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一種檢測(cè)乳腺癌易感性的試劑盒的制作方法

文檔序號(hào):587902閱讀:270來源:國(guó)知局
專利名稱:一種檢測(cè)乳腺癌易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測(cè)用的試劑盒,尤其是一種檢測(cè)乳腺癌易感性的試 劑盒,通過同時(shí)檢測(cè)Foxp3基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)與CD14基因的單核苷酸多態(tài) 性位點(diǎn)來預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)乳腺癌的易感性。
背景技術(shù)
乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一,我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率逐年增高,發(fā)病率占 惡性腫瘤的7% 10%,全年約有120萬婦女發(fā)生乳腺癌,占女姓腫瘤的18%??茖W(xué)家已查明,BRCAl與BRCA2基因的突變很大程度上增加了女性患有乳腺癌的 可能性。在正常情況下,這兩種基因可傳遞控制細(xì)胞繁殖的信息。如果它們出現(xiàn)變異,細(xì)胞 就會(huì)無節(jié)制地繁殖,導(dǎo)致癌癥形成。但BRCAl和BRCA2在預(yù)測(cè)乳腺癌家族性風(fēng)險(xiǎn)上卻不能 令人滿意,因?yàn)閿y帶BRCAl與BRCA2基因突變的人群相對(duì)很少。人轉(zhuǎn)錄因子叉狀頭翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged helixtranscription factor Foxp3)基因定位于 Xpll. 23 Xql3. 3,屬于轉(zhuǎn)錄因子 forkhead/winged_he21ix 家族。Foxp3含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子,cDNA全長(zhǎng)為1869bp,其編碼的蛋白Foxp3/ Scurfin由431個(gè)氨基酸組成,N末端有鋅指蛋白、亮氨酸拉鏈和一個(gè)富含脯氨酸的區(qū) 域。fork2head結(jié)構(gòu)域位于羧基端(氨基酸殘基的337 420),通過該結(jié)構(gòu)域與DNA特 定位點(diǎn)結(jié)合,調(diào)節(jié)目的基因的活化和表達(dá)。于2003年被證實(shí)為⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (regulatoryT cell, Treg)的特異性標(biāo)志。免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制。在腫瘤學(xué)的研究領(lǐng)域中, Foxp3+CD4+CD25+Treg細(xì)胞在腫瘤免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮作用,F(xiàn)oxp3是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞特異性的表面標(biāo)志,是發(fā)育與功能的決定因素,在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。在 黑素瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤中都檢測(cè)到Foxp3高表達(dá)。Wolf等在對(duì)浸 潤(rùn)性乳腺癌中Foxp3的表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn),F(xiàn)oxp3表達(dá)的高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況密切相關(guān), 而與腫瘤大小、浸潤(rùn)程度、激素受體、孕酮水平、是否絕經(jīng)等無關(guān)(參見Wolf AM, Rumpold H, Wolf D, Gastl G, Reimer D, Jenewein N, Marth C, Zeimet AG. JClin Oncol. 2007 25 4499-4500.)。Zuo等在對(duì)超過200例的乳腺癌標(biāo)本研究中的發(fā)現(xiàn)與其他文獻(xiàn)的結(jié)果不一 致,認(rèn)為Foxp3可以抑制癌基因SKP2轉(zhuǎn)錄,降低乳腺癌的發(fā)病率,F(xiàn)oxp3基因突變會(huì)導(dǎo)致 SKP2表達(dá)上調(diào),增加患乳腺癌的概率(參見=Zuo T,Liu R,Zhang H,Chang X,Liu Y,Wang L,Zheng P, Liu Y. JClin Invest. 2007 117:3765-3773)。人⑶14基因位于人5號(hào)常染色體的長(zhǎng)臂端5q23_q31,約含有1338個(gè)核苷酸殘基。 從核苷酸的第76位到1200位,編碼一段有375個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。⑶14有兩個(gè)形態(tài),即mCD14和s⑶14。mCD14是一種55kDa的糖蛋白,通過糖基磷 脂酰肌醇(GPI)錨固于細(xì)胞膜。mCD14蛋白質(zhì)部分由包括356個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈 和一個(gè)由19個(gè)氨基酸殘基組成的末端多肽鏈構(gòu)成,其末端多肽為強(qiáng)疏水性性多肽鏈。人 ⑶14氨基酸序列中39 44位區(qū)段是與LPS結(jié)合的必要部分。s⑶14也是一種糖蛋白,其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與mCD14的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基本相同,(也有報(bào)道sCD14蛋白質(zhì)多肽鏈序列較mCD14 蛋白質(zhì)多肽鏈少8個(gè)氨基酸),但s⑶14不含有PI結(jié)構(gòu),故分子量較mCD14小,為48kDa左
右οmCD14主要分布在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的細(xì)胞表面,被激活的中性粒細(xì) 胞表面也有少量mCD14的存在。而內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等表面則未發(fā)現(xiàn)mCD14的存在。mCD14 還存在于中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)膜性分泌小體和嗜苯胺蘭顆粒中。sCD14則存在于正常人和動(dòng) 物的血漿(清)中,人血清中的正常濃度為2 5mg/ml,占血中全部⑶14含量的99%。mCD14是由含有CD14基因的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,自行轉(zhuǎn)錄、翻譯蛋白質(zhì)多肽 鏈,在高爾基復(fù)合體內(nèi)糖化后,其羧基端再與PI結(jié)合,并由PI的磷脂部分與細(xì)胞膜連接。 IL-I β和TNF- α能夠調(diào)節(jié)⑶14基因的表達(dá),促進(jìn)CDHmRNA的轉(zhuǎn)錄;FMLP和GM-CSF可刺 激中性粒細(xì)胞,使其細(xì)胞表面的mCD14增多。sCD14則是由單核細(xì)胞產(chǎn)生。單核細(xì)胞產(chǎn)生 sCD14的方式可能有兩種①由內(nèi)源性酶促反應(yīng)(由蛋白酶或磷脂酶催化),使mCD14分解 (脫去PI成分)、脫落形成。因?yàn)轶w外培養(yǎng)的單核細(xì)胞受LPS和IFN-r等刺激后,細(xì)胞表面 的mCD14明顯減少,而培養(yǎng)上清液中s⑶14的濃度卻明顯增加;②由⑶14基因轉(zhuǎn)錄、合成的 ⑶14蛋白,不進(jìn)行PI化或逃脫P(yáng)I化,直接分泌入血。⑶14(包括mCD14和s⑶14)的化學(xué)結(jié)構(gòu)為糖蛋白,其生物學(xué)功能主要是識(shí)別、結(jié)合 LPS或LPS/LBP復(fù)合物,介導(dǎo)LPS所致的細(xì)胞反應(yīng),在LPS性炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素休克等病理反 應(yīng)中起重要作用。最近的研究表明,⑶14也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程(參見=Subimerb C, Pinlaor S, Lulitanond V, Khuntikeo N, Okada S, McGrath MS, Wongkham S. Clin Exp Immunol. 2010161:471_479 ;Wu CC,Hsu Cff,Chen CD,Yu CJ,Chang KP,Tai DI,Liu HP,Su WH, Chang YS, Yu JS. Mol Cell Proteomics. 2010 J9 :1100_1117·)。rs2569190位于⑶14基因上5,UTR,為A/G多態(tài),在亞洲人群中該多態(tài)的頻率分布 為 AO. 500,GO. 500,基因型 A/AO. 205、A/GO. 590、G/GO. 205。rs2569190 位點(diǎn)不同的基因型 可以通過影響⑶14基因的轉(zhuǎn)錄水平,從而對(duì)⑶14的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。SNP (Single nucleotide polymorphism),即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記,是一類基于單 堿基變異引起的DNA多態(tài)性,被遺傳界稱為第三代遺傳標(biāo)記。主要是指由基因組核苷酸水 平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性,包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換,以及單堿基的插入/缺失等。它 是基因組中最為廣泛存在的的一類多態(tài)性標(biāo)記,占大約90%。這些基因組序列變異可以導(dǎo) 致個(gè)體間表型的差異以及不同個(gè)體對(duì)疾病、特別是復(fù)雜疾病的易感性和對(duì)環(huán)境因素、藥物 反應(yīng)的差異。如果可以研發(fā)一種通過檢測(cè)人Foxp3基因和⑶14基因檢測(cè)乳腺癌易感性的方法 將有助于乳腺癌的預(yù)防和治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種檢測(cè)乳腺癌易感性的試劑盒。本發(fā)明的原理為發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和⑶14 基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性與人體對(duì)乳腺癌易感性相關(guān),可用于評(píng)估個(gè)體對(duì)乳 腺癌的易感性的基礎(chǔ);并且,當(dāng)被檢測(cè)DNA的Foxp3基因上的rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)基因型 為雜合CT型,為乳腺癌易感型;被檢測(cè)DNA的⑶14基因上的rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)基因型攜帶有G型,為乳腺癌易感型;同時(shí)為Foxp3基因rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)為雜合CT型,⑶14 基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)攜帶G型的,罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)最高。為達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種檢測(cè)乳腺癌易感性的試劑盒,包 括檢測(cè)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)的特異 性引物以及檢測(cè)所述兩個(gè)SNP位點(diǎn)的特異性內(nèi)切酶。上述技術(shù)方案中,所述試劑盒中特異性引物對(duì)是指針Foxp3基因上rs2294021號(hào) SNP位點(diǎn)和⑶14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì),能夠特異性擴(kuò)增包含F(xiàn)oxp3基因上 rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。所述 特異性引物優(yōu)選為SED ID NO :1所述堿基序列、SED ID NO 2所述堿基序列、SED ID NO 3 所述堿基序列和SEDID NO :4所述堿基序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的引物不 限于這兩對(duì)引物。上述技術(shù)方案中,所述試劑盒中的特異性內(nèi)切酶是指針對(duì)Foxp3基因上 rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)而選用,能夠通過酶切片段長(zhǎng) 度檢測(cè)出這兩個(gè)SNPs位點(diǎn)乳腺癌易感基因型的限制性內(nèi)切酶,優(yōu)選為內(nèi)切酶Haelll。上述技術(shù)方案中,所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件(Taq酶、dNTP混合 液、MgCl2溶液、PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水)及酶切常規(guī)組件(反應(yīng)緩沖液、去離子水)。上述技術(shù)方案中,本發(fā)明試劑盒中PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件的組分和含量為,每 10 μ LPCR擴(kuò)增體系中包括1 μ 1 10XPCR反應(yīng)緩沖液,0. 5μ 1 25mMMgCl2溶液,0. 2 μ 1 25mM dNTP混合液,IU Taq DNA聚合酶,余量為去離子水。上述技術(shù)方案中,本發(fā)明試劑盒中酶切常規(guī)組件的組分和含量為,每20μ 1酶切 反應(yīng)體系中包括2μ1 IOX內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用,本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明通過檢測(cè)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上rs2569190 號(hào)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌易感性的評(píng)估。2、本發(fā)明所述試劑盒可同時(shí)檢測(cè)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD 14基 因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性;一步PCR擴(kuò)增可同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)目標(biāo)基因序列;單一種 類內(nèi)切酶通過一步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)兩段目標(biāo)基因序列的酶切。3、本發(fā)明相對(duì)于其他方法更為簡(jiǎn)便、快速。


圖1為實(shí)施例一中步驟3所得酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一一種檢測(cè)乳腺癌易感性試劑盒,其組分和含量包括1 μ 1 10XPCR反應(yīng)緩沖液, 0. 5μ 1 25mM MgCl2 溶液,0. 2 μ 1 25mM dNTP 混合液,0. 2 μ l(5Units/y l)Taq DNA 聚合酶, ΙΟμΜ特異性引物對(duì)(四條)各0. 2ul,0. 5μ 1 HaeIII內(nèi)切酶(10U/ul),2 μ 1 IOX內(nèi)切酶 反應(yīng)緩沖液,去離子水9 μ 1。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用,試劑盒保存溫度為-20°C。
上述試劑盒的使用方法包括以下步驟步驟1:DNA模板的抽取使用血液基因組DNA提取系統(tǒng)(非離心柱型)提取外周血的基因組DNA。步驟2 =PCR反應(yīng),目的片段的復(fù)制使用可檢測(cè)乳腺癌易感性的PCR檢測(cè)試劑盒,其中,含有下列引物有義引物2 5,-ACACACAATCCATAAAGTCACC-3,(SED ID NO 1) Tm 值為 56°C反義引物2 :5,-ATCTCCATGCCCTAAGAAGGCCA—3‘(SED ID NO 2) Tm 值為 56 °C有義引物1 :5,-CCCCAAGACCCTACACTCAC 3'(SED ID NO 3) Tm 值為 56 °C反義引物 1 5,-AGGACACTGCCAGGAGACAC-3,(SED ID NO :4) Tm 值為 56°C有義引物1,反義引物1特異性地復(fù)制Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性 的片段,有義引物2,反義引物2特異性地復(fù)制⑶14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性的 片段。PCR反應(yīng)體系總體積為10 μ 1,包括Iul 10XPCR反應(yīng)緩沖液,0. 5 μ 1 25mMMgCl2 溶液,0. 2μ1 25mM dNTP 混合液,0. 2 μ 1 (5Units/μ 1) Taq DNA 聚合酶,10 μ M 特異性引物 對(duì)(四條)各0. 2 μ 1,去離子水7. 3 μ 1。在Biometra TprofessionalPCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反 應(yīng),反應(yīng)條件是94°C 5分鐘、進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的94°C 40秒、56°C 40秒、72°C 40秒,72°C 10 分鐘。步驟3 限制性內(nèi)切酶酶切使用可檢測(cè)乳腺癌易感性的PCR檢測(cè)試劑盒。在步驟2所得產(chǎn)物加入試劑盒中所 包含IOX內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液2 μ 1,HaeIII內(nèi)切酶0. 5 μ 1 (IOU/μ 1),去離子水7. 5 μ 1,在 37°C條件下水浴3小時(shí)。步驟4 =SNP基因型分析3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)步驟3所得酶切產(chǎn)物,電泳圖如圖1所示。根據(jù)凝膠成像顯示不同條帶,所代表的基因型分析如下
權(quán)利要求
一種檢測(cè)乳腺癌易感性的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒包括檢測(cè)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物以及檢測(cè)所述兩個(gè)SNP位點(diǎn)的特異性內(nèi)切酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,所述特異性引物為SEDID NO: 1所述堿 基序列、SED ID NO: 2所述堿基序列、SED ID NO: 3所述堿基序列和SED ID NO: 4所述堿 基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,檢測(cè)所述兩個(gè)SNP位點(diǎn)的特異性內(nèi)切酶 為內(nèi)切酶Haelll。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī) 組件Taq酶、dNTP混合液、MgC12溶液、PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水;酶切常規(guī)組件反應(yīng)緩 沖液、去離子水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒,其特征在于,所述試劑盒中PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件 的組分和含量為,每10 μ LPCR擴(kuò)增體系中包括IyL IOX PCR反應(yīng)緩沖液,0. 5 μ L 25mM MgC12溶液,0. 2yL 25mM dNTP混合液,IU Taq DNA聚合酶,余量為去離子水。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒,其特征在于,試劑盒中酶切常規(guī)組件的組分和含量 為,每20yL酶切反應(yīng)體系中包括2yL IOX內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測(cè)用的試劑盒,尤其是一種檢測(cè)乳腺癌易感性的試劑盒,所述試劑盒包括檢測(cè)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物以及檢測(cè)所述兩個(gè)SNP位點(diǎn)的特異性內(nèi)切酶。本發(fā)明通過檢測(cè)Foxp3基因上rs2294021號(hào)SNP位點(diǎn)和CD14基因上rs2569190號(hào)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌易感性的評(píng)估。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101985662SQ201010583569
公開日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者周翊峰, 王艷萍, 鄧杰瓊, 郁曉 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)
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