專利名稱：人芳香化酶基因真核表達質(zhì)粒構建及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬醫(yī)學分子生物學領域，具體涉及一種表達人芳香化酶基因的 PCDNA3. 1 (+) -CYP19A1-GFP真核表達質(zhì)粒的構建及應用。
背景技術：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在西方國家，其發(fā)病率占女性惡性腫瘤的 第一位。近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率迅速上升，在許多大城市，其發(fā)病率已經(jīng)成為女性惡 性腫瘤的第一位。并且呈現(xiàn)出乳腺癌發(fā)病年齡早，就診時間晚的特點，這些患者正處于最佳 工作年齡狀態(tài)(即從30歲開始增加，在40-49歲為年齡高峰)。因此，乳腺癌發(fā)病率的增加 無疑對社會及家庭產(chǎn)生巨大影響。內(nèi)分泌治療是乳腺癌主要全身治療手段之一。三苯氧胺和第三代芳香化酶抑制劑 為乳腺癌內(nèi)分泌治療的主要藥物，在不同程度上改善了不同分期患者的預后，但仍有50% 以上患者經(jīng)過規(guī)范的術后輔助治療后發(fā)生復發(fā)和轉移，遠期復發(fā)和死亡風險仍為目前乳腺 癌治療面臨的一大挑戰(zhàn)。同時，內(nèi)分泌治療的長期應用帶來了不容忽視的毒副反應。因此， 尋找一種有效的內(nèi)分泌治療敏感性檢測手段更好地指導臨床內(nèi)分泌治療的真正個體化，進 一步提高內(nèi)分泌治療療效，改善患者預后，減少毒副反應，最終延長患者的總生存期，是目 前該領域研究的焦點。芳香化酶P450乃雄激素轉化為雌激素的限速酶和關鍵酶，把雄烯二酮、睪酮分別 轉化為雌酮、雌二醇。CYP19A1基因編碼芳香化酶蛋白，目前的研究表明，該基因存在多種單 核苷酸多態(tài)性，能使其編碼的芳香化酶蛋白結構和活性發(fā)生改變，可使芳香化酶活性降低、 失活、增高，間接地影響了雌激素水平，不僅與乳腺癌的易感性相關，而且與內(nèi)分泌治療的 療效可能相關。Hirose等在日本絕經(jīng)前婦女中發(fā)現(xiàn)CYP19A1編碼蛋白第39位氨基酸由色氨酸 (Trp)變成精氨酸(Arg)的變異，并指出第一次足月產(chǎn)遲和肥胖的變異體攜帶者絕經(jīng)前 發(fā)生乳腺癌的危險性明顯增加(OR分別是7. 31和2. 77 ；95% CI分別是1. 88 28. 5和 1. 12 6. 87)。而Nativelle-Serpentini等認為，Arg39等位基因與乳腺癌低危險性相關。關于該基因單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌內(nèi)分泌治療療效之間的關系亦有相關報道。 Cynthia等的體外研究發(fā)現(xiàn)，來曲唑?qū)?jīng)轉染CYP1939K_264G變異體的C0S-1細胞芳香化酶蛋 白活性的抑制作用比野生型明顯降低(P<0.05)。Colomer等在67例接受來曲唑治療的 絕經(jīng)后激素受體陽性晚期乳腺癌患者中的療效與CYP19基因3’-UTR SNPs的相關性研究中 發(fā)現(xiàn)，CYP19基因rs4646G1673A AC或者AA基因型攜帶者的TTP比CC基因型攜帶者明顯延長 (17. 2月比6. 4月；P = 0. 02)。Lopez-Guerrero等對86名接受新輔助內(nèi)分泌治療的絕經(jīng) 后乳腺癌患者的研究中，發(fā)現(xiàn)rs4646多態(tài)性可能與內(nèi)分泌治療的療效相關。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在54例接受TAM術后輔助治療的患者中，CYP19基因 rs4646CC基因型攜帶者的無瘤生存時間比AC基因型或A等位基因攜帶者明顯延長(P =0.018，0.01)；在24例接受第三代AIs治療的激素受體陽性晚期乳腺癌患者中，CC基因型 攜帶者至疾病進展時間比AC或AA基因型攜帶者也有延長趨勢。綜上，CYP19A1基因單核苷酸多態(tài)性可能與乳腺癌的易感性及內(nèi)分泌治療療效相 關。然而，目前，該基因單核苷酸多態(tài)性的確切生物學功能尚未明了。因此，我們成功構建 了一種P⑶NA3. 1 (+)-CYP19Al-GFP真核表達質(zhì)粒，用于進一步構建含有不同CYP19A1單核 苷酸多態(tài)性位點的真核表達質(zhì)粒，研究CYP19A1基因單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌易感性及內(nèi) 分泌治療敏感性之間的相關性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種表達人CYP19A1基因的真核表達質(zhì)粒，即是一種表達 人芳香化酶基因的P⑶NA3. 1 (+) -CYP19A1-GFP真核表達質(zhì)粒，所述的真核表達質(zhì)粒，全長 7. 6Kb，SEQ ID NO 1為人CYP19A1基因編碼區(qū)核苷酸序列，SEQ ID NO 2為GFP編碼區(qū)核 苷酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供所述的P⑶NA3. 1⑴-CYP19A1-GFP真核表達 質(zhì)粒的構建，通過以下步驟實現(xiàn)分段擴增CYP19A1基因片段通過T-A克隆連接到 pGEM-T Easy原核表達載體上，通過Not I酶切將CYP19A1基因連接到真核表達載 體 pcDNA3. 1 (+)上構建 pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (1563bp)質(zhì)粒；在 CYP19A1 終止密碼子 處通過定點突變引入BamH I酶切位點，將CYP19A1 (304bp)與pcDNA3. 1 (+) -GFP質(zhì) 粒相連接，構建pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (304bp) -GFP質(zhì)粒；通過Xhol I酶切連接構建 pcDNA3. 1 (+) -CYP19-GFP 真核表達質(zhì)粒(SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2)。本發(fā)明的再一個目的是在構建與乳腺癌易感性與內(nèi)分泌治療敏感性相關的含有 不同CYP19A1基因單核苷酸多態(tài)性位點的真核表達質(zhì)粒中的應用。本發(fā)明構建了一種P⑶NA3. 1 (+)-GFP真核表達質(zhì)粒，是一種能實時檢測活細胞內(nèi) 基因表達和蛋白亞細胞定位的新型報告基因，操作方便，性質(zhì)穩(wěn)定。該報告基因檢測不需底 物，可用熒光顯微鏡或熒光激活的細胞分類系統(tǒng)(FASC)直接進行檢測。在此基礎上，本發(fā) 明人進行了 P⑶NA3. 1 (+)-CYP19Al-GFP真核表達質(zhì)粒構建，完成了本發(fā)明?？捎脽晒怙@微 鏡或熒光激活的細胞分類系統(tǒng)(FASC)直接檢測哺乳動物細胞內(nèi)CYP19A1基因表達和芳香 化酶蛋白定位，且在加熱、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶作用下均能持續(xù)穩(wěn)定。本發(fā)明提供了 POTNA3. l(+)-CYP19Al-GFP真核表達質(zhì)粒，所插入的CYP19A1基 因片段長達1547bp，包含編碼區(qū)的全長核苷酸序列，共編碼503個氨基酸?？梢栽撡|(zhì)粒 作為模板，采用定點突變技術構建含有多個人CYP19A1單核苷酸多態(tài)性位點的真核表 達質(zhì)粒，操作簡便，避免了常規(guī)RT-PCR擴增長基因片段導致的堿基錯配，降低了實驗成 本，而且成功率較高。在此基礎上，我們已成功構建了人P⑶NA3. 1⑴-CYP19ff39E-GFP、 PCDNA3. 1 (+)-CYP19E264c-GFP 以及 PCDNA3. 1 (+)-CYPl-9ff39E_E264c-GFP 真核表達質(zhì)粒等，為深 入研究CYP19A1基因單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌易感性及內(nèi)分泌治療敏感性之間的相關性 奠定了基礎。本發(fā)明構建POTNA3. 1(+)_CYP19真核表達質(zhì)粒時，由于目的基因片段較長，Taq酶 保真度不夠，采用了分段克隆方法。此外，在構建提供的CYP19A1-GFP真核表達質(zhì)粒時應 用了定點突變技術，突變了 CYP19A1終止密碼子，并引入了一段BamHl酶切識別序列，通過BamHl酶切位點將CYP19A1基因與GFP基因巧妙連接。


圖 1 為 pGEM-T Easy-CYP19(1563bp)EcoR I 酶切鑒定示意 2 為 PCDNA3. 1 (+) -CYP19A1 BamH I 酶切鑒定示意 3 為 pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (1547bp)-GFP Hindlll 和 Clal 酶切鑒定示意圖。 圖4為CYP19 cDNA合成反應條件。
具體實施例方式本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步的說明。發(fā)明中所應用的PCDNA3. 1(+)質(zhì)粒以及大腸桿菌DH5 a均購自Invitrogen公司。 CYP19A1基因序列可在基因數(shù)據(jù)庫中檢索到，序列號NM_031226。實施例1PCDNA3. 1 (+) -CYP19A1真核表達質(zhì)粒構建(l)RNA 提取所使用器材均經(jīng)過RNase滅活處理。具體操作如下取液氮中儲存的胎盤組織至研缽研碎，置粉末于無菌EP管中，加lmlTRIzol，震 蕩混勻，室溫靜置15'，加0.2ml氯仿震蕩混勻，室溫靜置10分鐘，4°C 12000rpmX15' 離心，將上清移至另一無菌EP管中，若中間分層蛋白較多，加入0. 5ml水飽和酚和 0. lml氯仿震蕩混勻，4 °C 12000rpm離心30 〃，小心吸取上清，加0. 5ml異丙醇，混勻， 4°C 12000rpmX10'離心 RNA 沉淀，加 75% 乙醇 1ml，吹勻，4°C lOOOOrpmX 5min 離心，倒去 上液，重復兩次，管口敞開，室溫干燥RNA，加滅菌DEPC水20 ill。(2) RNA 檢測按標準方法測定稀釋后樣品在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定所提 取的RNA濃度和純度。①濃度測定A260為1的溶液含有RNA 40 u g/ml。樣品RNA濃度(y g/ml)計算公式為A26(1X 稀釋倍數(shù)X40iig/ml。②純度檢測RNA溶液的A26Q/A28Q比值在2. 0左右。(2) pGEM-T Easy-CYP19 (1563bp)質(zhì)粒構建PCR 引物根據(jù) Genebank 中 CYP19mRNA 序列(NM_031226)設計，上游引物 1 :5，-GA CTCTAAATTGCCCCCTCTGA-3，(SEQ ID NO 3)，下游引物 2 5，-TGACACTATTGGCAAGGATGGA-3，(S EQ ID NO 4)。以胎盤組織總RNA為模板，采用RT-PCR擴增1631bp大小CYP19基因片段， 0. 7%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收，T-A克隆連接到pGEM-T Easy載體上，連接產(chǎn)物轉化大腸 桿菌DH5 a，篩選重組質(zhì)粒，酶切鑒定，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)第51bp、第219bp、第1393bp、第1420bp 處產(chǎn)生錯配，考慮PCR產(chǎn)物太長，Taq酶保真度不夠，重新設計引物分段擴增，下游引物3 (自 917bp 起)5‘ -TCTTGTCAGGTCACCACGTTTC-3‘ (SEQ ID NO 5)；上游引物 4(自 1232bp 起) 5，-TGGAAGGATGCACAGACTCG-3，(SEQ ID NO 6)；下游引物 5 (自 1563bp 起):5，-TGACCAG CCTTCTCTAGTGTTCC-3，(SEQ ID NO :7)。引物3與引物1配對，引物4與引物5配對，分別擴增917bp、332bp大小目的基因片段。按上法分別構建pGEM-TEasy-CYP19 (917bp/332bp) 質(zhì)粒，經(jīng)測序驗證。用Xhol I內(nèi)切酶和Sal I內(nèi)切酶酶切pGEM-T Easy_CYP19 (1631bp) 質(zhì)粒和pGEM-T Easy-CYP19 (332bp)質(zhì)粒，回收4229bp、359bp基因片段連接，構建pGEM-T Easy-CYP19(1563bp)質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I內(nèi)切酶酶切鑒定。用BamH I和Sal I酶切pGEM-T Easy-CYP19(1563bp)質(zhì)粒和 pGEM-T Easy_CYP19 (917bp)質(zhì)粒，回收 945bp 和 3633bp 基因 片段連接，經(jīng)EcoR I內(nèi)切酶酶切鑒定(見圖1)。(3) PCDNA3. 1 (+) -CYP19A1 真核表達質(zhì)粒構建Not I 酶切 pGEM-T Easy_CYP19 (1563bp)質(zhì)粒和 pcDNA3. 1 (+)質(zhì)粒，切膠回收 1597bp、5428bp條帶連接，BamH I酶切鑒定(見圖2)，測序驗證。實施例2pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (304bp BamH I) -GFP 質(zhì)粒構建設計下游引物6 :5，-GGATCCGTGTTCCAGACACCTGT-3，(SEQ ID NO :8)。與上游引物 4 配對，擴增 304bp(BamH I)片段，同上法構建 pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (304bpBamH I)質(zhì)粒。用 BamH I 酶切 pcDNA3. 1 (+) -Easy-CYP19 (304bp BamH I)和 pcDNA3. 1 (+) -GFP 質(zhì)粒，0. 7%瓊 脂糖凝膠電泳，回收385bp和6154bp條帶連接，經(jīng)EcoR I、Xhol I酶切鑒定，測序驗證。實施例3pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (1547bp) -GFP 真核表達質(zhì)粒構建用Xhol I 酶切 pcDNA3. 1 ( + )-CYP19 (304bp BamH I) -GFP 禾口 pcDNA3. l(+)-CYP19(1563bp)質(zhì)粒，0. 7 % 瓊脂糖凝膠電泳，回收 1045bp、6677bp 條帶，連 接，構建？00嫩3.1(+)-〇丫卩19(1547匕口)-6卩？質(zhì)粒(5￡0 ID NO :1 禾口 SEQ ID NO :2)，經(jīng)Hindlll 和Clal酶切鑒定(見圖3)，測序驗證。實施例1、2、3中涉及的具體實驗操作條件如下
1. CYP19cDNA 合成
①RT體系與條件
總RNA5u 1
10uM01igo(dT) 186. 25u 1
滅菌DEPC水3. 75u 1
15u 1
混勻，70°C水浴5'，拿出迅速置冰上，依次加入
5*Buffer5u 1
25mMdNTPs2u 1
40U/ylRnase0. 625 u 1
200U/u 1M-MLV1 u 1
滅菌DEPC水1. 375 u 1
10 u 1
混勻，42 °C水浴60'，迅速拿出置冰上待用。
②PCR體系
10XPCR Buffer5u 1
25mM Mgcl25u 1
25mM dNTPs0. 4u 1
10 li M Primer up1. 5 li 110 li M Primer down 1. 5 li 1cDNA5 u 15U/iUTaq 酶0. 5 u 1ddH2030. 1 u 1_50 U 1③反應條件參見圖42. 0.7%瓊脂糖凝膠電泳0. 35g瓊脂糖加1XTAE溶液50ml，微波助溶，冷卻至60°C，加EB2. 5iU混勻，鋪 膠，待膠凝固，PCR產(chǎn)物50 u 1加加樣緩沖液5. 5 u 1，混勻，加樣，以10 y 11Kb plus作DNA 分子量標準，電壓為80伏電泳。3.切膠回收紫外透射光下觀察，切膠回收，放入1.5ml離心管(預先稱重)內(nèi)稱重，并計算 膠凈重，加3倍膠(重)體積QG(QIAGEN)，50°C水浴，每3分鐘顛倒混勻至全溶，加至柱 子中，13000rpmXl'離心，倒去液體，加0. 5ml QG過柱，13000rpmX 1 ‘離心，棄液體，加 0. 75mlPE至柱子中，室溫靜置5' ； 13000rpmXl'離心，棄液體，13000rpmX 1 ‘離心，將柱 子放入1.5ml離心管中，開蓋10'，待酒精揮發(fā)殆盡；柱子中加入30 yl ddH20(70°C水浴預 熱)，室溫靜置5' ；13000X1'離心，取7 ill回收產(chǎn)物作連接，余-20°C保存?！?1M 氯化鈣溶液(100ml)11. 2克無水氯化鈣加80ml 18M Q H20充分溶解，定容至100ml，高壓滅菌，待冷卻， 4°C冰箱備用(用時稀釋10倍)。▲感受態(tài)細菌制備從近期接種培養(yǎng)后4°C保存的大腸桿菌(DH5 a )菌板上挑取單個菌落，接種于7ml 無抗生素LB培養(yǎng)液中，37°C 300rpm搖菌過夜。取50 yl轉接至5ml無抗生素LB培養(yǎng)液 中，37°C 300rpm培養(yǎng)2hr，0D600約為0. 2-0. 5。拿出至冰上，使其冷卻至0°C，取lml 1M氯 化鈣溶液用ddH20稀釋至10ml，冰浴。取1. 5毫升菌液至無菌離心管中，4°C 5000rpmX5' 離心。倒去培養(yǎng)液，倒置至培養(yǎng)液痕量流盡，加lml冰預冷的0. 1M氯化鈣溶液重懸細菌沉 淀。4°C 5000rpmX10'離心，倒去培養(yǎng)液，倒置至培養(yǎng)液痕量流盡，加lml預冷的0. 1M氯 化鈣溶液重懸細菌，冰浴30'。4°C 5000rpm X5'離心，倒去培養(yǎng)液，倒置至培養(yǎng)液痕量流 盡，加入50iil0. 1M氯化鈣溶液重懸細菌，即為感受態(tài)?！D化反應及平板篩選將10 ill連接產(chǎn)物加入上述感受態(tài)細菌中，冰浴30'，42°C水浴1'熱休克后，快 速放入冰浴2'。加入500 ill無抗生素LB培養(yǎng)液，37°C水浴30'，加入20% IPTG 7 yl和 2% Xgal 40 iil，涂平板，放置37°C培養(yǎng)箱，待干后倒置，37°C培養(yǎng)過夜。5.質(zhì)粒提取▲常用試劑裂解液溶液I (100ml)葡萄糖50mMTris-Cl(pH 8. 0)25mMEDTA (pH 8. 0)lOmM用80ml 18MQH20 溶解 0.99085g 葡萄糖，加入 2.5ml lMTris-Cl (pH8. 0)及 2ml 0. 5MEDTA(pH 8. 0)，定溶至100ml，高壓蒸汽滅菌，冷卻，4°C保存。溶液II (50ml) 0. 2M NaOH(從10M儲存液中現(xiàn)用稀釋)1% (m/v) SDS現(xiàn)用配置，用40mll8MQH20溶解0. 5gSDS和lml 10M NaOH，定容至50ml，室溫下使用。溶液III (50ml): 5M 醋酸鉀 30ml冰醋酸5.75mlddH2014.25ml用30ml ddH20溶解14. 721g醋酸鉀，加入冰醋酸5. 75ml，定容至50ml，4°C保存▲
擴大培養(yǎng)用無菌牙簽挑取單個菌落(白色)于7ml含100 y g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液 中，37°C 300rpm搖菌培養(yǎng)過夜?！|(zhì)粒提取將過夜培養(yǎng)菌液轉入7ml離心管中，4°C 5000rpmX5'離心沉淀細菌。棄培 養(yǎng)液，加入200 yl冰預冷的溶液I，充分振蕩懸浮細菌，加入400 yl新配制的溶液II，
8輕輕傾斜混勻，冰浴5'。加入300 ill冰預冷的溶液III，輕輕傾斜混勻，冰浴5'。 4°C 12000rpmX10'離心，小心吸取上清至1. 5ml無菌離心管中，加入0. 6倍體積異丙醇，混 勻，室溫放置20'。4°C 12000rpmX10'離心，小心倒去液體，75%乙醇洗滌一次。室溫干 燥，加入適量TER溶液(含2 ii g/ml RNA酶)，37°C水浴30 ‘，取2 yl質(zhì)粒酶切，余-20°C保存。
PCDNA3
6.質(zhì)粒酶切 酶切體系及條件
質(zhì)粒DNA 內(nèi)切酶 Buffer ddH20
2u 1 1 u 1 2u 1 15u 1
20 u 1
37°C 酶切 2hr
實施例 4PCDNA3. 1 (+)-CYP19W39K-GFP、PCDNA3. 1 (+)-CYP19K264c-GFP 以及 1 (+) -CYPl-9W39K_K264e-GFP 真核表達質(zhì)粒構建 以P⑶NA3. 1 (+) -CYP19-GFP質(zhì)粒為模板，利用突變位點兩側的Hindlll和Clal位 點，在酶切位點和突變位點處分別設計PCR引物，運用PCR拼接酶切連接的方法進行突變， 具體操作由上海英駿公司完成。
10) 11)
14)
15)
1.PCR引物設計
CYP19ff39E 引物
CYP-HindIII 5' -TTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCT-3‘ (SEQ ID NO 9) CYP-WR-R 5 ‘ -GAGGATGTGCCCTCATAATTCCGCACCAAGAGAAAAAGGC-3 ‘ (SEQ IDN0
CYP-WR-F 5 ‘ -CACTGGCCTTTTTCTCTTGGTGCGGAATTATGAGGGCACA-3 ‘ (SEQ IDN0
CYP-Clal 5' -GGGTAGCCATCGATTACATCATC-3‘ (SEQ ID NO 12)
CYP19
E264C
引物
CYP-HindIII 5' -TTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCT-3‘ (SEQ ID NO 13) CYP-RC-R 5 ‘ -TCTCTTCTGTGGAAATCCTGCATCTTTTTTCTGCTATCAG-3
CYP-RC-F 5 ‘ -GTTCTGATAGCAGAAAAAAGATGCAGGATTTCCACAGAAG-3
(SEQ ID NO 16)
(SEQ IDNO (SEQ IDNO
CYP-Clal 5' -GGGTAGCCATCGATTACATCATC-3‘ 2. PCR擴增及拼接1)以 PCDNA3. 1 (+) -CYP19-GFP 為模板，分別以 CYP-Hindlll/CYP-WR-R，CYP-ffR-F/ CYP-Clal, CYP-HindIII/CYP-RC-R, CYP-RC-F/CYP-Clal 引物進行擴增 循環(huán)體系如下 2)回收PCR產(chǎn)物。3)PCR 拼接以 CYP-HindlII/CYP-ffR-R 擴增產(chǎn)物和 CYP-WR-F/CYP-Clal 擴增產(chǎn)物為模板， 用CYP-HindlII和CYP-Cla引物進行PCR拼接；以CYP-HindIII/CYP-RC-R擴增產(chǎn)物和 CYP-RC-F/CYP-Clal擴增產(chǎn)物為模板，用CYP-Hindlll和CYP-Cla引物進行PCR拼接。PCR 體系 循環(huán)體系如下 4)回收PCR拼接產(chǎn)物。3. PCR產(chǎn)物與酶切質(zhì)粒連接并克隆PCR拼接產(chǎn)物與PCDNA3. 1 (+) -CYP19-GFP同時用Hindlll和Clal酶切，并回收連接。2)將酶切PCR產(chǎn)物與載體進行連接，室溫2小時以上。連接體系 3)取5 ill連接反應液轉化100 u 1 DH5a感受態(tài)細胞。3.從平板挑取單克隆培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。4.測序驗證突變。測序引物正向T7 :TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGCYP-S :ATGAGAGCATGCGGTACCAG反向TB-S CGAGTCTGTGCATCCTTCCABGH TAGAAGGCACAGTCGAGG5.以突變好的 WR 質(zhì)粒為模板,用 CYP-HindIII/CYP-RC-R，CYP-RC-F/CYP-Clal 引 物擴增，并拼接。方法及過程同上。6.測序驗證WR-RC雙突變質(zhì)粒。本發(fā)明涉及的序列。
權利要求
一種表達人芳香化酶基因的PCDNA3.1(+) CYP19A1 GFP真核表達質(zhì)粒，全長7.6Kb，其特征在于，具有SEQ ID NO1的人CYP19A1基因編碼區(qū)核苷酸序列和SEQ ID NO2的GFP編碼區(qū)核苷酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的真核表達質(zhì)粒，其特征在于，通過以下步驟構建分段擴增 CYP19A1基因片段通過T-A克隆連接到pGEM-T Easy原核表達載體上，通過Not I酶切將 CYP19A1基因連接到真核表達載體pcDNA3. 1 (+)上構建1563bp的pcDNA3. 1 (+) -CYP19質(zhì) 粒；在CYP19A1終止密碼子處通過定點突變引入BamH I酶切位點，將CYP19A1 (304bp)與 pcDNA3. 1 (+) -GFP 質(zhì)粒相連接，構建 pcDNA3. 1 (+) -CYP19 (304bp) -GFP 質(zhì)粒，通過 Xhol I 酶 切連接構建pcDNA3. 1 (+) -CYP19-GFP真核表達質(zhì)粒。
3.根據(jù)權利要求1所述的真核表達質(zhì)粒在構建與乳腺癌易感性與內(nèi)分泌治療敏感性 相關的含有不同CYP19A1基因單核苷酸多態(tài)性位點的真核表達質(zhì)粒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種表達人CYP19A1基因的真核表達質(zhì)粒，全長7.6Kb，具有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的核苷酸序列。通過分段擴增CYP19A1基因片段通過T-A克隆連接到pGEM-T Easy原核表達載體上，所插入的CYP19A1基因片段長達1547bp，包含編碼區(qū)的全長核苷酸序列，共編碼503個氨基酸。是一種能實時檢測活細胞內(nèi)基因表達和蛋白亞細胞定位的新型報告基因，操作方便，在加熱、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶作用下均能持續(xù)穩(wěn)定。可在構建與乳腺癌易感性與內(nèi)分泌治療敏感性相關的含有不同CYP19A1基因單核苷酸多態(tài)性位點的真核表達質(zhì)粒中的應用。
文檔編號C12N15/85GK101921806SQ201010114639
公開日2010年12月22日 申請日期2010年2月26日 優(yōu)先權日2010年2月26日
發(fā)明者王曉稼, 邵喜英, 陳占紅 申請人:浙江省腫瘤醫(yī)院