專利名稱：雜交組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于雜交例如用于原位雜交(ISH)的含水組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及DNA和RNA分子檢測領域。具體地講，本發(fā)明涉及 細胞學、組織學和分子生物學領域。一方面，本發(fā)明涉及在核酸之間雜交期間所需能量(例 如孵育時間和熱)，例如在原位雜交靶向DNA和RNA中。背景和描述當堿基以一種特定方式配對(A+T或G+C)時，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)通過相對鏈的堿基 之間氫鍵結(jié)合而達到穩(wěn)定。這種互補堿基配對(雜交)對于涉及核酸的所有過程來說都是 至關重要的。在雜交的基本實例中，核酸片段或序列與互補核酸片段或序列結(jié)合。例如，雜交可 使用核酸探針，所述探針經(jīng)設計用于與靶標(例如DNA或RNA)結(jié)合或“雜交”。一類雜交， 原位雜交(ISH)，包括與標本中的靶標雜交，其中所述標本可以在體內(nèi)，或例如固定或粘附 在載玻片上。探針可被標記，以便通過使用熒光或明視野顯微鏡/掃描儀來識別探針_靶 標雜合體。片段或序列通常是雙鏈或單鏈核酸，例如DNA、RNA或類似物。在某些實施方案 中，片段或序列可以是用放射性標記(例如31P、33P或32S)、非放射性標記(例如地高辛配基 和生物素)或熒光標記而標記的探針。這種標記的探針可用于檢測靶序列中的遺傳異常， 提供有關例如出生前障礙、癌癥和其它遺傳性或感染性疾病的有價值信息。核酸雜交測定的效率和準確度主要取決于以下3個因素中的至少一個a)變性 (即例如兩條核酸鏈的分離)條件，b)復性(即例如兩條核酸鏈重新退火)條件，和c)雜 交后的洗滌條件。傳統(tǒng)的雜交實驗，例如ISH測定，使用含甲酰胺的溶液，以使雙鏈核酸鏈變性。甲 酰胺是一種溶劑，它通過置換松散而均勻結(jié)合的水合分子而對例如DNA、RNA及其類似物的 螺旋狀態(tài)具有去穩(wěn)定效應。此外，甲酰胺通過堿基Watson-Crick結(jié)合位點的‘甲酰胺化’而 使DNA、RNA及其類似物的卷曲狀態(tài)穩(wěn)定。然而，甲酰胺是有毒有害物質(zhì)，其使用和廢料都受 到嚴格的法規(guī)管制。此外，盡管已經(jīng)接受使用甲酰胺作為雜交標準技術，但是使用甲酰胺受到完成雜 交所需長時間的限制，這取決于條件和所用核酸片段或序列。例如，變性步驟之后接著是更 耗時間的雜交步驟，所述步驟例如在傳統(tǒng)的熒光原位雜交(FISH)方案中需要14-24小時， 并且甚至至多需要72小時。傳統(tǒng)雜交時間的實例見

圖1和圖2。兩條核酸鏈互補鏈的重新退火步驟(即雜交)是使用雜交的測定中最耗時間的。 迄今為止，認為使用干擾核酸堿基Watson-Crick結(jié)合位點并因而破壞互補核酸堿基間氫 鍵的離液劑，例如甲酰胺、胍離子(guanidinium hydrogen)和尿素，是降低互補鏈的解鏈溫 度(Tm)的唯一方式。然而，盡管使用離液劑降低了 Tm，與在不含離液劑的含水溶液中進行 的雜交相比，這些試劑看來能明顯延長雜交時間。此外，除了長時間處理的不利因素之外， 使用高濃度甲酰胺看來會導致細胞結(jié)構(gòu)、核結(jié)構(gòu)和/或染色體結(jié)構(gòu)的形態(tài)學上的破壞。最 終，認為甲酰胺對人類是有毒有害的化學品。
本發(fā)明提供與現(xiàn)有技術相比的若干潛在優(yōu)勢，例如更快的雜交時間，更低的雜交溫度和毒性更小的雜交溶劑。發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供可導致至少一個以下優(yōu)勢的組合物高靈敏度、技術簡 單、靈活而可靠的雜交程序，以及快速分析。在某些實施方案中，例如，一個優(yōu)勢可以是通過 比用現(xiàn)有技術方法程度大得多地改變雜交反應的溫度，提供定制雜交時間的能力。例如，雜 交可在室溫下進行。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法降低了雜交所需能量。本發(fā)明的組合 物和方法可用于任何雜交技術。本發(fā)明的組合物和方法也可用于使用堿基配對而雜交或結(jié) 合的任何分子系統(tǒng)，例如，DNA、RNA、PNA、LNA及其合成和天然類似物。本發(fā)明的另一個目的是提供保持生物樣品形態(tài)學的雜交方法和組合物。本發(fā)明的 又一個目的是提供無毒雜交組合物和程序。本發(fā)明的還一個目的是提供低蒸發(fā)雜交技術。 本發(fā)明的另一個目的是提供可用20x物鏡檢測的雜交技術。本發(fā)明的還一個目的是提供具 有低探針濃度的組合物。本發(fā)明的又一個目的是減少和/或消除對封閉非特異性結(jié)合的需 要。本發(fā)明的組合物和方法也可允許使用多相探針，而無需封閉、去除或用其它方法破壞例 如生物樣品中的重復序列的結(jié)合。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸雜交方法和組合物可用于基因組DNA、染色體、 染色體片段、基因以及與正常情況或疾病相關的染色體畸變例如易位、缺失、擴增、插入、突 變或倒位的體內(nèi)或體外分析。此外，所述方法和組合物可用于檢測感染性因子以及RNA例 如mRNA及其互補DNA(cDNA)表達水平的改變。其它應用包括對以下進行體內(nèi)或體外分析信使RNA(mRNA)、病毒RNA、病毒DNA、 小干擾RNA (siRNA)、小核RNA (snRNA)、非編碼RNA (ncRNA,例如tRNA和rRNA)、轉(zhuǎn)移信 使RNA(tmRNA)、微小RNA(miRNA)、piwi-相互作用RNA(piRNA)、長的非編碼RNA、小核仁 RNA(SnoRNA)、反義RNA、雙鏈RNA(dsRNA)、甲基化和其它堿基修飾、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、 拷貝數(shù)變異(CNV)以及單獨或與未標記核酸組合的標記核酸(其帶有例如放射性同位素、 熒光分子、生物素、地高辛配基(DIG)或抗原標記)。本發(fā)明的核酸雜交方法和組合物可用于核酸的體內(nèi)或體外分析，使用例如以下技 術PCR、原位PCR、RNA印跡、DNA印跡、流式細胞術、放射自顯影、熒光顯微鏡術、化學發(fā)光、 免疫組織化學、虛擬核型(virtual karyotype)、基因測定、DNA微陣列(例如陣列比較基因 組雜交(陣列CGH))、基因表達譜、基因ID、疊瓦陣列(Tiling array)、凝膠電泳、毛細管電 泳和原位雜交例如FISH、SISH、CISH。本發(fā)明的方法和組合物可用于體外和體內(nèi)樣品，例如 骨髓涂片、血涂片、石蠟包埋的組織制備物、經(jīng)酶解的組織樣品、骨髓、羊水細胞、細胞離心 (cytospin)制備物、印跡(imprint)等。在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于使至少一種分子與靶標雜交的方法和組合 物。本發(fā)明可例如不用甲酰胺或減少對甲酰胺的依賴性。例如，本發(fā)明的方法和組合物可 降低雜交的能障，而不用甲酰胺。降低能障可減少雜交所需時間和/或降低雜交所需溫度。 例如，本發(fā)明可允許在較低溫度雜交，或可允許在較高溫度快速雜交。因此，在某些方面，本 發(fā)明克服了雜交測定中的主要耗時步驟。本發(fā)明一方面是用于雜交的組合物或溶液。用于本發(fā)明的組合物包含含水組合物，其含有至少一種核酸序列和足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種極性非質(zhì)子 溶劑。變性雙鏈核苷酸序列的有效量是能夠雜交的量。例如，用于測定極性非質(zhì)子溶劑的 量是否對雜交有效的一種方式是，確定所述極性非質(zhì)子溶劑，當用于本文所述的雜交方法 和組合物例如實施例1時，是否能產(chǎn)生可檢測信號和/或擴增的核酸產(chǎn)物。極性非質(zhì)子溶劑有效量 的非限制性實例包括例如約至約95% (ν/ν)。在某些 實施方案中，極性非質(zhì)子溶劑的濃度為5%至60% (ν/ν) 0在其它實施方案中，極性非質(zhì)子 溶劑的濃度為10%至60% (ν/ν) 0在再一些實施方案中，極性非質(zhì)子溶劑的濃度為30%至 50% (ν/ν)。至 5%、5% 至 10%、10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、或50%至60% (ν/ν)的濃度也是合適的。在某些實施方案中，極性非質(zhì)子溶劑的濃 度可以是0.1%、0.25%、0.5%、1%、2%、3%、4%或5% (ν/ν)。在其它實施方案中，極性 非質(zhì)子溶劑的濃度可以是 7%、7. 5%、8%、8. 5%,9%,9. 5%U0%U0. 5%U1%>11. 5%, 12%U2. 5% ,13% ,13. 5% ,14% ,14. 5% ,15% ,15. 5% ,16% ,16. 5% ,17% ,17. 5% ,18%, 18. 5%、19%、19. 5% 或 20% (ν/ν)。依據(jù)本發(fā)明的另一方面，包含極性非質(zhì)子溶劑的含水組合物具有降低的毒性。比 傳統(tǒng)雜交溶液毒性更低的組合物可包含組合物，條件是所述組合物不含甲酰胺，或條件 是所述組合物含有小于10%、或小于5%、或小于2%、或小于1%、或小于0. 5%、或小于 0. 1%、或小于0.05%、或小于0.01%的甲酰胺。一種低毒的組合物也可包含組合物，條件 是所述組合物不含二甲基亞砜(DMSO)，或條件是所述組合物含有小于10%、5%、2%或小 于1%、或小于0. 5%、或小于0. 1%、或小于0. 05%、或小于0. 01% DMS0。在本發(fā)明的一方面，可根據(jù)極性非質(zhì)子溶劑的Hansen溶度參數(shù)，來選擇用于本 發(fā)明的合適極性非質(zhì)子溶劑。例如，合適的極性非質(zhì)子溶劑可具有的分散溶度參數(shù)介于 17. 7-22. OMPa172之間，極性溶度參數(shù)介于13_23MPa"2之間，氫鍵溶度參數(shù)介于3-13MPa"2 之間。依據(jù)本發(fā)明的一方面，用于本發(fā)明的合適極性非質(zhì)子溶劑是環(huán)狀化合物。環(huán)狀化 合物具有環(huán)狀基本結(jié)構(gòu)。實例包括本文所公開的環(huán)狀化合物。在其它實施方案中，所述極 性非質(zhì)子溶劑可選自下式1-4:
權利要求
1.一種雜交組合物，所述組合物包含至少一種核酸序列、足以變性雙鏈核苷酸序列 的有效量的至少一種極性非質(zhì)子溶劑和雜交溶液，其中所述極性非質(zhì)子溶劑不是二甲基亞 砜(DMSO)。
2.權利要求1的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑濃度以體積計約為至95%。
3.權利要求1或2的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑濃度以體積計為5%至 10%。
4.權利要求1或2的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑濃度以體積計為10%至 20%。
5.權利要求1或2的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑濃度以體積計為20%至 30%。
6.權利要求1-5中任一項的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑是無毒的。
7.權利要求1-6中任一項的雜交組合物，條件是所述組合物不含甲酰胺。
8.權利要求6的雜交組合物，條件是所述組合物含有小于10%甲酰胺。
9.權利要求8的雜交組合物，條件是所述組合物含有小于2%甲酰胺。
10.權利要求9的雜交組合物，條件是所述組合物含有小于甲酰胺。
11.權利要求1-10中任一項的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑具有內(nèi)酯、砜、 腈、亞硫酸和/或碳酸官能團。
12.權利要求1-11中任一項的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑的分散溶度 參數(shù)介于17. 7-22. OMPa"2之間，極性溶度參數(shù)介于13_23MPa"2之間，氫鍵溶度參數(shù)介于 3-13MPa1/2 之間。
13.權利要求1-12中任一項的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑具有環(huán)狀基本結(jié)構(gòu)。
14.權利要求1-13中任一項的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑選自其中X為0，Rl為烷基二基，和其中X是任選的，如果存在則選自0或S，其中Z是任選的，如果存在則選自0或S，其中A和B獨立地為0或N或S或烷基二基的一部分或伯胺，其中R為烷基二基，
15.權利要求1-14中任一項的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑選自乙酰苯胺、 乙腈、N-乙?；量┩橥?-氨基吡啶、苯甲酰胺、苯并咪唑、1，2，3_苯并三唑、二氧化丁二烯、碳酸2，3_ 丁二醇酯、Y-丁內(nèi)酯、己內(nèi)酯(O、氯馬來酸酐、2-氯環(huán)己酮、碳酸氯代 乙二醇酯、氯硝甲烷、檸康酸酐、巴豆酸內(nèi)酯、5-氰基-2-硫尿嘧啶、環(huán)丙腈、硫酸二甲酯、二 甲砜、1，3-二甲基-5-四唑、1，5-二甲基四唑、1，2-二硝基苯、2，4_ 二硝基甲苯、二苯砜、 1，2_ 二硝基苯、2，4_ 二硝基甲苯、二苯砜、ε -己內(nèi)酰胺、乙磺酰氯、亞膦酸二乙酯、N-乙 基四唑、碳酸亞乙酯、三硫代碳酸亞乙酯、硫酸乙二醇酯、亞硫酸乙二醇酯、糠醛、2-呋喃甲 腈、2-咪唑、靛紅、異噁唑、丙二腈、4-甲氧基芐腈、1-甲氧基-2-硝基苯、α溴代特窗酸甲 酯、1-甲基咪唑、N-甲基咪唑、3-甲基異噁唑、N-甲基嗎啉-N-氧化物、苯甲砜、N-甲基吡 咯烷酮、甲基環(huán)丁砜、4-甲苯磺酸甲酯、3-硝基苯胺、硝基苯并咪唑、2-硝基呋喃、1-亞硝 基-2-吡咯烷酮、2-硝基噻吩、2-噁唑烷酮、9，10-菲醌、N-苯基悉尼酮、鄰苯二甲酸酐、皮 考啉腈(2-氰基吡啶)、1，3_丙磺酸內(nèi)酯、β-丙醇酸內(nèi)酯、碳酸異丙二醇酯、4Η-吡喃-4-硫 酮、4Η-吡喃-4-酮(γ -吡喃酮)、噠嗪、2-吡咯烷酮、糖精、琥珀腈、對氨基苯磺酰胺、環(huán)丁 砜、2，2，6，6-四氯環(huán)己酮、四氫噻喃氧化物、四氫噻吩砜(環(huán)丁砜)、噻唑、2-硫尿嘧啶、3，3， 3-三氯丙烯、1，1,2-三氯丙烯、1，2，3-三氯丙烯、硫雜環(huán)丁烷-二氧化物和硫雜環(huán)丁烷。
16.權利要求1-14中任一項的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑選自
17.權利要求1-14中任一項的雜交組合物，其中所述極性非質(zhì)子溶劑是
18.權利要求1-17中任一項的雜交組合物，所述組合物還包含選自以下的至少一種額 外組分緩沖劑、鹽、促進劑、螯合劑、去垢劑和封閉劑。
19.權利要求18的雜交組合物，其中所述促進劑是硫酸葡聚糖，所述鹽是NaCl和/或 磷酸緩沖液。
20.權利要求19的雜交組合物，其中硫酸葡聚糖濃度是5%至40%，NaCl濃度是OmM 至1200mM，和/或所述磷酸緩沖液濃度是OmM至50mM。
21.權利要求20的雜交組合物，其中硫酸葡聚糖濃度是10%至30%，NaCl濃度是 300mM至600mM，和/或所述磷酸緩沖液濃度是5mM至20mM。
22.權利要求18的雜交組合物，其中所述促進劑選自甲酰胺、甘油、丙二醇、1，2_丙二 醇、二甘醇、乙二醇、二醇和1，3_丙二醇，所述緩沖劑是檸檬酸緩沖劑。
23.權利要求22的雜交組合物，其中所述甲酰胺濃度是0.1_5%，甘油、丙二醇、1，2_丙 二醇、二甘醇、乙二醇、二醇和1，3_丙二醇的濃度是0. 至10%，所述檸檬酸緩沖劑濃度 是 ImM 至 50mM。
24.權利要求18的雜交組合物，其中所述封閉劑選自人類總DNA、鯡魚精子DNA、鮭魚 精子DNA和小牛胸腺DNA。
25.權利要求對的雜交組合物，其中所述人類總DNA、鯡魚精子DNA、鮭魚精子DNA和小 牛胸腺DNA的濃度是0. 01-10 yg/μ L·
26.權利要求1-25中任一項的雜交組合物，所述組合物包含40%的至少一種極性非質(zhì) 子溶劑、10%硫酸葡聚糖、300mM NaCl和5mM磷酸緩沖液。
27.權利要求1-25中任一項的雜交組合物，所述組合物包含15%的至少一種極性非質(zhì) 子溶劑、20%硫酸葡聚糖、600mM NaCl、IOmM磷酸緩沖液和0. 1 μ g/μ 1人類總DNA。
28.權利要求1-25中任一項的雜交組合物，所述組合物包含15%的至少一種極性非質(zhì) 子溶劑、20%硫酸葡聚糖、600mM NaCl、IOmM檸檬酸緩沖劑pH 6. 2以及0. 1 μ g/μ 1鯡魚精 子DNA、或鮭魚精子DNA、或小牛胸腺DNA、或0. 5%甲酰胺、或1 %乙二醇、或1 % 1，3_丙二
29.權利要求1- 中任一項的雜交組合物，所述組合物在室溫下包含不止一相。
30.權利要求四的雜交組合物，所述組合物在室溫下包含兩相。
31.權利要求四的雜交組合物，所述組合物在室溫下包含三相。
32.一種核酸序列的雜交方法，所述方法包括 -提供第一核酸序列，-提供第二核酸序列，-提供包含足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種極性非質(zhì)子溶劑的雜交組合 物，和-將所述第一、第二第二核酸序列和所述雜交組合物混合在一起，其時間至少足以使所 述第一和第二核酸序列雜交，其中所述極性非質(zhì)子溶劑不是二甲基亞砜(DMSO)。
33.一種核酸序列的雜交方法，所述方法包括 -提供在原位生物樣品中的第一核酸序列，和-將包含第二核酸序列和足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種極性非質(zhì)子溶劑的雜交組合物用于所述第一核酸序列，其時間至少足以使所述第一和第二核酸序列雜 、-父，其中所述極性非質(zhì)子溶劑不是二甲基亞砜(DMSO)。
34.一種核酸序列的雜交方法，所述方法包括 -提供第一核酸序列，-提供第二核酸序列，-提供權利要求1-31中任一項的雜交組合物，和-將所述第一、所述第二核酸序列與所述雜交組合物混合在一起，其時間至少足以使所 述第一和第二核酸序列雜交。
35.一種核酸序列的雜交方法，所述方法包括 -提供第一核酸序列，和-將權利要求1-31中任一項的雜交組合物用于所述第一核酸序列，其時間至少足以使 所述第一和第二核酸序列雜交。
36.權利要求30或31的方法，其中所述極性非質(zhì)子溶劑按照權利要求2-6或11-17中 任一項定義。
37.權利要求30-36中任一項的方法，其中提供足夠量的能量使所述第一和第二核酸 雜交。
38.權利要求37的方法，其中通過加熱所述雜交組合物和核酸序列而提供能量。
39.權利要求38的方法，其中通過使用微波、熱浴、加熱板、加熱線、珀耳帖元件、感應 加熱或加熱燈來進行所述加熱步驟。
40.權利要求32-39中任一項的方法，其中所述第一核酸序列是雙鏈的，而所述第二核 酸是單鏈的。
41.權利要求32-40中任一項的方法，其中所述變性和雜交步驟單獨發(fā)生。
42.權利要求32-41中任一項的方法，其中所述雜交步驟包括加熱和冷卻所述雜交組 合物和核酸序列的步驟。
43.權利要求32-42中任一項的方法，所述雜交步驟需要不到8小時。
44.權利要求43的方法，其中所述雜交步驟需要不到1小時。
45.權利要求44的方法，其中所述雜交步驟需要不到30分鐘。
46.權利要求45的方法，其中所述雜交步驟需要不到15分鐘。
47.權利要求46的方法，其中所述雜交步驟需要不到5分鐘。
48.權利要求32-47中任一項的方法，其中所述冷卻步驟需要不到1小時。
49.權利要求48的方法，其中所述冷卻步驟需要不到30分鐘。
50.權利要求49的方法，其中所述冷卻步驟需要不到15分鐘。
51.權利要求50的方法，其中所述冷卻步驟需要不到5分鐘。
52.權利要求32-51中任一項的方法，其中所述第一核酸序列是在生物樣品中。
53.權利要求52的方法，其中所述生物樣品是細胞學或組織學樣品。
54.權利要求32-53中任一項的方法，其中所述雜交組合物在室溫下包含一相。
55.權利要求32-53中任一項的方法，其中所述雜交組合物在室溫下包含多相。
56.權利要求55的方法，其中所述雜交組合物在室溫下包含兩相。
57.權利要求55或56的方法，其中所述雜交組合物的各相混合在一起。
58.權利要求32-57中任一項的方法，所述方法還包括封閉步驟。
59.雜交組合物在雜交測定中的用途，所述組合物包含以體積計在1-95%之間的至少 一種極性非質(zhì)子溶劑。
60.權利要求59的組合物的用途，其中所述雜交組合物如權利要求1-31中任一項中所述。
全文摘要
本發(fā)明提供用于使至少一種分子與靶標雜交的方法和組合物。本發(fā)明可以例如在雜交中不用甲酰胺或減少對甲酰胺的依賴性。用于本發(fā)明的組合物包含含水組合物，其含有至少一種核酸序列和足以變性雙鏈核苷酸序列的有效量的至少一種極性非質(zhì)子溶劑。
文檔編號C12Q1/68GK102084004SQ200980121810
公開日2011年6月1日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權日2008年5月27日
發(fā)明者C·M·漢森, K·H·皮特森, S·H·馬希森, T·S·普爾森 申請人:丹麥達科有限公司