腦溢血易感性無創(chuàng)檢測試劑盒（agtr1等基因）的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測腦溢血易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測AGTR1基因上A1166C(rs5186)、ABCA1基因上Arg219Lys(rs2230806)、LPL基因上HindIII(rs320)的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應(yīng)組件等。本發(fā)明通過檢測與腦溢血發(fā)生密切相關(guān)的3個單核苷酸多態(tài)性位點的基因型從基因?qū)用鎭碓u估腦溢血發(fā)病的風(fēng)險級別，指導(dǎo)人群提早預(yù)防疾病發(fā)生。本發(fā)明采樣方法是口腔黏膜細(xì)胞采樣，無痛、無創(chuàng)、避免了交叉感染。測序檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，不必購置價格昂貴的進(jìn)口專用儀器，方法易普及推廣。
【專利說明】腦溢血易感性無創(chuàng)檢測試劑盒(AGTR1等基因)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本項目屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種腦溢血易感基因檢測試劑盒，根據(jù)檢測結(jié)果從基因?qū)用嬖u估腦溢血發(fā)病的風(fēng)險級別，為該病的預(yù)防提供建議指導(dǎo)。
【背景技術(shù)】 [0002]腦溢血(intracerebral hemorrhage, ICH)是指原發(fā)性非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)出血,是危害人類健康的主要疾病之一，發(fā)病率約為10-30/10萬。全球每年發(fā)病200萬人，占每年新發(fā)卒中的10-15%。流行病學(xué)資料表明，腦溢血多發(fā)生在40-70歲人群中，其中50歲以上的人群發(fā)病率最高，男性的發(fā)病率比女性高約25%。腦溢血的發(fā)生受到環(huán)境與遺傳因素的雙重影響，越來越多的研究顯示，第三代遺傳標(biāo)記一單核苷酸多態(tài)性(SNP)與腦溢血，尤其是有家族聚集傾向的腦溢血的關(guān)系密切?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)明確了一些基因多態(tài)性位點與腦溢血的相關(guān)性。
[0003]脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)基因位于8p22區(qū),共編碼475個氨基酸，是體內(nèi)參與脂質(zhì)代謝的一個關(guān)鍵酶，其主要功能是參與血漿乳糜微粒(CM)和低密度脂蛋白(LDL)中甘油三酯(TG)的分解，維持血脂的相對穩(wěn)定。LPL基因存在數(shù)十種變異，Hind III酶切多態(tài)性是LPL常見變異之一。該多態(tài)性位于LPL的第8內(nèi)含子，為近495位置上發(fā)生G代替T的突變，使Hind III酶切位點消失(T — G)，因而T和G等位基因又分別被稱為H+和H-等位基因。林慧瓊等人的研究發(fā)現(xiàn)，腦出血組H-等位基因分布頻率較對照組多，可能引起H-基因型個體中TG及LDL的升高，導(dǎo)致腦溢血發(fā)生的危險性增加，提示脂蛋白脂酶H-等位基因可能是腦溢血發(fā)病的危險性因素。
[0004]血管緊張素II受體-1(AGTRl)是G蛋白偶聯(lián)受體，主要分布在血管平滑肌和心臟，被血管緊張素II激活后主要影響血壓和水電解質(zhì)平衡。AGTRl編碼基因位于3q21_q25且只有單一拷貝，其編碼區(qū)及非編碼區(qū)存在著多處變異，與臨床關(guān)系較為密切的變異是AGTRl基因3’端非編碼區(qū)A1166C多態(tài)位點，該位點雖不影響基因的開放閱讀框架，但可以參與轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控，從而影響機體內(nèi)水鈉平衡代謝、醛固酮的分泌和血管收縮等，而這些均是導(dǎo)致腦出血的關(guān)鍵因素。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，AGTRl 1166位的AC基因型個體患腦溢血的危險度明顯高于AA基因型個體，顯示C等位基因可能是腦溢血的易患基因。
[0005]三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子I (ABCAl)基因位于9q22_q31，其編碼的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子 Al (ATP binding cassette transporter I, ABCA1)是一種整合膜蛋白，以 ATP 為能源，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出，后者結(jié)合到細(xì)胞表面的載脂蛋白，形成新生的高密度脂蛋白(HDL)。由于ABCAl在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(RCT)和HDL形成的起始步驟中起重要作用，因此，ABCAl被認(rèn)為是HDL代謝的限速因子。ABCAl第35外顯子的5155位點存在G — A多態(tài)性，使第1587位精氨酸(R)變?yōu)橘嚢彼?K)，即R1587K，該突變可導(dǎo)致體內(nèi)HDL水平降低，血甘油三酯水平上升，增加了腦溢血的發(fā)病風(fēng)險，顯示ABCAl R1587K是腦溢血的一個遺傳危險因素。[0006]鑒于LPL基因、AGTRl基因和ABCAl基因在腦溢血發(fā)病過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出受檢者的單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患腦溢血的高危人群，從而可采取有針對性的預(yù)防和治療措施，這對于降低腦溢血的發(fā)病率有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于AGTRl 基因上 A1166C (rs5186)、ABCA1 基因上 Arg219Lys (rs2230806)、LPL基因上Hind III (rs320)的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型可用來評估腦溢血發(fā)病風(fēng)險級別，本發(fā)明提供一種腦溢血基因無創(chuàng)檢測試劑盒。
[0008]該試劑盒包括:
檢測 AGTRl 基因上 A1166C (rs5186)、ABCAl 基因上 Arg219Lys (rs2230806)、LPL 基因上Hind III (rs320)的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；
PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)；
PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA測序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0009]本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:
PCR 反應(yīng)體系:10 XPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0010]PCR 產(chǎn)物純化體系:iu/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0011]測序反應(yīng)體系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 測序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0012]本試劑盒供一人份檢測使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0014]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0015]
實施例1.檢測試劑盒的使用 1、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0016]2、PCR擴增反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對:(1)AGTRl (A1166C)正向引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’
AGTRl (A1166C)反向引物:5’GTGGCTTTGCTTTGTCTTGTT3’
(2)ABCAl (Arg219Lys)正向引物:5’ GACCCAGCTTCCAATCTTCA3’
ABCAl (Arg219Lys)反向引物:5’ ACTCACCAGGATTGGCTTCA3’
(3)LPL (Hind III)正向引物:5’TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’
LPL (Hind III)反向引物:5’ CTTATGTTACTGGGCTTTCACC 3’
PCR擴增的反應(yīng)體系為:10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5ml ;25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq 酶 0.125ml、DNA 模板 Iml (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ml、ddH2019.175ml ；
反應(yīng)條件為:94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環(huán)28次，最后72°C延長5分鐘以上。
[0017]3、PCR擴增產(chǎn)物純化
使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去離子水 3.875ul。
[0018]在ABI2720型PCR擴增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min，72°C、20min。
[0019]4、DNA測序反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測序引物:
(1)AGTRl(A1166C)測序引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’
(2)ABCAl (Arg219Lys)測序引物:5’ GACCCAGCTTCCAATCTTCA 3’
(3)LPL (Hind III)測序引物:5’ TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’
反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA測序引物lul，去離子水2ul。
[0020]在ABI2720型PCR擴增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個循環(huán)的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0021]反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。
[0022]5、基因型分析
熟悉DNA測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。
[0023]實施例2.為人群進(jìn)行預(yù)防腦溢血基因無創(chuàng)檢測的服務(wù)
1.采樣及抽提DNA
由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用酚氯仿法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提。
[0024]2.基因型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的AGTRl基因上A1166C (rs5186)、ABCAl 基因上 Arg219Lys (rs2230806)、LPL 基因上 Hind III (rs320)的 3 個單核苷酸多態(tài)性位點分別進(jìn)行DNA測序，確定這3個SNPs位點的基因型。[0025]3.腦溢血高危人群風(fēng)險評估分析 通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具腦溢血風(fēng)險評估分析報告單。報告中詳細(xì)說明了受檢者 AGTRl 基因上 Al 166C (rs5186)、ABCA1 基因上 Arg219Lys (rs2230806)、LPL 基因上Hind III (rs320)的3個SNP位點基因檢測信息以及遺傳風(fēng)險評估結(jié)果。除此之外，根據(jù)受檢者的風(fēng)險級別，并由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明和解讀腦溢血基因無創(chuàng)檢測報告單。
【權(quán)利要求】
1.一種篩查腦溢血高危人群的基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于:檢測AGTRl基因上A1166C (rs5186)、ABCAl 基因上 Arg219Lys (rs2230806)、LPL 基因上 Hind III (rs320)的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對AGTRl基因上 A1166C (rs5186)、ABCAl 基因上 Arg219Lys (rs2230806)、LPL 基因上 Hind III(rs320)的3個單核苷酸多態(tài)性位點，能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測序引物是針對AGTRl基因上A1166C (rs5186)、ABCA1 基因上Arg219Lys (rs2230806)、LPL基因上Hind III (rs320)的3個單核苷酸多態(tài)性位點而設(shè)計，能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出上述3個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下:
(1)AGTRl (Al 166C)正向引物:5’ AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’
AGTRl (A1166C)反向引物:5’GTGGCTTTGCTTTGTCTTGTT3’ (2)ABCAl (Arg219Lys)正向引物:5’ GACCCAGCTTCCAATCTTCA3’ ABCAl (Arg219Lys)反向引物:5’ ACTCACCAGGATTGGCTTCA3’ (3)LPL (Hind III)正向引物:5’TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’
LPL (Hind III)反向引物:5’ CTTATGTTACTGGGCTTTCACC 3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下: (1)AGTRl(A1166C)測序引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’ (2)ABCAl (Arg219Lys)測序引物:5’ GACCCAGCTTCCAATCTTCA 3’ (3)LPL (Hind III)測序引物:5’ TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括: (1)?0?反應(yīng)體系:10父？0?反應(yīng)緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 產(chǎn)物純化體系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)測序反應(yīng)體系:25%BigDye mixlul，3.2uM DNA測序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul, 70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540647SQ201210235474
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月9日
【發(fā)明者】鄭俊斌 申請人:解碼（上海）生物醫(yī)藥科技有限公司