纖維變性易感性IL22RA2基因及其用途的制作方法

文檔序號：11193108閱讀：414來源：國知局

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本申請是國際申請日2012年8月3日、國際申請?zhí)杙ct/ep2012/065222于2014年3月27日進入中國國家階段、申請?zhí)?01280047401.1、發(fā)明名稱“纖維變性易感性il22ra2基因及其用途”的申請的分案申請。

本發(fā)明總的來說涉及遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明公開了人類易感性基因的鑒定，所述基因可用于對組織中可能引起纖維變性的細胞外基質(zhì)蛋白(ecmp)的異常沉積進行診斷或預(yù)后，或用于檢測在肝臟疾病、肝硬化、皮膚瘢痕瘤、肥胖癥和任何纖維變性疾病以及在其他組織例如心、血管或腦的疾病中發(fā)生的這種異常ecmp沉積或纖維變性的易感性。更具體來說，本發(fā)明公開了6號染色體上il22ra2基因的某些等位基因，其與纖維變性的易感性相關(guān)并代表了用于篩選治療活性藥物的新靶點。更具體來說，本發(fā)明涉及il22ra2基因和表達產(chǎn)物中的特定突變，以及基于這些突變的診斷工具和試劑盒。

背景技術(shù)：

組織中細胞外基質(zhì)蛋白的積累可能具有有害效應(yīng)。組織中ecmp的異常沉積可能引起組織纖維變性。

纖維變性是器官、其任何部分或組織中，例如肝臟、其任何部分或組織中纖維狀結(jié)締組織的過度生長，特別是對損傷做出響應(yīng)的過度生長。

異常纖維變性發(fā)生在各種病因的慢性肝臟炎癥中，例如在肝炎病毒和血吸蟲感染中。以前顯示，被血吸蟲感染的某些對象是慢性纖維變性患者，而其他對象是快速纖維變性患者，并且這部分取決于位于chr6q22-q23上的主要基因(dessein等，1999；mohamed-ali等，1999)。國際專利申請wo2010/094740將ctgf(ccn2)鑒定為該區(qū)域中的纖維變性易感性基因。

血吸蟲病由在宿主的血管系統(tǒng)中發(fā)育并產(chǎn)卵的蠕蟲引起，某些卵被運載到肝臟，在那里它們在門靜脈周圍間隙中引發(fā)炎癥。由于蠕蟲在它們的人類宿主中生活多年，因此在受感染對象中伴有大量組織破壞的慢性肝炎是常見的。組織修復(fù)需要在受損組織中沉積ecmp，其在隨后被更新并被正常肝細胞替代。在某些患者中ecmp積累在門靜脈周圍間隙中，形成纖維變性沉積物，其減少血液流動，造成靜脈曲張、腹水。在慢性或重復(fù)損傷數(shù)月或數(shù)年后，纖維變性變得永久且不可逆。對象死于纖維變性的結(jié)果。

在南方國家，據(jù)估計3億5千萬受感染對象中的5至10％可能發(fā)生嚴(yán)重肝纖維變性。沒有良好的標(biāo)志物允許在血吸蟲感染的對象中預(yù)測并追蹤肝纖維變性的進展。

肝纖維變性的診斷大多數(shù)基于肝臟活檢、彈性測量法和超聲分析。

取決于臨床情況，活檢樣品通過經(jīng)皮、經(jīng)頸靜脈的放射照相引導(dǎo)的細針或腹腔鏡途徑來獲得。組織病理學(xué)檢查能夠使臨床醫(yī)生對炎癥壞死的嚴(yán)重性分級并對纖維變性的程度分期。metavir評分系統(tǒng)使用如下所述的1-4的量表為纖維變性的階段指派分值：f0＝無纖維變性，f1＝門靜脈纖維變性而沒有隔膜，f2＝門靜脈纖維變性和少數(shù)隔膜，f3＝大量隔膜而沒有肝硬化，f4＝肝硬化(bedossa等，1996)。肝臟活檢是侵入性和昂貴的程序，并且僅對肝臟的少部分取樣。因此，它不能提供肝纖維變性的全面評估，并且易受取樣變差和觀察者間和觀察者內(nèi)誤差的影響。此外，肝臟活檢伴有3％的顯著發(fā)病率和0.03％的死亡率。潛在的并發(fā)癥包括與活檢相關(guān)的局部血腫、感染和疼痛。

非侵入性測試(即血清學(xué)標(biāo)志物、彈性測量法、超聲分析)也被使用，但是尚未準(zhǔn)備好用于常規(guī)臨床使用。

血液標(biāo)志物評估組已被測試，主要是在患有慢性丙型肝炎或由病毒性丙型肝炎造成的肝硬化的患者中。這些研究揭示，血清標(biāo)志物可以在約35％的患者中判斷出或排除纖維變性(sebastiani等，2006)。然而，當(dāng)單個地看待患者時，這些標(biāo)志物不能可靠地區(qū)分纖維變性的各個階段。更近的研究合并了三個血清標(biāo)志物評估組來設(shè)計提高診斷準(zhǔn)確性的算法(parkes等，2006)。所評估的3個評估組是apri(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與血小板比率指數(shù))、forns指數(shù)(血小板、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶、膽固醇)和fibrotest(ggt、結(jié)合珠蛋白、膽紅素、載脂蛋白a、α-2-巨球蛋白)。由apri和隨后的fibrotest構(gòu)成的算法將纖維變性的診斷準(zhǔn)確性提高到高于90％。該研究組估計，使用這種算法能夠避免高達50％的肝臟活檢需要。然而，使用這種算法不能辨別纖維變性的各個階段。這些血清標(biāo)志物的限制是當(dāng)存在高活性肝臟炎癥時假陽性的可能性。

fibroscan是對肝纖維變性進行分期的另一種方法，其基于為肝組織平均剛度提供快速測量的彈性成像術(shù)(ziol等，2005)。使用探針將低頻低振幅的振動傳送到肝臟中。這種振動波觸發(fā)彈性剪切波，其通過肝臟的速度與以千帕(kpa)為單位度量的組織剛度成正比。與肝臟活檢相比，fibroscan技術(shù)的靈敏度在79至95％的范圍內(nèi)，特異性在78至95％的范圍內(nèi)。然而，這種技術(shù)的限制與彈性波在流體或脂肪組織中的衰減相關(guān)，所述衰減損害患者中纖維變性的評估。此外，fibroscan是極為昂貴的儀器。

對于從肝臟根除hcv來說，目前的護理標(biāo)準(zhǔn)(soc)由peg化的i型干擾素(pegifn)和合成核苷利巴韋林(rbv)療法構(gòu)成(friedmw等，nengljmed.2002；347(13):975-82；“easl臨床實踐指南：丙肝病毒感染的管理”(easlclinicalpracticeguideline:managementofhepatitiscvirusinfection,jhepatol)，2011；55:245-264)。然而，這種標(biāo)準(zhǔn)療法具有有限和不可預(yù)測的效能、常常導(dǎo)致治療中斷的廣泛的毒性分布情況，并且非常昂貴。少于一半的基因型1和4的慢性hcv感染個體對標(biāo)準(zhǔn)療法(pegifn/rbv)的長期治療(48周)有響應(yīng)(testinog等，hepatogastroenterology2011；58(106):536-8)。

因此，為了優(yōu)化治療、避免對非響應(yīng)者的副作用和降低治療費用，對選擇具有更好的機會對治療做出響應(yīng)的患者的方法，存在著需求。

總而言之，對于預(yù)測纖維變性的進展和治療效率的有效方法，仍存在需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明的目的是提供用于纖維變性預(yù)后和治療的新的遺傳學(xué)方法。現(xiàn)在，本發(fā)明公開了另一個人類纖維變性易感性基因座il22ra2基因座的鑒定，所述基因座可用于異常ecmp沉積、特別是纖維變性、尤其是肝纖維變性的易感性檢測、診斷和預(yù)后，以及用于治療活性藥物的篩選。具體來說，本發(fā)明涉及一種方法，所述方法包括檢測來自于所述對象的樣品中il22ra2基因座的變化的存在，所述變化的存在是異常ecmp沉積或纖維變性的存在或易感性的指示。

本發(fā)明的具體目的在于對象中發(fā)生異常ecmp沉積或纖維變性的易感性檢測或診斷和/或預(yù)后的體外方法，所述方法包括檢測來自于所述對象的樣品中il22ra2基因或多肽的變化的存在，所述變化的存在是異常ecmp沉積或纖維變性的存在的指示、或?qū)Ξ惓cmp沉積或纖維變性的易感性的指示。本發(fā)明的具體目的在于用于評估(預(yù)測)異常ecmp沉積或纖維變性的進展的方法。

在優(yōu)選實施方式中，所述變化位于il22ra2基因的起始密碼子上游的500kb之內(nèi)，優(yōu)選地100kb之內(nèi)，優(yōu)選地20kb之內(nèi)，并位于il22ra2基因的3’utr下游的500kb之內(nèi)，優(yōu)選地100kb之內(nèi)，優(yōu)選地20kb之內(nèi)。優(yōu)選地，所述變化位于il22ra2基因的起始密碼子上游10kb區(qū)域和非翻譯區(qū)(3’utr)下游10kb區(qū)域的周圍序列中。

在另一個優(yōu)選實施方式中，所述變化是一個或多個堿基的突變、插入或缺失。在更優(yōu)選的實施方式中，所述變化是與纖維變性相關(guān)的一個或數(shù)個單核苷酸多態(tài)性snp或snp的單倍體型。優(yōu)選地，所述單核苷酸多態(tài)性是il22ra2基因側(cè)翼的snp，其是位置接近il22ra2基因的等位基因變體。

本發(fā)明的方法允許對人類纖維變性疾病中發(fā)生的纖維變性進行檢測和預(yù)后，所述纖維變性疾病選自肝臟疾病纖維變性、肝硬化、皮膚瘢痕瘤、增生性瘢痕和肥胖癥、酗酒或藥物性肝中毒。特別是，所述肝纖維變性可能由甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒(hcv)、日本血吸蟲(s.japonicum)或曼森氏血吸蟲(s.mansoni)感染引起。

在特定實施方式中，所述方法包括對對象、優(yōu)選地被肝炎病毒或寄生蟲感染的對象的生物樣品中il22ra2基因座中的snp進行基因分型，其中在snprs6570136中存在基因型gg，在snprs7774663中存在基因型tt，在snprs11154915中存在基因型tt、ct和/或在snprs2064501中存在基因型cc，指示了在所述對象中發(fā)生異常ecmp沉積例如纖維變性的風(fēng)險，或指示了異常ecmp沉積例如纖維變性的發(fā)生，或指示了纖維變性的不良預(yù)后。所述纖維變性更具體地是肝纖維變性。

或者，所述方法可以包括對與本文中提到的snp處于連鎖不平衡(ld)中的任何snp進行基因分型。

優(yōu)選地，所述il22ra2基因座中的變化，通過進行選擇性雜交測定法、測序測定法、微量測序測定法和/或等位基因特異性擴增測定法來確定。

在本發(fā)明的另一方面，il22ra2基因中的所述變化通過限制性酶消化來確定，檢測到至少一個所述snp是纖維變性的指示。

本發(fā)明還涉及用于為患有異常ecmp沉積例如纖維變性或?qū)Πl(fā)生異常ecmp沉積例如纖維變性易感的對象選擇治療性化合物的方法，所述方法包括將測試化合物與il22ra2多肽或基因或其片段相接觸，并確定所述測試化合物提高或降低與il22ra2基因相關(guān)的途徑的生物活性或功能的能力。

本發(fā)明的另一個主題是一種用于確定患有病毒感染的患者對使用抗病毒劑和/或干擾素的治療做出響應(yīng)的可能性的體外方法，所述方法包括確定所述患者的生物樣品中il22ra2基因座中、或il22ra2蛋白表達或活性中的變化。

在特定實施方式中，所述方法包括對對象的生物樣品中il22ra2基因座中的snp進行基因分型，其中對于snprs11154915來說tt基因型、對于snprs6570136來說ag或gg基因型、對于snprs2064501來說ct基因型和/或?qū)τ趕nprs1543509來說aa基因型的存在，有利于患者對所述治療的陽性響應(yīng)?；蛘?，所述方法可以包括對與本文中提到的snp處于連鎖不平衡(ld)中的任何snp進行基因分型。

在特定實施方式中，所述治療包含抗病毒劑，并任選地連同干擾素。

優(yōu)選地，所述抗病毒劑是病毒復(fù)制的抑制劑，例如利巴韋林。

圖例說明

圖1a和1b示出了來自于日本血吸蟲流行區(qū)對象的pmbc的培養(yǎng)物中的il-22和l-17水平。在來自于19個對照和70個流行區(qū)對象的經(jīng)過144小時靜置的培養(yǎng)物和被卵刺激的培養(yǎng)物中獲得數(shù)據(jù)。圖1c示出了來自于流行區(qū)對象血液的il22+細胞的facs分析。數(shù)據(jù)來自于20個實驗中的一個代表性實驗。

圖2a示出了pbmc培養(yǎng)物中的il-22水平隨過去10年內(nèi)抗血吸蟲病治療的次數(shù)而變。研究對象超過30歲并小于65歲，并且沒有有活性的hbv感染(hbsag-)。

抗血吸蟲治療：對象在過去10年內(nèi)按照下列方案服用吡喹酮：從未，1至4次，5-10次，>10次。

對照是尚未暴露于日本血吸蟲并且從未用吡喹酮治療過的對象。星號：用日本血吸蟲卵刺激的培養(yǎng)物；空心圓圈：靜置培養(yǎng)物；每個組的對象數(shù)目：對照(19)，處理：未治療(9)，1-4(30)，5-10(23)，<10(8)。

圖2b示出了pbmc培養(yǎng)物中il-22的水平隨肝纖維變性的程度而變。

研究對象超過30歲并小于65歲，并且沒有有活性的hbv感染(hbsag-)。對照是尚未暴露于日本血吸蟲的對象；星號：用日本血吸蟲卵刺激的培養(yǎng)物；空心圓圈：靜置培養(yǎng)物。纖維變性等級如方法中所述進行評估，并且大多數(shù)是中央纖維變性等級，外周纖維變性只有在將具有輕度中央纖維變性的對象分成一個沒有或具有輕度外周纖維變性的組(cll)和一個具有輕度中央纖維變性并發(fā)展成嚴(yán)重(gnm，gnh)外周纖維變性的組(cll，gnm)時才考慮在內(nèi)。每個組的對象數(shù)目：對照(19)，cll(23)，cllgnm(27)，clm(10)，clh(7)，d、e、f(3)。

圖2c示出了具有不同肝纖維變性等級并使用不同治療的對象中的il-22水平。研究對象超過30歲并小于65歲，并且沒有有活性的hbv感染(hbsag-)。對照是尚未暴露于日本血吸蟲的對象。對象已被治療0至4次(空心圓圈)或超過5次至20次(實心圓圈)。每個組的對象數(shù)目：治療組合并如下：0至4次治療以及>5次治療，以便增加每個點的對象數(shù)目

對照：19；0-4次治療：39；>5次治療：對照：31。

圖3a示出了抗血吸蟲治療對卵刺激的培養(yǎng)物中il-22、il-6、il-1β或il-23水平的影響。研究對象超過30歲并小于65歲，并且沒有有活性的hbv感染(hbsag-)。對照是尚未暴露于日本血吸蟲的對象。將來自于研究對象的pbmc用卵刺激，并在24小時(il-1b、il-23、il-6)和144小時(il-22)時評估上清液中的細胞因子。將il-6水平乘以0.1。

圖3b示出了在來自于對照和具有各種不同程度肝纖維變性的對象的卵刺激的pmbc中il-22、il-6、il-1β或il-23的水平。研究和每個組中的對象數(shù)目與圖2a相同。

圖4是在il22ra2中定位snp和關(guān)聯(lián)性區(qū)段(correlationbin)的圖譜。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了在人類中用于在纖維變性、尤其是肝纖維變性中預(yù)測疾病進展的有價值的遺傳標(biāo)志物。

ecmp的異常積累或纖維變性的早期檢測，以及這樣的積累或纖維變性的定期監(jiān)測，允許啟動抗纖維變性療法，從而能夠中止并甚至逆轉(zhuǎn)這一過程。這將反過來防止發(fā)展為人類纖維變性疾病例如肝纖維變性或肝硬化，以及這種病癥帶來的發(fā)病和死亡。這些各種早期纖維變性檢測技術(shù)的開發(fā)對于肝病患者未來的護理是一個好的兆頭。

現(xiàn)在，本發(fā)明發(fā)明人已鑒定出與人類纖維變性相關(guān)的基因。他們顯示，在分別被日本血吸蟲和曼森氏血吸蟲感染的中國人、蘇丹人和巴西人組群中，纖維變性顯著依賴于位于il22ra2基因中的等位基因變體。il22ra2(“白介素-22受體α-2”)基因，也稱為il22r-bp，編碼il-22受體的可溶形式，其競爭il-22與其受體的結(jié)合。

更具體來說，本發(fā)明發(fā)明人對全都生活在血吸蟲流行區(qū)的中國人(暴露于日本血吸蟲)、蘇丹人和巴西人(暴露于曼森氏血吸蟲)的獨立樣品進行了病例對照研究。由至少兩位觀察者使用超聲回波描記術(shù)對每個樣品進行肝纖維變性(hf)評估。測試了il22ra2中的所有標(biāo)簽snp(次要等位基因頻率>10％)。為了排除與相關(guān)snp連鎖不平衡的snp是否能夠解釋觀察到的關(guān)聯(lián)性，發(fā)明人評估了在il22ra2的3’和5’的500kb區(qū)域內(nèi)的snp。

因此，本發(fā)明提供了在對象中確定發(fā)生肝纖維變性的風(fēng)險或肝纖維變性的發(fā)生或肝纖維變性的不良預(yù)后的方法，所述方法包括在來自于所述對象的樣品中檢測il22ra2基因座處風(fēng)險相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(snp)等位基因的存在。

更具體來說，本發(fā)明提供了確定發(fā)生肝纖維變性的風(fēng)險或肝纖維變性的發(fā)生或肝纖維變性的不良預(yù)后的方法，所述方法包括對來自于所述對象的樣品中il22ra2基因座中的snp進行基因分型。

本發(fā)明的另一個目的是提供用于預(yù)測對病毒感染治療的響應(yīng)的遺傳學(xué)方法。本發(fā)明現(xiàn)在公開了抗病毒治療響應(yīng)基因座、即il22ra2基因座的鑒定，所述基因座可用于預(yù)測患有病毒感染、尤其是hcv的患者對抗病毒治療的響應(yīng)。具體來說，本發(fā)明涉及一種方法，所述方法包括在來自于對象的樣品中檢測il22ra2基因座中的變化的存在，所述變化的存在指示了對治療的響應(yīng)，即指示了患者不對治療做出響應(yīng)的風(fēng)險水平。

本發(fā)明的方法允許預(yù)測對治療的響應(yīng)，所述治療使用給藥于患有病毒感染、尤其是丙型肝炎的患者的抗病毒劑例如利巴韋林和干擾素。

本發(fā)明提供了尤其是在丙型肝炎中用于預(yù)測對抗病毒治療的響應(yīng)的有價值的標(biāo)志物。

對抗病毒治療有響應(yīng)和無響應(yīng)對象的早期鑒定，允許根據(jù)患者的基因型啟動個體化(個性化)治療。這將進而幫助醫(yī)生做出更合理的決定，避免不需要的開支和不必要的副作用。這些各種早期預(yù)測技術(shù)的開發(fā)對于患有病毒感染、尤其是丙型肝炎的患者未來的護理是一個好的兆頭。

現(xiàn)在，本發(fā)明發(fā)明人已鑒定出與對抗病毒治療的響應(yīng)相關(guān)的基因。他們已顯示，在被hcv感染的各種組群中，對抗病毒治療利巴韋林-ifn的響應(yīng)取決于位于il22ra2基因中的等位基因變體。

盡管取決于被測試的群體，由本發(fā)明發(fā)明人收集的實驗數(shù)據(jù)不能證實某些等位基因的關(guān)聯(lián)性，但本發(fā)明不限于被發(fā)現(xiàn)在所有被測試的群體中與纖維變性顯著相關(guān)的特定snp。事實上，有幾個原因可以解釋在某些群體中證實顯著關(guān)聯(lián)性的失敗，包括組群不足、混雜變量的評估不完全、所述群體中snp的頻率較低等。

定義

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“細胞外基質(zhì)蛋白(ecmp)的異常沉積”是指可能在所有類型的人類組織中積累的細胞外基質(zhì)組分(包括層粘連蛋白、纖連蛋白eiiia、膠原蛋白i和iv、前膠原蛋白iii、彈性蛋白、腱生蛋白)。這樣的積累可能是有害的，例如當(dāng)它出現(xiàn)在動脈、心臟或腦中時。當(dāng)沉積巨大時，積累導(dǎo)致組織的纖維變性。

在本發(fā)明的上下文中，“纖維變性”是指在所有人類纖維變性疾病例如肝病、肝硬化、皮膚瘢痕瘤、增生性瘢痕、硬皮病、肥胖癥和任何纖維變性疾病中發(fā)生的所有類型的人類纖維變性。

在本發(fā)明的上下文中，“肝纖維變性”或“hf”是指在肝、其組織或其組織的任何部分中發(fā)生的所有類型的纖維變性。肝纖維變性尤其是在對損傷做出響應(yīng)時發(fā)生。肝纖維變性可以是對慢性肝損傷的常見響應(yīng)，最終引起肝硬化及其并發(fā)癥、門靜脈高壓、肝衰竭和肝細胞癌。肝纖維變性是過分旺盛的傷口愈合，其中過量的結(jié)締組織在肝臟中堆積。細胞外基質(zhì)被過量產(chǎn)生、不充分地降解或兩種情況皆有。觸發(fā)事件是慢性損傷，特別是如果存在炎性組分的話。各種類型的慢性肝損傷可以引起纖維變性，例如化學(xué)性纖維變性(ccl4)、細菌性(即布魯氏菌病)、寄生蟲性(即由裂體吸蟲屬(schistosoma)物種引起的裂體吸蟲病/血吸蟲??；或包蟲病感染)或病毒性(即由甲肝病毒(hav)、乙肝病毒(hbc)或丙肝病毒(hcv)感染引起的肝炎)損傷。

在本發(fā)明的上下文中，“皮膚瘢痕瘤”是皮膚上瘢痕組織的過度生長。更具體來說，瘢痕瘤和增生性瘢痕(hsc)是人類特有的在創(chuàng)傷、炎癥、手術(shù)、燒傷后以及有時自發(fā)發(fā)生的真皮纖維增殖性障礙。它們的特征在于膠原蛋白在真皮和皮下組織中的過度沉積。與正常傷口修復(fù)的細紋瘢痕特征相反，瘢痕瘤和hsc的旺盛的瘢痕形成通常引起毀容、攣縮、瘙癢和疼痛。瘢痕瘤在黑種人、西班牙人和東方人中發(fā)生在具有家族傾向性的個體中。與hsc不同，瘢痕瘤的瘢痕擴大并延伸到原始傷口的邊緣之外并很少減退。這些障礙代表了傷口愈合的基礎(chǔ)過程的失常，所述過程包括細胞遷移和增殖、炎性、細胞因子和細胞外基質(zhì)(ecm)蛋白的合成和分泌增加以及新合成基質(zhì)的重塑。在生物學(xué)上，瘢痕瘤是纖維變性組織，其特征在于過度沉積有細胞外基質(zhì)組分、尤其是膠原蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖的非典型性成纖維細胞的集合?？偟膩碚f，瘢痕瘤含有相對無細胞的中心和濃密豐富的膠原蛋白束，其在病變的真皮深層部分中形成結(jié)節(jié)。在愈合的炎性階段期間生長因子的釋放和活化是瘢痕形成過程的先決條件，所述過程包括血管生成、表皮再生、成纖維細胞的募集和增殖以及基質(zhì)沉積。然后，調(diào)節(jié)性細胞因子包括il22ra2的活性的異常產(chǎn)生，可能造成瘢痕瘤的發(fā)生。

在本發(fā)明的上下文中，“il22ra2基因座”是指細胞或生物體中的所有序列或產(chǎn)物，包括il22ra2編碼序列、il22ra2非編碼序列(例如內(nèi)含子)、控制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的il22ra2調(diào)控序列(例如啟動子、增強子、終止子等)、所有相應(yīng)的表達產(chǎn)物例如il22ra2rna(例如mrna)和il22ra2多肽(例如前體蛋白和成熟蛋白)；以及il22ra2基因的起始密碼子上游500kb區(qū)域、優(yōu)選地100kb、優(yōu)選地20kb區(qū)域和非翻譯區(qū)(3’utr)下游500kb區(qū)域、優(yōu)選地100kb、優(yōu)選地20kb區(qū)域的周圍序列。例如，il22ra2基因座包含含有表1的snp的周圍序列。

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“預(yù)后”包括在成年人、兒童和胎兒中，在包括早期、癥狀出現(xiàn)前的階段和晚期階段的各個階段檢測、監(jiān)測、給藥、比較等。預(yù)后通常包括評估(預(yù)測)纖維變性的進展和確定對象特征以確定最適合的治療(藥物遺傳學(xué))等。本發(fā)明提供了用于確定由il22ra2基因座中的突變或多態(tài)性引起的纖維變性或相關(guān)障礙的發(fā)展速度的預(yù)后方法。

“樣品”可以是源自于患者或?qū)ο蟮暮泻怂峄蚨嚯牡娜魏紊飿悠?。這樣的樣品的實例包括流體、組織、細胞樣品、器官、活檢樣品等。最優(yōu)選的樣品是血液、血漿、唾液、尿液、精液等。樣品可以按照常規(guī)技術(shù)來收集并直接用于診斷或儲存。

“患者”可以是任何哺乳動物，優(yōu)選為人類，無論其年齡或性別如何?；颊呖赡鼙徊《靖腥?，所述病毒包括選自下列病毒科的病毒：沙粒病毒科(例如拉沙病毒)，冠狀病毒科(例如嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒)，黃病毒科(例如丙肝或乙肝病毒、登革病毒、西尼羅病毒、黃熱病病毒、蜱傳腦炎病毒)，纖絲病毒科(例如埃博拉病毒、馬爾堡病毒)，皰疹病毒科(例如單純性皰疹病毒、巨細胞病毒、epstein-barr病毒、水痘帶狀皰疹病毒)，正粘病毒科(例如流感a和b病毒)，副粘病毒科(例如呼吸道合胞體病毒、副流感病毒、pmv、麻疹病毒)，痘病毒科(例如痘苗病毒、天花病毒)，彈狀病毒科(例如水皰性口炎病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、狂犬病病毒)，反轉(zhuǎn)錄病毒科(例如hiv和其他反轉(zhuǎn)錄病毒)，披膜病毒科(例如基孔肯亞病毒、辛德畢斯病毒、西門利克森林病毒、羅斯河病毒、東部馬腦炎病毒)。在特定實施方式中，患者被丙肝病毒例如基因型1的丙肝病毒感染。

在用于確定患有病毒感染的患者對使用抗病毒劑和/或干擾素的治療做出響應(yīng)的可能性的方法中，術(shù)語“病毒感染”是指可以用利巴韋林和/或ifn治療的所有類型的人類病毒感染，例如丙型肝炎、乙型肝炎、呼吸道合胞體病毒(rsv)細支氣管炎、腺病毒病、流感和用利巴韋林和/或ifn治療的任何人類病毒感染。

在本發(fā)明的上下文中，“響應(yīng)者”是指對使用抗病毒劑、尤其是利巴韋林和/或ifn的治療做出響應(yīng)的患者的表型，即病毒載量降低，其至少一種癥狀減輕，或疾病的發(fā)展停止或減緩。

在本發(fā)明的上下文中，“非響應(yīng)者”是指對使用抗病毒劑、尤其是利巴韋林和/或ifn的治療沒有響應(yīng)，或者做出響應(yīng)但在1或2年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者的表型。對治療無響應(yīng)是指病毒載量沒有顯著降低，患者癥狀沒有減輕或疾病繼續(xù)發(fā)展。復(fù)發(fā)患者對治療做出短期響應(yīng)，但是它們的病毒載量和癥狀在治療結(jié)束后的1或2年內(nèi)再次增加。

術(shù)語“治療”或“抗病毒治療”是指抗病毒劑和/或干擾素(ifn)的給藥。

優(yōu)選地，干擾素是干擾素γ。然而也涵蓋其他干擾素，包括干擾素α2b、peg化的干擾素α、復(fù)合干擾素、干擾素α2a和類淋巴母細胞干擾素τ。在優(yōu)選實施方式中，干擾素是peg化的干擾素，例如peg化的干擾素γ。

“抗病毒劑”可以是干擾病毒進入細胞或病毒復(fù)制或抑制病毒蛋白的活性的任何化合物。例如，它可以是干擾rna、反義rna、咪奎莫特、利巴韋林、次黃苷5’-單磷酸脫氫酶抑制劑、金剛烷胺或金剛乙胺。更通常地，它可以是病毒蛋白酶抑制劑。

當(dāng)所述病毒是hcv病毒時，抗病毒劑可以是hcv金屬蛋白酶、hcv絲氨酸蛋白酶、hcv聚合酶、hcv解旋酶、hcvns4b蛋白、hcv進入、hcv組裝、hcv排出或hcvns5a蛋白的抑制劑。

在優(yōu)選情況下，干擾素是干擾素γ，例如peg化的干擾素γ。在另一種優(yōu)選情況下，干擾素是干擾素α，例如peg化的干擾素α。在特定實施方式中，治療包括利巴韋林和干擾素γ或α，優(yōu)選地peg化的干擾素γ或α。

變化

變化可以在il22ra2dna、rna或多肽的水平上確定。任選地，通過對il22ra2基因座的全部或一部分進行測序，或者通過對il22ra2基因座的全部或一部分進行選擇性雜交或擴增，來進行檢測。更優(yōu)選地，在變化鑒定步驟之前進行il22ra2基因座特異性擴增。il22ra2基因座中的變化可以是基因座的編碼和/或非編碼區(qū)中的任何形式的突變、缺失、重排和/或插入，其可以單獨地或以各種組合出現(xiàn)。更具體來說，突變包括點突變。缺失可以涵蓋基因座的編碼或非編碼區(qū)中具有兩個或更多個殘基的任何區(qū)域，例如從2個殘基直至整個基因或基因座。典型的缺失影響較小的區(qū)域，例如少于約50個連續(xù)堿基對的結(jié)構(gòu)域(內(nèi)含子)或重復(fù)序列或片段，盡管較大的缺失也可能發(fā)生。插入可以涵蓋在基因座的編碼或非編碼部分中添加一個或幾個殘基。插入通?？梢园诨蜃刑砑?至50個堿基對。重排包括序列的倒置。il22ra2基因座變化可以導(dǎo)致產(chǎn)生終止密碼子、移碼突變、氨基酸替換、特定rna拼接或加工、產(chǎn)物不穩(wěn)定性、產(chǎn)生截短的多肽等。變化可能導(dǎo)致產(chǎn)生具有改變的功能、穩(wěn)定性、靶向或結(jié)構(gòu)的il22ra2多肽。變化還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達的降低或所述生產(chǎn)的增加。

在優(yōu)選實施方式中，所述變化是一個或多個堿基的突變、插入或缺失。在本發(fā)明方法的特定實施方式中，il22ra2基因座中的變化選自il22ra2基因或相應(yīng)的表達產(chǎn)物中的點突變、缺失和插入，更優(yōu)選地為點突變和缺失。變化可以在il22ra2dna、rna或多肽的水平上確定。

在最優(yōu)選實施方式中，方法包括對il22ra2基因進行基因分型，以確定在表1a中指明的位置中的任意處snp的存在。

表1a：il22ra2基因座中與纖維變性相關(guān)的snp

hapmap：ceu歐洲人組群，yor非洲人組群(約魯巴人)，chb亞洲人組群(中國人)

優(yōu)選地，方法包括對選自rs6570136、rs7774663、rs11154915和rs2064501的snp進行基因分型。

對于snprs6570136來說g等位基因、更具體來說gg基因型的存在，對于患者是有害的，即它指示了患者可能發(fā)生ecmp異常沉積或纖維變性，尤其是肝纖維變性。

對于snprs7774663來說t等位基因、更具體來說tt基因型的存在，對于患者是有害的，即它指示了患者可能發(fā)生ecmp異常沉積或纖維變性，尤其是肝纖維變性。

對于snprs11154915來說t等位基因、更具體來說tt或ct基因型的存在，對于患者是有害的，即它指示了患者可能發(fā)生ecmp異常沉積或纖維變性，尤其是肝纖維變性。

對于snprs2064501來說c等位基因、更具體來說cc基因型的存在，對于患者是有害的，即它指示了患者可能發(fā)生ecmp異常沉積或纖維變性，尤其是肝纖維變性。

相同區(qū)段中的snp是高度關(guān)聯(lián)的(r2>0.8)，并且在本發(fā)明的方法中用途相近。本發(fā)明還涵蓋了處于強連鎖不平衡中的snp(得到r2>0.6)。

本發(fā)明的另一種方法可以包括確定患者是否包含表1b中所定義的非響應(yīng)性基因型。

分析在123位都感染有hcv的對象(69位響應(yīng)對象和54位非響應(yīng)對象)上進行。

表1b：il22ra2基因座中與抗病毒治療響應(yīng)性相關(guān)的變化

優(yōu)選地，方法包括對選自rs11154915、rs6570136、rs2064501和rs1543509的snp進行基因分型。

對于snprs11154915來說tt基因型的存在，有利于患者對所述抗病毒治療的陽性響應(yīng)。

對于snprs6570136來說ag或gg基因型的存在，有利于患者對所述抗病毒治療的陽性響應(yīng)。

對于snprs2064501來說ct基因型的存在，有利于患者對所述抗病毒治療的陽性響應(yīng)。

對于snprs1543509來說aa基因型的存在，有利于患者對所述抗病毒治療的陽性響應(yīng)。

相同區(qū)段中的snp是高度關(guān)聯(lián)的(r2>0.8)，并且在本發(fā)明的方法中用途相近。本發(fā)明還涵蓋了處于連鎖不平衡中的snp。

與每種基因型相關(guān)的比值比注明在表1b中。當(dāng)每個snp被單獨評估時，它們在1.9至4之間變化；當(dāng)所有snp在同一多變量模型(其考慮了snp之間的混雜效應(yīng))中一起評估時，or在1.9至13之間變化，并且攜帶所有4種多態(tài)性的響應(yīng)性基因型的對象，與攜帶所有基因型的非響應(yīng)性基因型的對象相比，對治療做出響應(yīng)的可能性高出約50至300倍。

連鎖不平衡(ld)被定義為整個基因組上不同基因座處等位基因的非隨機關(guān)聯(lián)。兩個或更多個基因座處的等位基因，如果它們的組合以比在群體中通過概率所預(yù)期的更高或更低的頻率出現(xiàn)，則處于ld中。

當(dāng)由于ld造成在dna區(qū)域中存在因果基因座(causallocus)時，一個或多個鄰近的snp也可能伴有該特性。因此，與和異常ecmp沉積相關(guān)的第一snp處于強ld(得到r2>0.6)中的任何snp，也將伴有該特性。

與給定snp處于連鎖不平衡的其他snp的鑒定包括：(a)從大量個體，從包含或圍繞第一snp的基因組區(qū)域擴增片段；(b)在帶有或圍繞所述第一snp的基因組區(qū)域中鑒定第二snp；(c)在所述第一snp與第二snp之間進行連鎖不平衡分析；以及(d)當(dāng)與所述第一標(biāo)志物處于連鎖不平衡時，選擇所述第二snp。還設(shè)想了包含步驟(b)和(c)的子組合。

鑒定snp和進行連鎖不平衡分析的方法，可以由專業(yè)技術(shù)人員使用公知的方法，不需過多實驗來進行。

眾所周知，許多snp具有與其他鄰近snp等位基因顯示出強ld的等位基因，并且在具有強ld的基因組區(qū)域中，選擇均勻間隔的snp或在它們與其他snp(代理(proxy)snp或標(biāo)簽snp)的ld的基礎(chǔ)上選擇的snp，能夠捕獲沒有進行基因分型的snp的大多數(shù)遺傳信息，并且僅僅略微損失統(tǒng)計功效。在關(guān)聯(lián)性研究中，使用很少的snp(標(biāo)簽snp)足以覆蓋ld的這個區(qū)域，并且snp與所研究的表型之間的統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)性意味著所述snp是因果變體或與因果變體處于ld中。最通常用于度量ld的兩個指標(biāo)是d’和r²，并且可以根據(jù)彼此和等位基因頻率來書寫。普遍的共識是，代理(或標(biāo)簽snp)被定義為與一個或多個其他snp處于ld(r²≥0.8)中的snp。代理snp的基因型能夠通過ld預(yù)測其他snp的基因型，反之亦然。具體來說，與本文中使用的snp之一處于ld中的任何snp可以被一個或多個代理snp代替，所述代理snp根據(jù)它們的ld為r²≥0.8來定義。

這些處于連鎖不平衡的snp也可用于本發(fā)明的方法中，更具體地用于本發(fā)明的診斷方法中。

il22ra2基因中的變化可以通過確定改變的il22ra2rna表達的存在來檢測。改變的rna表達包括存在改變的rna序列、存在改變的rna拼接或加工、存在改變的rna量等。它們可以通過本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)來檢測，包括例如通過對il22ra2rna的全部或一部分進行測序，或通過選擇性雜交或選擇性擴增所述rna的全部或一部分。

在其他變體中，方法包括檢測改變的il22ra2多肽表達的存在。改變的il22ra2多肽表達包括存在改變的多肽序列、存在改變的il22ra2多肽的量、存在改變的組織分布等。它們可以通過本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)來檢測，包括例如通過測序和/或與特異性配體(例如抗體)的結(jié)合。

如上所示，可以使用本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)來檢測或定量改變的il22ra2基因或rna表達或序列，這些技術(shù)包括測序、雜交、擴增和/或與特異性配體(例如抗體)的結(jié)合。其他適合的方法包括等位基因特異性寡核苷酸(aso)、等位基因特異性擴增、southern印跡(用于dna)、northern印跡(用于rna)、單鏈構(gòu)象分析(ssca)、pfge、熒光原位雜交(fish)、凝膠遷移、夾具式變性凝膠電泳、異源雙鏈體分析、rnase保護、化學(xué)錯配切割、elisa、放射免疫測定法(ria)和免疫-酶測定法(iema)。這些方法中的一些(例如ssca和cgge)是基于作為存在改變的序列的結(jié)果而發(fā)生的核酸電泳遷移率的變化。按照這些技術(shù)，通過在凝膠上的遷移率變化來觀察改變的序列。然后可以對片段進行測序以證實變化。一些其他方法是基于來自于對象的核酸與特異性針對野生型或改變的il22ra2基因或rna的探針之間的特異性雜交。探針可以在懸液中，或者固定在基材上。探針通常被標(biāo)記以便于雜交體的檢測。這些方法中的一些特別適用于評估多肽序列或表達水平，例如northern印跡、elisa和ria。這些后面的方法需要使用特異性針對多肽的配體，更優(yōu)選為特異性抗體。

在優(yōu)選實施方式中，方法包括檢測來自于對象的樣品中改變的il22ra2基因表達情況的存在。如上所示，這更優(yōu)選地可以通過對所述樣品中存在的核酸進行測序、選擇性雜交和/或選擇性擴增來實現(xiàn)。

測序

測序可以使用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)，使用自動測序儀來進行。測序可以在完整的il22ra2基因座上，或者更優(yōu)選地在其特定結(jié)構(gòu)域上，通常為已知或懷疑攜帶有害突變或其他變化的結(jié)構(gòu)域上進行。

擴增

擴增是基于互補核酸序列之間用于引發(fā)核酸復(fù)制的特異性雜交體的形成。擴增可以按照本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)來進行，例如通過聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、連接酶鏈反應(yīng)(lcr)、鏈置換擴增(sda)和基于核酸序列的擴增(nasba)。這些技術(shù)可以使用可商購的試劑和流程來進行。優(yōu)選的技術(shù)使用等位基因特異性pcr或pcr-sscp。擴增通常需要使用特異性核酸引物來引發(fā)反應(yīng)。可用于從il22ra2基因座擴增序列的核酸引物，能夠與il22ra2基因座在所述基因座的靶區(qū)域側(cè)翼的部分特異性雜交，所述靶區(qū)域在某些具有纖維變性或相關(guān)障礙的對象中被改變。

本發(fā)明利用了可用于從il22ra2基因或基因座、包括周圍區(qū)域擴增序列的核酸引物。這樣的引物優(yōu)選地與il22ra2基因座中的核酸序列互補并與其特異性雜交。特定引物能夠與il22ra2基因座在所述基因座的靶區(qū)域側(cè)翼的部分特異性雜交，所述靶區(qū)域在某些具有纖維變性或相關(guān)障礙的對象中被改變。

選擇性雜交

雜交檢測方法是基于互補核酸序列之間用于檢測核酸序列變化的特異性雜交體的形成。具體檢測技術(shù)包括使用特異性針對野生型或改變的il22ra2基因或rna的核酸探針，然后檢測雜交體的存在。探針可以在懸液中，或固定在基材或支持物上(如在核酸陣列或芯片技術(shù)中)。探針通常被標(biāo)記以便于雜交體的檢測。就此而言，本發(fā)明的特定實施方式包括將來自于對象的樣品與特異性針對改變的il22ra2基因座的核酸探針相接觸，并評估雜交體的形成。在特別優(yōu)選的實施方式中，方法包括將樣品同時與分別特異性針對野生型il22ra2基因座及其各種改變形式的一組探針進行接觸。在這樣的實施方式中，可以直接檢測樣品中il22ra2基因座的各種變化形式的存在。此外，還可以并行地處理來自于各個對象的各種不同樣品。

在本發(fā)明的上下文中，探針是指與il22ra2基因或rna(的靶部分)互補并能夠與其特異性雜交的多核苷酸序列，并且其適用于檢測與il22ra2等位基因相關(guān)聯(lián)的多核苷酸多態(tài)性，所述等位基因?qū)w維變性易感或與纖維變性相關(guān)。探針優(yōu)選地與il22ra2基因、rna或其靶部分完全互補。探針通常包含長度在8至1000個核苷酸之間，例如10至800之間、更優(yōu)選地15至700之間、通常20至500之間的單鏈核酸。應(yīng)該理解，也可以使用更長的探針。本發(fā)明的優(yōu)選探針是長度在8至500個核苷酸之間的單鏈核酸分子，其能夠與il22ra2基因座或rna帶有變化的區(qū)域特異性雜交。

本發(fā)明的方法利用特異性針對改變的(例如突變的)il22ra2基因或rna的核酸探針，即與所述改變的il22ra2基因或rna特異性雜交并且基本上不與缺少所述變化的il22ra2基因或rna雜交的核酸探針。特異性是指與靶序列的雜交產(chǎn)生可以與通過非特異性雜交產(chǎn)生的信號區(qū)別開的特異性信號。完全互補的序列對于本發(fā)明探針的設(shè)計來說是優(yōu)選的。然而，應(yīng)該理解，可以容忍一定的錯配，只要特異性信號可以與非特異性雜交區(qū)分開即可。這樣的探針的具體實例是與基因組區(qū)域的靶部分互補的核酸序列，所述靶部分包括帶有上面表1中列出的點突變的il22ra2基因座或rna。

探針的序列可以源自于本申請中提供的il22ra2基因和rna的序列。可以進行核苷酸替換以及探針的化學(xué)修飾?？梢赃M行這樣的化學(xué)修飾以提高雜交體的穩(wěn)定性(例如嵌入基團)或標(biāo)記探針。標(biāo)記物的典型實例包括但不限于放射活性、熒光、發(fā)光、酶標(biāo)記等。本發(fā)明還涉及將如上所述的核酸探針用于在對象中檢測纖維變性或相關(guān)障礙的存在或易感性的方法中，或用于評估對象對纖維變性或相關(guān)障礙的治療的響應(yīng)的方法中。

特異性配體結(jié)合

如上所示，il22ra2基因座中的變化，也可以通過篩選il22ra2多肽序列或表達水平中的變化來檢測。就此而言，還描述了將樣品與特異性針對il22ra2多肽的配體相接觸，并測定復(fù)合物的形成?？梢允褂貌煌愋偷呐潴w，例如特異性抗體。在特定實施方式中，將樣品與特異性針對il22ra2多肽的抗體相接觸，并測定免疫復(fù)合物的形成?？梢允褂糜糜跈z測免疫復(fù)合物的各種方法，例如elisa、放射免疫測定法(ria)和免疫-酶學(xué)測定法(iema)。在本發(fā)明的上下文中，抗體是指多克隆抗體、單克隆抗體及其具有基本上相同的抗原特異性的片段或衍生物。片段包括fab、fab’2、cdr區(qū)等。衍生物包括單鏈抗體、人源化抗體、多功能抗體等。特異性針對il22ra2多肽的抗體是指選擇性結(jié)合il22ra2多肽的抗體，即針對il22ra2多肽或其含表位片段產(chǎn)生的抗體。盡管可能發(fā)生針對其他抗原的非特異性結(jié)合，但與靶il22ra2多肽的結(jié)合以較高親和性發(fā)生，并可以與非特異性結(jié)合可靠地區(qū)分開。

還公開了診斷試劑盒，其包含用于檢測來自于對象的樣品中，在il22ra2基因座或多肽、il22ra2基因或多肽表達和/或il22ra2活性中的變化的存在的產(chǎn)品和試劑。所述診斷試劑盒包含本發(fā)明中描述的任何引物、任何引物對、任何核酸探針和/或任何配體，優(yōu)選抗體。所述診斷試劑盒還可以包含用于執(zhí)行雜交、擴增或抗原-抗體免疫反應(yīng)的試劑和/或流程。

藥物篩選

還描述了用于篩選藥物候選物或先導(dǎo)物的新方法。這些方法包括結(jié)合測定法和/或功能測定法，并且可以在體外、細胞系統(tǒng)、動物等中進行。本發(fā)明的具體目的在于一種篩選生物活性化合物的方法，所述方法包括在體外將測試化合物與本發(fā)明的il22ra2基因或多肽相接觸，并確定所述測試化合物結(jié)合所述il22ra2基因或多肽的能力。與所述基因或多肽的結(jié)合，為所述化合物調(diào)節(jié)所述靶的活性的能力以及因此影響在對象中造成任何ecmp異常沉積或纖維變性的途徑的能力，提供了指示。在優(yōu)選實施方式中，所述方法包括在體外將測試化合物與本發(fā)明的il22ra2多肽或其片段相接觸，并確定所述測試化合物結(jié)合所述il22ra2多肽或片段的能力。所述片段優(yōu)選地包含il22ra2多肽的結(jié)合位點。優(yōu)選地，所述il22ra2基因或多肽或其片段是改變的或突變的il22ra2基因或多肽或其包含所述變化或突變的片段。本發(fā)明的具體目的在于一種篩選對任何ecmp異常沉積或纖維變性有活性的化合物的方法，所述方法包括在體外將測試化合物與本發(fā)明的il22ra2多肽或其含有結(jié)合位點的片段相接觸，并確定所述測試化合物結(jié)合所述il22ra2多肽或其片段的能力。優(yōu)選地，所述il22ra2多肽或其片段是改變的或突變的il22ra2多肽或其包含所述變化或突變的片段。用于篩選藥物候選物的方法包括將表達本發(fā)明的il22ra2多肽的重組宿主細胞與測試化合物相接觸，并確定所述測試化合物結(jié)合所述il22ra2以及調(diào)節(jié)il22ra2多肽的活性的能力。優(yōu)選地，所述il22ra2多肽或其片段是改變的或突變的il22ra2多肽或其包含所述變化或突變的片段。結(jié)合的確定可以通過各種技術(shù)來進行，例如通過測試化合物的標(biāo)記、通過與標(biāo)記的參比配體的競爭等。選擇生物活性化合物的方法還包括在體外將測試化合物與il22ra2多肽相接觸，并確定所述測試化合物調(diào)節(jié)所述il22ra2多肽的活性的能力。優(yōu)選地，所述il22ra2多肽或其片段是改變的或突變的il22ra2多肽或其包含所述變化或突變的片段。為已患有任何ecmp異常沉積或纖維變性、或?qū)Πl(fā)生任何ecmp異常沉積或纖維變性易感的對象選擇生物活性化合物的方法，還包括在體外將測試化合物與本發(fā)明的il22ra2基因相接觸，并確定所述測試化合物調(diào)節(jié)所述il22ra2基因的表達的能力。優(yōu)選地，所述il22ra2基因或其片段是改變的或突變的il22ra2基因或其包含所述變化或突變的片段。

篩選、選擇或鑒定活性化合物、尤其是對任何ecmp異常沉積或纖維變性有活性的化合物的方法，還包括：將測試化合物與包含報告構(gòu)建物的重組宿主細胞相接觸，所述報告構(gòu)建物包含在il22ra2基因啟動子控制下的報告基因；以及選擇調(diào)節(jié)(例如激活或抑制)報告基因的表達的測試化合物。優(yōu)選地，所述il22ra2基因啟動子或其片段是改變的或突變的il22ra2基因啟動子或其包含所述變化或突變的片段。

上面的篩選測定法可以在任何適合的裝置例如板、試管、培養(yǎng)皿、搖瓶等中進行。通常，測定法在多孔板中進行。幾種測試化合物可以并行地測定。此外，測試化合物可以具有各種不同的來源、性質(zhì)和組成。它可以是任何有機或無機物質(zhì)，例如脂類、肽、多肽、核酸、小分子等，可以是孤立的或與其他物質(zhì)形成混合物。例如，化合物可以是產(chǎn)物組合文庫的全部或一部分。

本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點將在下面的實驗部分中公開，所述實驗部分應(yīng)該被當(dāng)作說明性的，而不是限制本申請的范圍。

實施例

實施例1：人類血吸蟲感染中il-22的生產(chǎn)和調(diào)節(jié)

人類血吸蟲感染中il-22的生產(chǎn)

本發(fā)明發(fā)明人將來自于140位暴露于日本血吸蟲感染的對象的pbmc培養(yǎng)物，與以前沒有暴露于血吸蟲感染但在相同地區(qū)在可比的生活條件下生活的20位對照的培養(yǎng)物中的il-22水平進行比較(圖1a)。在72和144小時時，在暴露對象的靜置培養(yǎng)物中檢測到il-22，并且通過在培養(yǎng)的0時添加血吸蟲卵，il-22顯著提高。在對照靜置培養(yǎng)物中，僅在144小時時檢測到il-22，并且添加卵不提高il-22。本發(fā)明發(fā)明人在144小時培養(yǎng)物中檢測到顯著水平的il-17a，但是il-17水平不被卵刺激提高(圖1b)。因此，培養(yǎng)物中的il-22不可能由th17產(chǎn)生。暴露患者的血液中il22+細胞的facs分析顯示，il-22由cd3+cd4+和cd3-cd4-細胞產(chǎn)生，這些細胞群體都不產(chǎn)生il-17(圖1c)。后者可能是nk細胞。對照和流行區(qū)對象中cd3+cd4+il17-il22+t細胞和cd3-cd4-il17-il22+細胞的百分率示出在圖1c上。

il-22生產(chǎn)的調(diào)節(jié)被抗血吸蟲治療改變，并且根據(jù)肝纖維變性被相應(yīng)調(diào)節(jié)。

在暴露的對象中，卵刺激的培養(yǎng)物中的il-22水平顯著變化。由于抗血吸蟲的吡喹酮治療破壞蠕蟲并切斷卵的生產(chǎn)直至發(fā)生再次感染，因此我們評估了吡喹酮治療中的差異是否可能調(diào)節(jié)il-22生產(chǎn)。某些患者已經(jīng)至少10年每年進行治療，還有些患者從未被治療過，其他患者在過去10年中接受過1至10次治療。圖2a示出了吡喹酮治療的次數(shù)對由對象的pbmc生產(chǎn)的il-22的顯著影響：卵刺激的培養(yǎng)物中的il-22隨著過去10年中的治療次數(shù)顯著增加(p＝0.005，回歸模型中的協(xié)變量是性別，p＝0.08)；然而，對于每年治療至少一次的對象來說這種影響小得多，可能是因為這些對象沒有被再次感染(參見下文)。其次，過去10年中吡喹酮治療的頻率對來自于暴露對象的pmbc的il-22生產(chǎn)具有顯著影響。

然后，本發(fā)明發(fā)明人評估了培養(yǎng)物中的il-22水平是否與患者肝病的程度相關(guān)。圖2b顯示，在具有通過肝纖維變性等級度量為輕度肝病的對象中il-22低，并且隨著纖維變性等級的提高穩(wěn)定地增加，在具有重度中央門靜脈周纖維變性的對象中達到最高水平。這表明，發(fā)生il-22生產(chǎn)的提高可能是對嚴(yán)重肝病做出的響應(yīng)/與嚴(yán)重肝病相關(guān)。然而，嚴(yán)格來說，來自患有非常嚴(yán)重的肝纖維變性(hf等級d、e、f)的患者的il-22不能產(chǎn)生大量il-22。

吡喹酮治療的次數(shù)對這種模式的影響示出在圖2c上。吡喹酮治療影響由來自于所有纖維變性組的細胞產(chǎn)生的il-22。三種觀察與我們的研究最相關(guān)：首先，在重度纖維變性(clh)中增加的il-22生產(chǎn)在不同的吡喹酮治療方式中被觀察到，并且不是由該患者的治療頻率的差異造成的；其次，吡喹酮治療在除了來自于具有嚴(yán)重纖維變性等級的對象的細胞培養(yǎng)物之外的所有培養(yǎng)物中提高il-22生產(chǎn)；第三，具有高吡喹酮治療方式(>10，至少每年一次)的對象在輕度纖維變性組中，并解釋了在該組中觀察到的il-22生產(chǎn)的增加。概括來說，il-22受到吡喹酮治療和肝病程度這兩種獨立因子的影響。此外，患有嚴(yán)重肝病的對象不能生產(chǎn)大量il-22，并且這不能通過吡喹酮治療來改進，然而同樣的治療對具有輕度至重度肝纖維變性的對象的il-22生產(chǎn)具有顯著的增強效應(yīng)。

在具有不同肝纖維變性等級和不同治療方式的對象中，il-6以及或許il-1β，可能是il-22生產(chǎn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

本發(fā)明發(fā)明人觀察到，通過卵刺激，在來自于暴露對象的pbmc的24小時培養(yǎng)物中細胞因子il-6、il-1β和il-23顯著增加(il-23(p＝3.10-6)，il-6(p<10-6)和il-1β(p<10-6))(圖3a)。為了確定這3種細胞因子中的任一種是否在調(diào)節(jié)il-22水平中發(fā)揮作用，我們使用包括這三種細胞因子的卵刺激的培養(yǎng)物中的il-22水平、患者年齡和性別，進行了線性回歸分析。該分析顯示出il-22與il-6之間的高度顯著(p＝0.0002)的關(guān)聯(lián)性以及與il-1β的弱的關(guān)聯(lián)性(p＝0.06)。從回歸模型中排除了il-23。該結(jié)果示出在圖3b、3c中，其示出了il-6、il-1β和il-23隨著吡喹酮治療(圖3b)和肝纖維變性(圖3c)的變差。因此，吡喹酮治療與il-22之間以及纖維變性等級與il-22之間的聯(lián)系，至少部分是il-6。

上面提出的結(jié)果，與保護性il-22應(yīng)答的募集隨肝損傷而增加以及最嚴(yán)重的肝病可能部分地由不能募集這種應(yīng)答而引起的觀點相一致。為了進一步測試這種假說，本發(fā)明發(fā)明人尋找表明il-22在肝纖維變性的控制中事實上是關(guān)鍵的并對肝病具有顯著影響的遺傳證據(jù)。

實施例2：在生活在日本血吸蟲流行區(qū)的中國漁民和農(nóng)民的兩種樣品中il22ra2編碼il22bp中的多態(tài)性與肝纖維變性相關(guān)。

材料和方法

統(tǒng)計分析

使用多變量邏輯回歸來分析個體發(fā)生纖維變性的可能性與包括已知在被血吸蟲感染的對象中影響疾病進展的主要協(xié)變量的遺傳變異體之間的關(guān)系。將統(tǒng)計spss軟件(10.0版)用于這一分析。在回歸模型中測試了年齡、性別和對感染的暴露，并且當(dāng)它們顯示出與疾病的關(guān)聯(lián)性(p<0.05)時得以保持。由于組群在性別和年齡上匹配，因此這些協(xié)變量對遺傳變異體與疾病之間的關(guān)聯(lián)性幾乎沒有影響。被hbv的感染和對感染的暴露，當(dāng)這些協(xié)變量如在中國漁民(暴露，治療次數(shù))或在中國農(nóng)民(hbv感染，出生地)中能夠被準(zhǔn)確評估時，被包含在回歸模型中。

dna提取

將5至15ml的血液等分試樣收集在檸檬酸鈉上并保持在-20℃。使用標(biāo)準(zhǔn)的鹽析方法提取dna(sambrook等，1989)。

dna擴增

在基因分型之前，對從fta卡純化的所有dna進行預(yù)擴增。聚合酶鏈反應(yīng)(全基因組擴增)在50μl反應(yīng)中進行，所述反應(yīng)含有fta卡一圓片量的生物樣品(fta1-結(jié)合的口腔細胞dna)或100ng基因組dna、1.5od的15個堿基的完全簡并的隨機引物(genetix,paris,france)、200mmdntp、5mmmgcl2、5ml10xpcr緩沖液和0.5單位的高保真taqdna聚合酶(biotaqdna聚合酶，biolinelondon，england)。將樣品在多模塊熱循環(huán)儀中如下所述進行擴增：94℃3分鐘的預(yù)變性步驟，50個由94℃1分鐘、37℃2分鐘和1分鐘勻變升溫(37-55℃)構(gòu)成的循環(huán)，以及55℃4分鐘。最后的延伸步驟為72℃5分鐘。

測序

純化的pcr產(chǎn)物使用abiprismbigdyeterminator循環(huán)測序系統(tǒng)(peappliedbiosystems，fostercity，u.s.a.)，在abiprism自動測序儀上測序。測序反應(yīng)由gatcbiotech(gatc，marseillefrance)在兩條鏈上進行。

使用特異性taqman探針通過pcr進行多態(tài)性基因分型

使用taqman探針測定法(appliedbiosystems，lafayette，usa)來評估等位基因分型。每個反應(yīng)含有12.5ng基因組dna、taqman通用pcr主混合物(appliedbiosystems，lafayette，usa)、900nm每種引物和200nm每種熒光標(biāo)記的雜交探針，總體積為5μl。rt-pcr在abiprism序列檢測系統(tǒng)7900(appliedbiosystems，lafayette，usa)中，使用下列條件來進行：50℃2分鐘，95℃10分鐘和40個擴增循環(huán)(95℃變性15秒，60℃退火/延伸1分鐘)。

結(jié)果

在hapmap數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明發(fā)明人選擇了包含在il22ra2(29.7kb)和所述基因的3’和5’的10kb內(nèi)并且在中國人中具有大于10％的次要等位基因頻率的snp。這些snp被分組成含有n＝10(區(qū)段i)、5(ii)、2(iii)、3(iv)、13(v)和3(vi)的6個相關(guān)(r²＝0.8)區(qū)段和4個單例，其位置如圖4中所示。在已在日本血吸蟲已流行至少40年的洞庭湖中捕魚至少20年的中國漁民(n＝268，176位對象具有輕度hf，92位患者具有嚴(yán)重hf)樣品中，本發(fā)明發(fā)明人對來自于每個區(qū)段的一個或兩個snp進行基因分型。他們發(fā)現(xiàn)，屬于2個區(qū)段的3個snp與hf相關(guān)。區(qū)段i中的snprs6570136gg(p＝0.007，or＝2.7(ci＝1.3-5.6))和rs7774663tt(p＝0.006，or＝2.5(1.3-4.7))兩者以及rs7749054tt(p＝0.045，or＝1.8(1.1-3.1))顯示出與hf的一定關(guān)聯(lián)性(表2)。在統(tǒng)計模型中引入的顯著協(xié)變量是性別(p<10-3，or＝6.9(2.8-17))、暴露(捕魚年數(shù))(p＝0.05，or＝1.02(1-1.05))、脾切除術(shù)(p＝0.008，or＝6.6(1.6-27))。在存在相同協(xié)變量的情況下在同一模型中同時測試兩個snp的多變量分析表明，當(dāng)在rs6570136(p＝0.007，or＝2.9(1.4-6))存在下進行測試時，snprs11154915tc是相關(guān)的(p＝0.04，or＝1.9(1-3.5))。有趣的是(參見在蘇丹人和巴西人中的研究)，snprs2064501顯示出與hf相關(guān)聯(lián)的趨勢，當(dāng)在回歸模型中引入其他snp時所述關(guān)聯(lián)性不降低。

最后，rs7749054的關(guān)聯(lián)性可能是由它與區(qū)段i中的snp的ld造成的，因為在snprs6570136或snprs7774663存在下，rs7749054與hf的關(guān)聯(lián)性完全喪失。

表2.il22ra2的與肝纖維變性相關(guān)聯(lián)的snp：中國漁民中的分析

然后，本發(fā)明發(fā)明人嘗試在來自于日本血吸蟲流行地區(qū)的農(nóng)民的第二個中國人樣品中重現(xiàn)這些結(jié)果。該樣品與漁民樣品的區(qū)別在于它是基于醫(yī)院的，從進行包括腹水、靜脈曲張流血和肝硬化的嚴(yán)重肝病護理的門診患者募集。92.2％的募集的患者生活在仍流行日本血吸蟲的地區(qū)，7.8％曾經(jīng)生活在血吸蟲流行的地區(qū)但在這些地區(qū)的傳播已在10至15年前中斷。這些對象中的一部分(86.5％)有以前hbv感染的跡象(20.9％aghbs+)，一位患者感染有hcv。因此，該第二樣品的大多數(shù)農(nóng)民中的肝病可能由血吸蟲和hbv感染兩者引起。

將在漁民樣品中測試的所有snp，在農(nóng)民樣品中進行基因分型(298位對象，97位對象具有輕度肝病，201位對象具有嚴(yán)重肝病)。觀察到來自于3個不同區(qū)段的4個snp與肝病的關(guān)聯(lián)性：snprs6570136gg、ga(p＝0.009，or＝2(1.2-3.3))，rs7774663tt、tc(p＝0.01，or＝2(1.2-3.3)，兩者在區(qū)段1中；snprs276466ga(p＝0.01，or＝2.2(1.2-4))，其在區(qū)段iv中；snprs1114915cc、ct(p＝0.04，or＝5.7(1.1-29.6))，其在區(qū)段v中(表3)。對于區(qū)段iii中的snprs202563aa、gg(p＝0.06)，和snprs2064501ct(p＝0.08)，也觀察到關(guān)聯(lián)的趨勢。這些關(guān)聯(lián)性試驗中的協(xié)變量是年齡(p＝0.05，or＝1.03(1-1.06))、性別(p＝0.02，or＝2.3(1.1-4.8))和患者生活在流行還是非流行地區(qū)(p＝0.09，or＝2)。

對來自于不同區(qū)段的snp進行的多變量分析指出了兩種可能的統(tǒng)計模型：一種模型包括區(qū)段i中的snpsrs6570136(或rs7774663)(p＝.03，or＝1.8(1.1-3))和區(qū)段v中的snprs11154915(p＝0.1，or＝4(0.8-21.2))；另一種模型包括snprs276466(p＝0.02，or＝2(1.1-3.8))和snprs11154915(p＝0.05，or＝9.2(1.1-80))。所述分析不能在這兩種模型之間做出區(qū)分。

表3：il22ra2的與肝纖維變性相關(guān)聯(lián)的snp：中國農(nóng)民中的分析

實施例3：所述關(guān)聯(lián)性向暴露于曼森氏血吸蟲的蘇丹和巴西人群的擴展

為了評估我們的觀察是否能夠擴展到被曼森氏血吸蟲感染的對象，我們在來自于蘇丹的樣品和來自于巴西的樣品中測試相同的snp。同樣地，蘇丹人樣品中顯著部分的對象與中國農(nóng)民中相同，也已被hbv感染，而只有非常少的巴西人具有hbv感染。

蘇丹人樣品(n＝202，144個輕度hf和58個嚴(yán)重hf)的基因分型顯示，snprs6570136gg(p＝0.01，or＝3.1(1.3-7.2))、rs7774663tt、tc(p＝0.01，or＝1.7(1-3.1)、rs11154915tt(p＝0.05，or＝6.2(1-35.3))顯示出與hf的關(guān)聯(lián)性，而對于snprs7749054tt(p＝0.07，or＝2(1-3.6))和rs2064501cc(p＝0.06，or＝2.71-7.3))也檢測到關(guān)聯(lián)的趨勢。參見表4.

表4.在中國人中檢測到的關(guān)聯(lián)性擴展至被曼森氏血吸蟲感染的蘇丹人

同樣地，在巴西人樣品(n＝161，119個輕度hf和42個嚴(yán)重hf)中對這些相同snp進行的基因分型，顯示出snprs6570136gg(p＝0.0001，or＝6(2.4-14.7))、rs7774663tt(p＝0.03，or＝3(1.4-6.8))和snprs7749054tt(p＝0.03，or＝2.8(1.2-5.6))與hf的關(guān)聯(lián)性。此外，rs11154915tt、tc顯示出與hf關(guān)聯(lián)的趨勢(p＝0.14，or＝2.4(0.9-6.5))。

參見表5：

表5.在被曼森氏血吸蟲感染的巴西人中關(guān)聯(lián)性的重現(xiàn)

在蘇丹人樣品中進行的多變量分析證實了snprs6570136、20564501和11154915的獨立的關(guān)聯(lián)性。最顯著的是，在多變量模型中證實了與rs11154915相關(guān)的高or。此外，帶有兩個snp的加重基因型的對象，在兩種模型中具有對于hf大于25的or。多變量分析顯示，在存在snprs6570136的情況下snprs7749054的關(guān)聯(lián)性喪失，證實了這種關(guān)聯(lián)性不獨立于snprs6570136。

概括來說，在所有測試的4個樣品中，屬于同一關(guān)聯(lián)性區(qū)段的snprs6570136gg和rs7774663tt與hf相關(guān)聯(lián)。在所有樣品中，snprs11154915tt、ct和rs2064501cc顯示出與hf相關(guān)聯(lián)的趨勢；更重要的是，這些趨勢通過多變量分析得以證實，顯示出這些snp獨立于snprs6570136起作用；將這兩個snp考慮在內(nèi)增加了snprs6570136與hf的關(guān)聯(lián)強度。

實施例4：il22ra2中的snp與對抗hcv治療的響應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)性

本發(fā)明發(fā)明人在被或曾被hcv基因型1或4感染的123位對象(69位對利巴韋林+ifn治療的響應(yīng)者，54位非響應(yīng)者)上進行了他們的遺傳分析。他們測試了使用hapmap數(shù)據(jù)在il22ra2中鑒定到的7個區(qū)段的每個中的至少一個snp。單變量分析顯示出與snprs2064501(區(qū)段vi，p＝0.013)和snprs1543509(區(qū)段vii，p＝0.012)的關(guān)聯(lián)性，但是也暗示了與snprs7774663、rs6570136(區(qū)段i，p<0.13)、snprs77449054(區(qū)段ii，p＝0.1)、snprs202563(區(qū)段iii，p＝0.07)、snprs28366(區(qū)段iv，p＝0.15)和snprs2064501(區(qū)段vi，p＝0.2)的可能的關(guān)聯(lián)性。這種與對治療的響應(yīng)可能相關(guān)聯(lián)的snp的大數(shù)量，可能是由被測試snp之間的相關(guān)性造成的，這也暗示了不同的snp可能彼此施加混雜影響。然后，進行逐步的多變量分析。

兩個一組地測試所有的snp，表明snprs202563和rs6570136與對治療的響應(yīng)的關(guān)聯(lián)性是等同的，但是snprs276466和rs28366被snprs6570136明顯排除在回歸模型之外。所有的試驗顯示，snprs1154915與對治療的響應(yīng)的關(guān)聯(lián)性，被回歸模型中其他snp(例如snprs6570136或snprs2064501或snprs1543509)的存在所增強。在snprs2064501或rs1543509存在下，rs6570136與對治療的響應(yīng)的關(guān)聯(lián)性喪失，當(dāng)時當(dāng)向模型添加snprs11154915時(模型中存在3個snp)，這種關(guān)聯(lián)性被重新獲得。這是由snprs11154915與snprs6570136(或區(qū)段i中的任何snp)之間的強連鎖不平衡造成的，結(jié)果snprs1154915tt響應(yīng)性基因型與區(qū)段i的非響應(yīng)性基因型100％關(guān)聯(lián)。因此，模型必須包括至少3個snp(rs11154915(p＝0.03)，rs7774663(或rs6570136，p＝0.03)和snprs2064501(p＝0.001))。最后，snprs1543509和來自于區(qū)段i的snp(p＝0.15)也進入該模型。

概括來說，本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，屬于il22ra2中4個不同區(qū)段的snp獨立地與對治療的響應(yīng)相關(guān)聯(lián)。重要的是，這些通過測試標(biāo)簽snp獲得的結(jié)果可以擴展到同一區(qū)段中的任何snp。隨后，預(yù)期區(qū)段i、v、vi和vii中即使不是所有也是大多數(shù)的snp，是對ifn+利巴韋林治療做出響應(yīng)的遺傳標(biāo)志物。還可以看出，這些鑒定到的區(qū)段中的3個與纖維變性的發(fā)展相關(guān)聯(lián)(尚未對區(qū)段vii中的snp就纖維變性進行試驗)。有趣的是，加重肝纖維變性的大多數(shù)基因型與對治療更好的響應(yīng)相關(guān)聯(lián)。

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