專(zhuān)利名稱(chēng)：一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)冠心病(coronary artery disease, CAD)易感性的方法，具體說(shuō)是通過(guò)測(cè)定人二甲基精氨酸二甲胺水解酶I(DDAHl)基因多態(tài)性位點(diǎn)-396D/I來(lái)預(yù)測(cè)人群對(duì)于冠心病的易感性，該方法可以用于疾病的輔助診斷、治療、和新藥研發(fā)，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)和基因診斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，冠心病在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率呈迅速上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為我國(guó)居民死因構(gòu)成中上升最快并威脅我國(guó)公眾健康的重要疾病。傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素如高血壓，糖尿病，超重與肥胖，吸煙與飲酒，高脂血癥等能致動(dòng)脈粥樣硬化，但很多冠心病患者并無(wú)上述危險(xiǎn)因素存在或者在上述危險(xiǎn)因素控制較好的情況下仍然有心血管事件發(fā)生，這表明遺傳因素和 (或)環(huán)境因素可能參與了心血管事件的發(fā)生。從事心血管領(lǐng)域的研究人員都熟知血管壁內(nèi)皮功能紊亂引起動(dòng)脈粥樣硬化 (atherosclerosis, AS)是多種心腦血管疾病病理生理基礎(chǔ)，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS )催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化成一氧化氮(nitric oxide, N0)，是內(nèi)皮細(xì)胞合成的一種重要的血管活性因子，具有舒張血管、抑制血小板聚集、抑制單核細(xì)胞粘附、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、減少氧自由基產(chǎn)生及抑制低密度脂蛋白氧化等多種生理效應(yīng)。ADMA能與L-精氨酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合一氧化氮合酶(N0Q，抑制其活性，減少一氧化氮(NO)合成，降低NO的生理效應(yīng)。ADMA代謝可通過(guò)二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethyIarginine dimethylaminohydrolase, DDAH)水解。DDAH 分兩型DDAH1 和 DDAH2。DDAHl 主要分布于 nNOS表達(dá)占優(yōu)勢(shì)的組織中，據(jù)推測(cè)在許多組織中DDAHl是調(diào)節(jié)血漿ADMA濃度的關(guān)鍵酶，如果其功能受損導(dǎo)致ADMA聚集，NO產(chǎn)生減少，會(huì)引起血管內(nèi)皮受損，體循環(huán)血管阻力增加，肺動(dòng)脈高壓等多種病理狀態(tài)的發(fā)生，增加心腦血管事件發(fā)生的危險(xiǎn)性。DDAHl具有重要的生物學(xué)效應(yīng)，其基因的遺傳變異會(huì)影響DDAHl的表達(dá)，結(jié)構(gòu)和功能改變，使個(gè)體對(duì)心腦血管疾病如冠心病的易感性發(fā)生改變。其中位于DDAHl基因啟動(dòng)子區(qū)-396位四個(gè)核苷酸(GCGT)插入的I/I基因型和沒(méi)有四核苷酸插入的D/D基因型對(duì)該基因轉(zhuǎn)錄有很大的差別，從而能對(duì)冠心病的易感性產(chǎn)生不同的影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們首次發(fā)現(xiàn)并證明我國(guó)漢族人在冠心病形成組中的I/I基因型頻率較正常人高，對(duì)冠心病有致病效應(yīng)，在校正多重心腦血管危險(xiǎn)因子后，DDAHl I/I基因型是冠心病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前進(jìn)行冠心病的遺傳病因研究中，一般采用單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為基因組標(biāo)志的關(guān)聯(lián)分析方法是有效的，但傳統(tǒng)的PCR-酶切分析SNP的方法存在時(shí)間長(zhǎng)、可重復(fù)性差、靈敏度低、準(zhǔn)確率低等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種Taqman探針?lè)ㄟM(jìn)行基因分型，通過(guò)非條件logistic回歸模型來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法，該方法通過(guò)提取人的外周血白細(xì)胞基因組DNA，測(cè)定受試者的DDAHl基因-396位點(diǎn)的基因型，通過(guò)非條件logistic回歸模型來(lái)預(yù)測(cè)受試者對(duì)冠心病的易感性。具體步驟1.提取人外周血白細(xì)胞的基因組DNA ;2.對(duì)于受試者個(gè)體中DDAHl基因多態(tài)性位點(diǎn)-396D/I，即序列表SEQ ID 1所示，通過(guò)序列表SEQ ID 2和3所示的F和R寡核苷酸引物序列，特異性地從上述DNA中擴(kuò)增出來(lái)，并通過(guò)序列表SEQ ID 4和 5所示的Taqman探針堿基序列來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)DDAHl基因-396位點(diǎn)不同的基因型的檢測(cè)；3.將受試者個(gè)體的DDAHl基因-396位點(diǎn)的1/1，D/I和D/D基因型引入非條件Logistic回歸分析模型中來(lái)預(yù)測(cè)冠心病的發(fā)病易感性。本發(fā)明證明，受試者攜帶DDAHl的-396I/I基因型時(shí)，冠心病易感性升高，對(duì)冠心病有致病作用。一組預(yù)測(cè)冠心病易感性的引物和探針序列(寡核苷酸序列)，能特異性的擴(kuò)增出 DDAHl基因的-396位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，具有序列表SEQ ID 1所示的堿基序列，其中序列表SEQ ID 2和3所示的堿基序列分別為F引物序列和R引物序列；序列表SEQ ID 4和5所示為 Taqman探針混合物，以上寡核苷酸序列在一次檢測(cè)中同時(shí)使用。一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的試劑盒，由以下試劑組成400 μ 1 2XMaster Mix 緩沖液，600μ 1 超純水，各2μ 1 100 μ M/L 的探針混合物， 各9 μ 1100 μ M/L的F和R引物混合物，F(xiàn)和R引物是序列表SEQ ID 2和3所示的堿基序列；taqman探針混合物是序列表SEQ ID 4和5所示的堿基序列及修飾基團(tuán)；試劑盒的保存溫度為-20度。所述的iTaqman 探針序列 5，端用 FAM(6-carboxyfluorescein)或 ΗΕΧ0，7，2'， 4'，5'，7' -hexachloro-6-carboxyfluorescein)熒光染料修飾，3，用 BHQl (Black HoleQuencher 1)淬滅基團(tuán)修飾。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)首次闡明了 DDAHl基因多態(tài)性位點(diǎn)和冠心病易感性的關(guān)聯(lián)，提供了一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法，該方法可用于冠心病的預(yù)防/輔助診斷和治療， 還可以用于新藥研發(fā)。本發(fā)明所采用Taqman探針技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)，通過(guò)不同堿基組成的探針Tm值差異，利用探針特異性結(jié)合于多態(tài)性位點(diǎn)不同的基因型，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同基因型的檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定，省時(shí)省力，靈敏度和特異度高。


圖1為基因分型檢測(cè)結(jié)果三種不同基因型在坐標(biāo)軸中位于不同的位置，其中沿圖y軸分布為型I/I純合子，沿圖X軸分布為D/D型純合子，位于中間分布為D/I型雜合子。下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并非對(duì)發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本公開(kāi)內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備檢測(cè)冠心病易感性的試劑盒一、試劑盒成分檢測(cè)冠心病易感性的試劑盒，包含有可擴(kuò)增出DDAHl基因-396D/I啟動(dòng)子區(qū)的基因型的引物對(duì)，及其Taqman探針，成分和含量如下，于_20度保存表1 :PCR擴(kuò)增試劑QOO人份)
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法，具體步驟是a.提取人外周血白細(xì)胞的基因組DNA；b.對(duì)于受試者個(gè)體中DDAHl基因多態(tài)性位點(diǎn)-396D/I，即序列表SEQ ID 1所示，通過(guò)序列表SEQ ID 2和3所示的F和R寡核苷酸引物序列，特異性地從上述DNA中擴(kuò)增出來(lái)， 并通過(guò)序列表SEQ ID 4和5所示的Taqman探針堿基序列來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)DDAHl基因-396位點(diǎn)不同的基因型的檢測(cè)；c.將受試者個(gè)體的DDAHl基因-396位點(diǎn)的I/I，D/I和D/D基因型引入非條件 Logistic回歸分析模型中來(lái)預(yù)測(cè)冠心病的發(fā)病易感性。
2.一種用于制備測(cè)定權(quán)利要求1預(yù)測(cè)冠心病易感性方法的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成400μ1 2 X Master Mix緩沖液，600 μ 1超純水，各2 μ 1 100 μ M/L的探針混合物，各9 μ 1100 μ M/L的F和R引物混合物，F(xiàn)和R引物是序列表SEQ ID 2和3所示的堿基序列；Taqman探針混合物是序列表SEQ ID 4和5所示的堿基序列及修飾基團(tuán)；試劑盒的保存溫度為-20度。
全文摘要
本發(fā)明提供一種預(yù)測(cè)冠心病易感性的方法及其試劑盒，該方法具體步驟1.提取人外周血白細(xì)胞的基因組DNA；2.對(duì)于受試者個(gè)體中DDAH1基因多態(tài)性位點(diǎn)-396D/I，即序列表SEQ ID 1所示，通過(guò)序列表SEQ ID 2和3所示的F和R寡核苷酸引物序列，特異性地從上述DNA中擴(kuò)增出來(lái)，并通過(guò)序列表SEQ ID 4和5所示的Taqman探針堿基序列來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)DDAH1基因-396位點(diǎn)不同的基因型的檢測(cè)；3.將受試者個(gè)體的DDAH1基因-396位點(diǎn)的I/I，D/I和D/D基因型引入非條件Logistic回歸分析模型中來(lái)預(yù)測(cè)冠心病的發(fā)病易感性。本發(fā)明利用探針特異性結(jié)合于多態(tài)性位點(diǎn)不同的基因型，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同基因型的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154445SQ201010114268
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者丁虎, 吳斌, 汪道文 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院