-TrxR和An-Trx在作為一種食品添加劑時，在食品工業(yè)應(yīng)用上得到簡便。
文檔編號C12N15/62GK101899460SQ201010113940
公開日2010年12月1日 申請日期2010年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月24日
發(fā)明者馮明光, 應(yīng)盛華, 王曉慧 申請人:浙江大學(xué)