專利名稱：用于檢測和/或分類靶標的捕獲劑以及相關(guān)方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文公開的內(nèi)容涉及在樣品(如生物樣品)中檢測和/或分類一個或多個靶標， 特別是生物標記物。更特別地，其涉及用于檢測和/或分類靶標的捕獲劑和相關(guān)方法和系 統(tǒng)。
背景技術(shù)：
在生物分子分析領(lǐng)域，靶標，特別是生物標記物的高靈敏度檢測已成為一種挑戰(zhàn)， 特別是在針對復(fù)數(shù)個靶標的檢測和/或針對某尺寸的或者以低濃度存在于樣品中的靶標 的檢測時。無論是對于病理檢查還是基本生物學研究，有若干種方法通常被用于各種類別 的生物材料和生物分子的檢測。一些在實驗室中最通常用于單一生物靶標檢測的技術(shù)包括凝膠電泳，聚丙烯酰胺 凝膠電泳(PAGE)，蛋白質(zhì)印跡，熒光原位雜交(FISH)，熒光活化細胞分類(FACS)，聚合酶鏈 式反應(yīng)(PCR)，和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。這些方法能夠在生物樣品(比如組織)中檢 測一個或多個生物標記物，并且還適用于診斷目的。由申請人研發(fā)的連續(xù)多核苷酸編碼方法提供了超越現(xiàn)有技術(shù)的改進，特別是，其 允許對靶標進行高靈敏度和選擇性多重檢測。
發(fā)明內(nèi)容
概述此處提供的是多核苷酸編碼的捕獲劑，特別是模塊化的捕獲劑以及相關(guān)的陣列方 法和系統(tǒng)，在若干實施方式中，通過可變以及通用的模塊化分子工具，其容許大量靶標系列 的選擇性及靈敏檢測。特別地，此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑包括以受控方式結(jié)合和脫開的標 準化分子單元所形成的靶標結(jié)合組分，支架組分以及編碼組分。相應(yīng)地，在此處所述的模塊 化捕獲劑中，不僅相同的支架可以和不同的靶標結(jié)合結(jié)構(gòu)相結(jié)合，而且相同的支架也可以 和復(fù)數(shù)個靶標結(jié)合結(jié)構(gòu)相結(jié)合，因此顯著地改進該捕獲劑可完成的檢測，靈敏度以及選擇 性。根據(jù)第一個方面，描述了被設(shè)置為用于和靶標特異性結(jié)合的模塊化多核苷酸編碼 捕獲劑。該模塊化多核苷酸編碼捕獲劑包括至少一個被設(shè)置為與該靶標特異性結(jié)合的結(jié)合 分子，被設(shè)置為與附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸特異性結(jié)合的編碼多核苷酸，以及被設(shè)置為 用位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域附著該至少一個結(jié)合分子和該編碼多核苷酸的支架分子。在 該支架分子中，該位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域被布置為，依據(jù)該至少一個結(jié)合分子以及該 編碼多核苷酸的結(jié)合，可以有至少一個用于和該靶標特異性結(jié)合的結(jié)合分子，以及用于和 該基質(zhì)多核苷酸特異性結(jié)合的該編碼多核苷酸。根據(jù)第二個方面，公開了在樣品中檢測靶標的方法和系統(tǒng)，該方法和系統(tǒng)基于附 著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸和，以及包括附著至少一個結(jié)合分子和編碼多核苷酸的模塊化多 核苷酸編碼捕獲劑的組合使用。在該模塊化多核苷酸編碼捕獲劑中，該至少一個結(jié)合分子 被設(shè)置為與該靶標特異性結(jié)合，該編碼多核苷酸被設(shè)置為與附著于該基質(zhì)的該基質(zhì)多核苷 酸特異性結(jié)合。在該方法中，該模塊化多核苷酸編碼捕獲劑和/或組成所述模塊化多核苷酸編碼 捕獲劑的單元，該樣品以及該基質(zhì)多核苷酸在允許該至少一個結(jié)合分子與模塊化多核苷酸 編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物中的靶標結(jié)合以及該編碼多核苷酸與基質(zhì)多核苷酸結(jié)合的條件 下接觸一段時間，由此提供與該基質(zhì)多核苷酸結(jié)合的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑-靶標復(fù) 合物。在該方法中，與基質(zhì)多核苷酸結(jié)合的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物隨后 通過檢測技術(shù)進行檢測，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于對本文公開的內(nèi)容的理解將可確定這些檢測 技術(shù)。在該系統(tǒng)中，提供了基質(zhì)，其具有附著于該基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸，以及至少一個被 設(shè)置為與靶標特異性結(jié)合的結(jié)合分子，和被設(shè)置為與附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸特異性結(jié) 合的編碼多核苷酸，以及被設(shè)置為用位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域附著該至少一個結(jié)合分子 和該編碼多核苷酸的支架分子。在該支架分子中，該位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域被布置為， 依據(jù)該至少一個結(jié)合分子以及該編碼多核苷酸的結(jié)合，可以有至少一個用于和該靶標特異 性結(jié)合的結(jié)合分子，以及用于和該基質(zhì)多核苷酸特異性結(jié)合的該編碼多核苷酸。根據(jù)第三個方面，公開了用于分類復(fù)數(shù)個靶標中的靶標的方法和系統(tǒng)，該方法和 系統(tǒng)基于附著于基質(zhì)的復(fù)數(shù)個基質(zhì)多核苷酸，以及復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑的組 合使用。在一些實施方式中，這些靶標為細胞，且該方法和系統(tǒng)用于分類復(fù)數(shù)個細胞。
在該方法和系統(tǒng)中，各基質(zhì)多核苷酸是序列特異性的并相對于其它基質(zhì)多核苷酸 是位置可區(qū)分的。在該方法和系統(tǒng)中，各模塊化多核苷酸編碼捕獲劑包括至少一個被設(shè)置 為與該復(fù)數(shù)個靶標的互補靶標特異性結(jié)合的結(jié)合分子，被設(shè)置為與該復(fù)數(shù)個基質(zhì)多核苷酸 的基質(zhì)多核苷酸特異性結(jié)合的編碼多核苷酸，以及被設(shè)置為用位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域 和至少一個結(jié)合分子和編碼多核苷酸相結(jié)合的支架分子。該位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域在 該支架分子上被布置為，依據(jù)至少一個結(jié)合分子以及編碼多核苷酸的結(jié)合，可以有用于和 靶標特異性結(jié)合的至少一個結(jié)合分子，以及用于和基質(zhì)多核苷酸特異性結(jié)合的編碼多核苷 酸。在該方法中，該復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑和/或組成所述復(fù)數(shù)個模塊化 多核苷酸編碼捕獲劑的單元在允許至少一個結(jié)合分子與靶標結(jié)合的條件下與樣品接觸一 段時間，由此提供復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物。在該方法中，該復(fù)數(shù)個 多核苷酸編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物隨后在允許該編碼多核苷酸與附著于該基質(zhì)的基質(zhì)多 核苷酸相結(jié)合的條件下與復(fù)數(shù)個基質(zhì)多核苷酸接觸一段時間，由此將結(jié)合于該基質(zhì)的復(fù)數(shù) 個多核苷酸-編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物中的復(fù)數(shù)個靶標分類。該系統(tǒng)中包含基質(zhì)，其具有附著于該基質(zhì)的復(fù)數(shù)個基質(zhì)多核苷酸，以及復(fù)數(shù)個結(jié) 合分子，各結(jié)合分子特異性結(jié)合至該復(fù)數(shù)個靶標中的互補靶標，復(fù)數(shù)個編碼多核苷酸，各編 碼多核苷酸特異性結(jié)合至附著于該基質(zhì)的復(fù)數(shù)個基質(zhì)多核苷酸中的每一個多核苷酸，至少 一個被設(shè)置為用位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域和該復(fù)數(shù)個結(jié)合分子的每一個結(jié)合分子以及 該復(fù)數(shù)個編碼多核苷酸的每一個編碼多核苷酸相結(jié)合的支架分子，該位置可區(qū)分的支架結(jié) 合區(qū)域在該支架分子上被布置為依據(jù)至少一個結(jié)合分子以及編碼多核苷酸的結(jié)合，可以有 用于和靶標特異性結(jié)合的至少一個結(jié)合分子，以及用于和基質(zhì)多核苷酸特異性結(jié)合的編碼 多核苷酸。根據(jù)第四個方面，描述了支架分子，該支架分子包括被設(shè)置為附著于至少一個結(jié) 合分子的第一支架結(jié)合區(qū)域，以及被設(shè)置為附著編碼多核苷酸的第二支架結(jié)合區(qū)域，其中 該至少一個結(jié)合分子被設(shè)置為與靶標特異性結(jié)合，并且該編碼多核苷酸被設(shè)置為與附著于 基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸特異性結(jié)合。在該支架分子中，第一支架結(jié)合區(qū)域和第二支架結(jié)合區(qū) 域是位置可區(qū)分的，且被布置于該支架分子中，由該至少一個結(jié)合分子和第一結(jié)合區(qū)域結(jié) 合以及該編碼多核苷酸與第二結(jié)合區(qū)域結(jié)合來最小化該至少一個結(jié)合分子和該編碼多核 苷酸之間的相互作用。根據(jù)第五個方面，描述了多核苷酸編碼捕獲劑。該多核苷酸編碼捕獲劑由特異性 結(jié)合至靶標的結(jié)合分子，以及附著于該結(jié)合分子的編碼多核苷酸組成。該編碼多核苷酸由 特異性結(jié)合至基質(zhì)多核苷酸的序列組成。該基質(zhì)多核苷酸與一基質(zhì)相連，并含有能和編碼 多核苷酸特異性結(jié)合的序列。在該多核苷酸編碼捕獲劑中，該編碼多核苷酸包括至少一個 限制性內(nèi)切酶位點，使其可被相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶裂解。在若干實施方式中，該多核苷酸編 碼捕獲劑可以是在此描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑。根據(jù)第六個方面，此處公開的每一個方法，系統(tǒng)與陣列的基質(zhì)均與微流組分存在 適用的聯(lián)合，該微流組分包括用來攜帶流體的微流特征件。相應(yīng)地，在此處描述的方法中， 編碼多核苷酸與基質(zhì)的接觸至少可以在該微流特征件攜帶的流體中進行。此外，此處公開 的每一個系統(tǒng)還可以進一步包括含有該微流特征件的微流組分。
在此描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，以及相關(guān)的陣列方法和系統(tǒng)中，靶標結(jié) 合結(jié)構(gòu)從支架結(jié)構(gòu)分離出來，從而相較于現(xiàn)有技術(shù)的對應(yīng)裝置提高了使用上的靈活性和通 用性。另外，在若干實施方式中，此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，以及相關(guān)的陣 列方法和系統(tǒng)可以將復(fù)數(shù)個結(jié)合分子(特別是蛋白質(zhì))與單個多核苷酸編碼捕獲劑結(jié)合， 而各個結(jié)合分子結(jié)合同一靶標。相應(yīng)地，得到的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑的靈敏度和/ 或選擇性可以得到控制，特別是得到改進。特別地，在若干實施方式中，此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，以及相關(guān)的 陣列，方法和系統(tǒng)相較于現(xiàn)有技術(shù)的某些方法和系統(tǒng)可以有更好的目標探測選擇性和靈敏度。更特別地，在若干實施方式中，此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，以及相關(guān) 的陣列，方法和系統(tǒng)甚至允許從復(fù)雜混合物中檢測和/或分類靶標(如僅有低親和性配體 存在的細胞)，以及靶標(如配位體以<< 0. 的極低豐度存在的細胞)。在若干實施方式中，此處所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，以及相關(guān)的陣列，方 法和系統(tǒng)還允許用穩(wěn)固平臺進行靶標探測，其不必包括抗體。特別地，在若干實施方式中，此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，以及相關(guān)的 陣列，方法和系統(tǒng)可以產(chǎn)生穩(wěn)固的模塊化陣列，用于高效目標探測和/或分類，鑒于它們的 穩(wěn)定性，其能夠顯著地優(yōu)于文獻中用表面結(jié)合的蛋白質(zhì)來捕獲和檢測靶標的方法。此外，在若干實施方式中，模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，以及相關(guān)的陣列方法和系 統(tǒng)允許該多核苷酸編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物的選擇性釋放，由此在靶標(尤其是靶細胞) 檢測和/或分類上可以用于許多生物分析方法。此處所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，以及相關(guān)的陣列方法和系統(tǒng)可與若干檢 測和/或分類靶標的分析方法結(jié)合使用，其包括，但不限于，單參數(shù)和多參數(shù)分析(比如基 因組和蛋白組分析)，及技術(shù)人員可確認的其它分析法。特別地，此處描述的該平臺的模塊 化可以對俘獲的靶標(特別是俘獲的細胞)進行通常在玻璃基質(zhì)上進行的標準化分析在 上，比如免疫組織化學，F(xiàn)ISH，和技術(shù)人員基于閱讀本文公開內(nèi)容可確認的其它分析方法。此處所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，以及相關(guān)的陣列方法和系統(tǒng)可被用于各 種領(lǐng)域，其包括但不限于，分子診斷，分子治療，基礎(chǔ)生物學研究，組織工程，以及生物材料。以下的附圖和實施例內(nèi)容敘述了本文公開的一個或多個實施方式的細節(jié)。根據(jù)說 明書，實施例和附圖，以及權(quán)利要求書，其余特征，目的，以及優(yōu)點將變得顯而易見。


合并于說明書中并構(gòu)成說明書一部分的這些附圖示范了本文所公開內(nèi)容的一個 或多個實施方式，它們和詳細說明及實施例一起用于解釋本公開的原理和實施。圖1顯示了根據(jù)本文所公開實施方式的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑的示意圖。圖2顯示了根據(jù)本文所公開實施方式的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑的示意圖。圖3顯示了根據(jù)本文所公開的實施方式的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，方法和系 統(tǒng)的示意圖。圖4顯示了根據(jù)本文所公開的實施方式的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，方法和系
9統(tǒng)的示意圖。圖5顯示了根據(jù)本文所公開的實施方式用模塊化多核苷酸編碼捕獲劑進行的細 胞分類試驗結(jié)果。面板A顯示了對于酪氨酸酶TCR特異性的ssDNA-p/MHC四聚物陣列與T 細胞接觸后的灰階熒光圖像。該圖像顯示了在基質(zhì)上的T細胞的檢測和細胞分類，其中附 著的基質(zhì)DNA與該ssDNA-p/MHC四聚物互補。面板B顯示了用兩套ssDNA-p/MHC進行細胞 分類，其各自的編碼ssDNA的結(jié)合是可以相互區(qū)分的。箭頭指示每一套在接觸靶標T細胞 之后的結(jié)合。圖6顯示了根據(jù)本文所述的實施方式用模塊化多核苷酸編碼捕獲劑進行細胞分 類試驗的結(jié)果。面板A顯示了對于酪氨酸酶TRC特異性的ssDNA-SA-p/MHC四聚物陣列與 不同頻率的互補基質(zhì)多核苷酸以及T細胞相接觸后的灰階版熒光圖像。面板B顯示了面板 A中所示數(shù)據(jù)的量化圖表。圖7顯示了根據(jù)本文所述實施方式的支架(面板A)以及相應(yīng)的優(yōu)化支架(面板 B)的結(jié)構(gòu)模型。圖8示范了根據(jù)本文所述實施方式的優(yōu)化多核苷酸編碼捕獲劑的結(jié)合容量的試 驗結(jié)果。特別地，面板A顯示了在表達，重折疊，以及提純的各種步驟檢測到的SAC蛋白質(zhì) 的變性PAGE凝膠。SAC單體的分子量為 12kda。面板B顯示了用于檢驗ssDNA_SAC軛合 物的形成的凝膠移位分析。面板C顯示了了用2- '-羥基偶氮苯)苯甲酸分子(HABA) 確定生物素連接SA的摩爾比率的算式。圖9示范了根據(jù)本文所述實施方式的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑的俘獲效率的 試驗結(jié)果。面板A顯示了 ssDNA編碼蛋白質(zhì)陣列的灰階明視野圖像，其包括鏈親和素支架 和對于人TCR轉(zhuǎn)換的T細胞(左)以及鼠科TCR轉(zhuǎn)基因的T細胞(右)特異性的p/MHC粘 合蛋白。面板A的各子面板顯示了該ssDNA-編碼蛋白質(zhì)與互補的基質(zhì)DNA以及所示特定 細胞接觸之后的陣列的明視野圖像。面板B顯示了 ssDNA-編碼蛋白質(zhì)的陣列的灰階明視 野圖像，其包括優(yōu)化的鏈親和素支架和對于人TCR轉(zhuǎn)換T細胞(左)和鼠科TCR轉(zhuǎn)基因T 細胞(右)特異性的P/MHC結(jié)合體蛋白質(zhì)(細胞和上面板一致)。面板B的各子面板顯示 了該SAC-ssDNA p/MHC與互補的基質(zhì)DNA和所示特定細胞接觸之后的陣列的明視野圖像。圖10顯示了用常規(guī)蛋白質(zhì)陣列和用根據(jù)本文所述實施方式的模塊化多核苷酸編 碼捕獲劑進行靶標捕獲的比較。面板A顯示了包含在多核苷酸編碼蛋白質(zhì)中的p/MHC陣列 的灰階熒光圖像，和常規(guī)的在各種模式基質(zhì)上的直接P/MHC蛋白點樣策略相比，其進一步 包括優(yōu)化的SA支架。面板B的圖表量化顯示了面板A中所示數(shù)據(jù)。各數(shù)據(jù)點源自于三個 代表性的點。圖11顯示了用常規(guī)蛋白陣列和用根據(jù)本文所述實施方式的模塊化多核苷酸編碼 捕獲劑進行靶標捕獲的比較。面板A顯示了包含在ssDNA編碼蛋白中的p/MHC蛋白陣列的 灰階版本的熒光圖像，其還包括SAC支架。各行表示在不同的栽玻片上進行的不同實驗。面 板B顯示了單用p/MHC蛋白點樣的衍生表面的灰階版本熒光圖像。各行表示在不同的栽玻 片上進行的不同實驗。圖12顯示了用根據(jù)本文所述實施方式的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑進行細胞分 類試驗的結(jié)果。面板A顯示了三種不同的基質(zhì)多核苷酸的陣列(標為A，B和C)用由與多核 苷酸A互補的ss-DNA編碼的p/MHC四聚物以及用Jurkata_Tylr細胞提供的靶標接觸后的灰階熒光圖像。面板B顯示了不同的基質(zhì)多核苷酸陣列(標為A，B和C)用與多核苷酸A互 補的ss-DNA編碼的對于Mart-I-特異性TCR特異性的p/MHC四聚物，與多核苷酸B互補的 ss-DNA編碼的對于酪氨酸酶-特異性TCR特異性的p/MHC四聚物，以及預(yù)先用親脂性染料 染色(分別為綠和紅色，在灰階版本中為淺灰色和深灰色)的Jurkata-stoH和Jurkatα_Τ!Τ 細胞的混合群體提供的靶標接觸后的灰階熒光圖像。面板C顯示了對于酪氨酸酶-特異 性TCR特異性的多核苷酸編碼蛋白的陣列在和JUrkata_TiT在所示的不同的連續(xù)稀釋下 (50%,10%,1%,0. 1%)接觸后的灰階熒光圖像。面板D顯示了面板C所示數(shù)據(jù)的量化圖 表。圖13顯示了用根據(jù)本文所述實施方式的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑進行的基因 工程細胞檢測。面板A顯示了用F5MART-1 TCR轉(zhuǎn)染PMBC細胞的實驗方法的示意圖，以及 相關(guān)的顯示由流細胞計數(shù)法測定的轉(zhuǎn)染效率的圖表。面板B顯示了在微陣列上分類的轉(zhuǎn)染 PBMC的灰階明視野圖像，該微陣列含有分別被編碼為A和B的同源捕獲蛋白(MART-126_35/ HLA-A2. 1)和對照捕獲蛋白(CMV pp6 5495_5(13/HLA-A2. 1)。面板C顯示了重疊的共焦和明視 野圖像，以檢驗面板B中所示的細胞捕獲為特異性(MART-1細胞以淺灰色顯示)。圖14是根據(jù)本文所述實施方式的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑的檢測特異性和靈 敏度的示意圖表。面板A顯示了由流細胞計數(shù)法測定的對于EBV BMLF1259_267特異性的人 ⑶8+T細胞的數(shù)量和特異性圖表。面板B顯示了由流細胞計數(shù)法測定的對于CMV pp6 5495_5Q3 特異性的人CD8+T細胞的數(shù)量和特異性圖表。圖15顯示了用根據(jù)本文所述實施方式的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑進行內(nèi) 源性初級細胞的檢測。面板A顯示了含有所示的多核苷酸編碼p/MHC捕獲蛋白質(zhì)EBV BMLF1259_267/HLA-A2. 1 和 CMVpp6 5495_503/HLA-A2. 1，在與對于圖 13 的 EBV-BMLF-I 特異性 的⑶8+T細胞接觸后的陣列圖像(患者NRA 13)。左側(cè)面板顯示了在患者NRA 13細胞接 觸和捕獲后用 p/MHC 捕獲蛋白 raV BMLF1259_267/HLA-A2. 1 和 CMVpp6、5_5(13/HLA-A2. 1 定位 (分別對A和B cDNA點)的陣列，該患者NRA13細胞含有對于EBV-BMLF-I特異性而不是 對CMV-pp65特異性的⑶8+T細胞(在圖13中獨立地以流細胞計數(shù)法檢查)。右側(cè)的兩個 面板是這些細胞用熒光性EBV BMLF1259_267/HLA-A2. 1 (藍色，圖中顯示為白色箭頭)和CMV pp6 5 495_503/HLA-A2. lp/MHC四聚物(紅色，在該圖的灰階版本中顯示為黑色箭頭)染色后的 代表性灰階熒光圖像。面板B顯示了所示的對于EBV或者CMV特異性的ss-DNA-SAC-p/MHC 在和圖13所示的對EBV-BMLF-I特異性的CD8+T細胞(患者NRA 13)及對CMV_pp65特異 性的⑶8+T細胞(患者NRA 11)的1 1混合物接觸后的陣列圖像。左側(cè)面板顯示了細 胞捕獲后T細胞定位于A和B點的即刻明視野圖像。右側(cè)兩個面板是這些細胞用熒光性 EBV(藍色，在圖中顯示為白色箭頭)和CMV p/MHC四聚物(紅色，在該圖的灰階版本中顯 示為黑色箭頭)染色后的陣列的代表性熒光圖像。面板C顯示了 0. 4%，0. 2%和0.
人EBV-特異性T細胞群體混合物以流細胞計數(shù)法測定的數(shù)量和特異性。面板D顯示了對 于EBV特異性的模塊化多核苷酸編碼蛋白陣列在和面板C的混合物接觸后的灰階版本熒光 圖像。EBV-特異性的T細胞群體用淺灰色箭頭標記，非特異性細胞用黑色箭頭標記。圖16顯示了用根據(jù)本文所述實施方式的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑所捕獲的靶 標的控制釋放。面板A顯示了該實驗方法的示意圖。面板B顯示了(i)在p/MHC陣列上捕 獲的(ii)用BamHI處理后的(iii)用EcoRI處理后的以及(iv)用BamHI和EcoRI處理后
11的Jurkat^H (紅色在灰階版本中顯示為深灰色)以及Jurkata_TiT細胞(綠色在灰階版 本中顯示為淺灰色)的灰階版本的熒光圖像。圖17顯示了熒光標記的ssDNA-p/MHC四聚物可以被用作流細胞計數(shù)法的著色試 劑并且可以通過DNA雜交來定位抗原-特異性T細胞。在面板A中，Cy3-標記的A ‘ -SAC軛 合物被用于產(chǎn)生熒光性酪氨酸酶368-376ssDNA-p/MHC四聚物，以及被用于流細胞計數(shù)法 檢測Jurkata 細胞。在Cy3NACS p/MHC四聚物(下面板)和常規(guī)的酪氨酸酶368-376 (PE) p/MHC四聚物(上面板)之間可觀察到類似的染色形態(tài)。在面板B中，在暴露至DNA陣列之 前，用酪氨酸酶368-376-A' p/MHC四聚物將Jurkata_Tylr細胞染色。該Jurkata-Tylr細胞通 過DNA雜交被定位至點。圖18顯示了支鏈肽的示意圖。反應(yīng)性的伯胺用“星”標注，硫醇的反應(yīng)性馬來酰 亞胺基團用虛線框標注。圖19顯示了用由優(yōu)化蛋白支架SAC(左面板)和SAC 3(右面板)制成的編碼為 鏈A，的酪氨酸酶368-376/HLA-A2. 1四聚物對Jurkata_TylrT細胞的檢測。圖20顯示了用免疫-PCR檢測細胞表面受體。面板A顯示了用ssDNA編碼的熒光 性MART-lp/MHC四聚物染色的Jurkata一·—1和Jurkat"5^細胞的流細胞計數(shù)法分析。面 板B顯示了用ssDNA標記編碼的熒光性的抗-EGFR抗體染色的⑶膠質(zhì)瘤細胞和Jurkat T 細胞的流細胞計數(shù)法分析。底面板顯示通過用PCR擴增該編碼ssDNA檢測該同源細胞受體 (a -MART-1TCR,面板 C ；EGFR,面板 D)。圖21顯示了用DNA編碼的p/MHC四聚物和DNA編碼的抗體對捕獲抗原-特異性 細胞的TCR觸發(fā)激活的功能性描繪示意圖。圖22顯示了在玻璃纖維基質(zhì)上捕獲和活化的抗原特異性T細胞的功能概況。面 板A包含用三種不同的細胞因子在三個不同的時間點編碼的獨立點的熒光性圖像。面板B 顯示了一個獨立的IFN-Y簇的熒光放大率。
詳細說明本文描述了多核苷酸編碼捕獲劑，特別是模塊化的多核苷酸編碼捕獲劑和相關(guān)的 陣列方法及系統(tǒng)，根據(jù)在此處所稱的NACS方法或者技術(shù)，其可以和基質(zhì)多核苷酸組合用于 檢測樣品中的一個或多個靶標。詞組“多核苷酸編碼捕獲劑”指可特異性結(jié)合靶標的多核苷酸編碼分子構(gòu)造。特 別地，多核苷酸編碼捕獲劑通常包括可特異性結(jié)合于，并由此在此被定義為互補于靶標的 結(jié)合組分，支持該結(jié)合組分的結(jié)構(gòu)組分，以及附著于該結(jié)構(gòu)組分的編碼多核苷酸，其編碼該 分子結(jié)構(gòu)。在“模塊化多核苷酸編碼捕獲劑”中，該多核苷酸編碼捕獲劑的結(jié)合組分，結(jié)構(gòu)組 分和編碼組分由可以受控方式彼此結(jié)合或者分離的標準化分子單元形成。特別地，在此處 描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑中，該結(jié)合組分由至少一個結(jié)合分子形成，其被設(shè)置為 與靶標特異性結(jié)合，并因此被定義為與靶標互補；該編碼組分由編碼多核苷酸形成，其被設(shè) 置為特異性結(jié)合附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸，并因此被定義為和附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷 酸互補；該結(jié)構(gòu)組分由附帶至少一個結(jié)合分子和編碼多核苷酸的支架分子形成。特別地，在 該模塊化多核苷酸編碼捕獲劑種，該至少一個結(jié)合分子特異性結(jié)合至靶標，該支架分子和編碼多核苷酸根據(jù)圖1或者圖2的示意圖彼此相附或者準備彼此相附，以下將對此進一步 描述。本文所用的術(shù)語“附著”或者“被附著”指通過鍵，連接，力或者捆綁的連接或者組 合，以將兩個或兩個以上組分保持在一起，其包括直接或者間接的附著方式，比如第一分子 直接與第二分子或者材料結(jié)合的實施方式，以及一個或多個中間分子被布置于第一分子和 第二分子或者材料之間的實施方式。分子包括但不限于多核苷酸，多肽，特別是蛋白和抗 體，多糖，核酸適配子(aptamers)和小分子。本文所用的術(shù)語“多核苷酸”指由兩個或兩個以上單體組成的有機聚合物，所述單 體包括核苷酸，核苷或者其類似物。術(shù)語“核苷酸”指由結(jié)合了嘌呤或者嘧啶堿基，以及磷酸 基并且為核酸的基本結(jié)構(gòu)單元的核糖或者脫氧核糖組成的若干化合物中的任何一種。術(shù)語 “核苷”指由和脫氧核糖或者核糖相結(jié)合，并且特別在核酸中發(fā)現(xiàn)的嘌呤或者嘧啶堿基組成 的化合物(如鳥嘌呤核苷或者腺嘌呤核苷)。術(shù)語“核苷酸類似物”或者“核苷類似物”分 別涉及一個或多個的單個原子已被不同的原子或者不同的官能團替換的核苷酸或者核苷。 相應(yīng)地，術(shù)語多核苷酸包括任何長度DNA RNA類似物及其片段的核酸。三個或者三個以上 核苷酸的多核苷酸也被稱為核苷酸低聚物或者低聚核苷酸。本文所用的術(shù)語“多肽”指由兩個或兩個以上氨基酸單體和/或其類似物組成的 有機聚合物。術(shù)語“多肽”包括任何長度的氨基酸聚合物，包括全長的蛋白和肽，以及其類似 物和片段。三個或者三個以上的多肽也被稱為蛋白低聚物或者寡肽。本文所用的術(shù)語“氨 基酸”，“氨基酸單體”，或者“氨基酸殘基”指二十種天然存在的氨基酸中任何一種，包括具 有非天然側(cè)鏈的合成氨基酸，并包括D和L旋光異構(gòu)體。術(shù)語“氨基酸類似物”指一個或多 個的單個原子已被不同的原子，同位素，或者不同的官能團替換，但其它和天然氨基酸類似 物一致的氨基酸。本文所用的術(shù)語“蛋白”指具有特定二級和三級結(jié)構(gòu)的多肽，其可以參與，然而 并非限于，和其它生物分子的相互作用，所述其它生物分子包括其它蛋白，比如抗體，DNA, RNA，脂質(zhì)，代謝物，激素，趨化因子，和小分子。本文所用的術(shù)語“抗體”指受到抗原刺激后特異性結(jié)合至該抗原，在生物系統(tǒng)中促 進免疫反應(yīng)后由活化的B細胞生成的蛋白，其通常由四個子單元組成，包括兩個重鏈和兩 個輕鏈。術(shù)語抗體包括天然和合成抗體，其包括但不限于單克隆抗體，多克隆抗體或者其片 段。示范性的抗體包括IgA，IgD, IgGl, IgG2，IgG3，IgM以及類似物。示范性的片段包括 Fab Fv, Fab' F(ab' )2以及類似物。單克隆抗體是可特異性結(jié)合至，因此也被定義為互 補于另一個生物分子的單個特定的空間和極性結(jié)構(gòu)，稱為“抗原決定簇”的抗體。多克隆抗 體指具有各種結(jié)合不同抗原性的抗原決定簇的單克隆抗體的單克隆抗體混合物?？贵w可以 通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進行制備，比如免疫宿主并收集血清(多克隆)或者通過制備 連續(xù)的雜交瘤細胞系并采集分泌性蛋白(單克隆)。本文所使用的術(shù)語“多糖”指由通過糖苷鍵彼此結(jié)合的單糖單元形成的聚合物。多 糖包括超大的，通常為支鏈的巨大分子，包括任何長度的聚合物，從單-或雙-糖類聚合物 到包括數(shù)百或者數(shù)千單糖的聚合物，其可以具有約IOOODa至約20KDa的分子量。示范性的 多糖包括糖原，纖維素，淀粉，和殼多糖。本文所用的術(shù)語“核酸適配子”指可結(jié)合特定靶標的低聚核苷酸或者肽分子。特別地，核酸適配子包括已經(jīng)通過重復(fù)的離體選擇循環(huán)或等效手段，SELEX(指數(shù)富集配位體系 統(tǒng)進化)進行細胞工程處理，以結(jié)合至各種分子靶標，比如小分子，蛋白，核酸，甚至細胞， 組織和有機體的核酸物質(zhì)。核酸適配子可被用于生物工藝學和治療學，因為它們可提供和 抗體競爭的分子識別性能。肽核酸適配子是設(shè)計成可與其它蛋白在細胞內(nèi)部相互作用的蛋 白。它們由在兩端附著至蛋白支架的可變肽環(huán)組成。和抗體的結(jié)合親合力相比，這種雙結(jié) 構(gòu)限制大大增加了該肽核酸適配子的結(jié)合親合力水平(納摩爾范圍)。本文所使用的術(shù)語“小分子”指不是聚合物并且具有約IODa至2000-3000Da尺寸 的有機化合物。小分子包括生物學活性分子和不具有生物學活性的分子。示范性的小分 子包括4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-N-W-甲基-3-[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)氨 基]-苯基]-苯甲酰胺(Gleevec ),磺基琥珀酰亞胺基-6-(生物素酰胺)己酸酯，和琥珀 酰亞胺基-6-胼基煙酸酯丙酮腙。在本文所述的模塊化多核苷酸捕獲劑中，該至少一個結(jié)合分子特異性結(jié)合至靶 標，且該編碼多核苷酸特異性結(jié)合至附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸。本文所用的關(guān)于一分子結(jié)合或者附著于另一分子的詞語“特異性的”，“特異性 地”，或者“特異性”指該分子和另一分子之間的識別，接觸和穩(wěn)定復(fù)合物的形成，以及在每 一分子和另一分子與其它分子之間基本上較少，甚至沒有識別，接觸和穩(wěn)定復(fù)合物的形成。 示范性的特異性結(jié)合為抗體-抗原相互作用，細胞受體-配位體相互作用，多核苷酸雜化， 酶底物相互作用等等。本文所用的關(guān)于復(fù)合物分子組分的術(shù)語“特異性”指組分與該組分 所屬的特定復(fù)合物的獨特的聯(lián)合。本文所用的關(guān)于多核苷酸序列的術(shù)語“特異性”指具有 為互補序列的單個多核苷酸的序列的獨特聯(lián)合。本文所用的詞語“基質(zhì)多核苷酸”指附著于基質(zhì)以保持其與互補多核苷酸結(jié)合能 力的多核苷酸?；|(zhì)多核苷酸可以是，特別地，包括特異性結(jié)合多核苷酸編碼蛋白的編碼多 核苷酸，并因此被定義為與多核苷酸編碼蛋白的編碼多核苷酸互補的序列。本文所用的術(shù)語“基質(zhì)”指置于下面的支持體或者底層。示范性的基質(zhì)包括固體 基質(zhì)，比如玻璃板，微量滴定孔板，磁珠，硅片和技術(shù)人員根據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可以 確認的其它基質(zhì)。在一些實施方式中，附著于支架組分的編碼多核苷酸對于該結(jié)合組分是特異性 的。這些實施方式可被用于進行利用該結(jié)合組分-靶標特異性相互作用的分析，以檢測蛋 白，細胞因子，趨化因子，小分子，DNA, RNA,脂質(zhì)，等等，只要靶標是已知的，并且需要靈敏檢 測該靶標。在若干實施方式中，該結(jié)合組分和該結(jié)構(gòu)組分由蛋白形成。本文所用的術(shù)語“檢測(動詞)”或者“檢測(名詞)”指測定靶標或者信號在空 間的有限部分中的存在，出現(xiàn)或者實況，包括但不限于，樣品，反應(yīng)混合物，分子復(fù)合物和基 質(zhì)。當提及，關(guān)于，或者涉及靶標或者信號的量或者數(shù)量時，檢測是“定量的”(也稱為定 量)，其包括但不限于，設(shè)計成可測定該靶標或者信號的量或者比例的任何分析。當提及， 關(guān)于，或者涉及對于另一靶標或者信號的相對豐度的靶標或者信號的性質(zhì)或者種類的識別 時，檢測是“定性的”，其不被量化。本文所用的術(shù)語“靶標”指所關(guān)心的被分析物。術(shù)語“被分析物”指其本身在樣 品中的存在或者缺乏需要被檢測的物質(zhì)，化合物或者組分。被分析物包括但不限于生物分 子，特別是生物標記物。本文所用的術(shù)語“生物分子”指與生物環(huán)境有關(guān)的物質(zhì)化合物或者組分，其包括但不限于，糖類，氨基酸，肽蛋白，低聚核苷酸，多核苷酸，多肽，有機分子，半抗 原，抗原決定簇，生物細胞，生物學細胞的部分，維生素，激素及類似物。術(shù)語“生物標記物” 指與生物環(huán)境的特定狀態(tài)有關(guān)的生物分子，其包括但不限于，細胞周期的階段，健康和疾病 狀態(tài)。生物標記物的存在，缺乏，減少，正相調(diào)節(jié)和特定狀態(tài)相關(guān)并且可作為特定狀態(tài)的征 兆。本文所用的術(shù)語“樣品”指限定量的事物，其象征更大量的該事物，包括但不限于 來自生物環(huán)境的液體，標本，培養(yǎng)物，組織，商業(yè)的重組蛋白，合成化合物或者其部分。在若干實施方式中，該模塊化多核苷酸編碼分子包括至少一個結(jié)合分子，支架分 子和編碼多核苷酸。本文所用的術(shù)語“結(jié)合分子”或者“親合劑”指能夠與靶標在適當?shù)臈l件下特異 性結(jié)合的分子。特別地，該結(jié)合分子或者親合劑能夠與至少一個靶標在適當?shù)臈l件下特 異性結(jié)合，其包括例如在溶液中(如從生物體取得或者合成)，在細胞表面上，在人工表面 上(如衍生的珠，納米微粒)或者在其它技術(shù)人員可以確認的混合物或者表面中結(jié)合至該 靶標。結(jié)合分子的實例包括任何對于預(yù)定靶標體現(xiàn)結(jié)合親合力的分子，包括但不限于蛋白 結(jié)合劑，比如抗體，凝集素，F(xiàn)c受體，MHC蛋白A/G，肽核酸適配子等等，非蛋白粘合劑，比如 多核苷酸(例如RNA e/o DNA)核酸適配子，肽，小分子，和藥物，比如伊馬替尼甲磺酸鹽 (Gleevac ),環(huán)蛇毒素，煙堿樣乙酰膽堿受體抑制劑等等。在該模塊化多核苷酸編碼捕獲 劑中，該親合劑被附著于支架，其中可以進行直接或者間接的結(jié)合，例如通過中間分子(如 生物素分子)，通過任何共價的附著方案(本領(lǐng)域人員易于識別)或者通過非共價的方案， 比如靜電，F(xiàn)c蛋白A/G相互作用，生物素等等。用于本文所述的模塊化多核苷酸編碼蛋白中的結(jié)合分子通常對于要檢測的靶標 展現(xiàn)出結(jié)合親合力和結(jié)合選擇性，其可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進行測量，比如表面等離子 共振(SPR)，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISAs)，和技術(shù)人員可以確認的其它技術(shù)。針對模塊化多 核苷酸捕獲劑的結(jié)合分子的選擇是技術(shù)人員鑒于將被檢測的靶標以及試驗設(shè)計而作出的。 例如，當該靶標為細胞時，該結(jié)合分子展現(xiàn)對生物分子，特別是存在于特定細胞類型的表面 上的生物標記物的結(jié)合親合力和選擇性。示范性的表面分子包括但不限于膜蛋白，受體，糖 蛋白，離子通道或者主要組織相容性復(fù)合體及其他可以由技術(shù)人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容的 理解可以確認的分子。在測定候選的結(jié)合分子所展現(xiàn)的對于靶標的結(jié)合親合力和選擇性，并考慮附著至 支架(見下文)的結(jié)合分子數(shù)目的基礎(chǔ)上，技術(shù)人員還能夠為某靶標確定適當?shù)慕Y(jié)合分子。在若干實施方式中，依據(jù)適當?shù)闹Ъ苓x擇，可以通過控制捕獲劑對于靶標的化合 價(即由捕獲劑與該靶標所形成的化學鍵數(shù)目)調(diào)整附著于該支架的結(jié)合分子數(shù)目，以實 現(xiàn)所需的結(jié)合親合力和/或選擇性。例如，對于某靶標(例如細胞)低親合力(例如Kd > ΙΟ"6)的結(jié)合分子很可能需 要增加附著于該支架的分子數(shù)量，以確保包括這種結(jié)合分子的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑 的特異性結(jié)合。相應(yīng)地，在若干實施方式中，該捕獲劑對于某個靶標的結(jié)合親合力是可控制的，并 且特別地，可以通過提供相同或者不同的結(jié)合分子的多重拷貝提高結(jié)合親合力。特別地，如 果相同或者不同的結(jié)合分子以適當方式位于該支架上，其可以使該結(jié)合分子/支架對于所
15感興趣的細胞類型構(gòu)成比該親合劑單獨可實現(xiàn)的親和力明顯更高的結(jié)合親合力。特別地，多重配位體捕獲劑可以通過將各種結(jié)合分子(比如上述的結(jié)合分子)結(jié) 合至相同的支架進行組合。在某些需要探查靶標樣品內(nèi)多重要素的情形下(例如，多重細 胞表面標記物，來自相同的抗原遞呈細胞的內(nèi)源性和外源性的肽/MHC，等等)，這可能是有 利的。在若干實施方式中，該結(jié)合分子為蛋白，比如抗體，凝集素，F(xiàn)c受體，MHC，蛋白A/ G，和技術(shù)人員可以確認的其它蛋白。 特別地，在一些實施方式中，該結(jié)合分子為抗體。特別地，在這些實施方式中，該抗 體可以被生成為與期望的靶標特異性結(jié)合.該靶標可以是在混合物中或者細胞表面上要 被檢測的生物標記物(參見，例如⑶4，⑶8，和⑶幻。在后者情形下，這些抗體還可以被用 作被用于檢測和/或分類細胞靶標的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑的結(jié)合分子(見實施例 13)。在一些實施方式中，該蛋白可以是MHC復(fù)合物。本文所用的術(shù)語“MHC”或者“ρ/ MHC”指肽主要組織相容性復(fù)合體分子(p/MHC)，并且，更特別地指異源三聚體蛋白結(jié)合劑， 其為發(fā)現(xiàn)于T細胞上的對T細胞受體的同源結(jié)合劑。特別地，p/MHC合成物是抗原遞呈細 胞的細胞表面發(fā)現(xiàn)的異源-三聚蛋白，并且其包括MHC類別I，MHC類別II和MHC類別III 蛋白。MHC類別I蛋白包含肽，α鏈和β 2-微-球蛋白。表達MHC類別I蛋白的APCs向 細胞毒T細胞呈遞抗原片段，其被表面分子CD8穩(wěn)定。MHC類別II包括異源二聚體肽-結(jié) 合蛋白和在溶酶體小泡中調(diào)整在MHC類別II蛋白上的抗原載荷的蛋白，如MHC II DM,MHC II DQ,MHC II DRjPMHC II DP。在抗原呈遞細胞上，MHC類別II蛋白包含α禾Π β鏈，并 且它們通過結(jié)合至T-輔助細胞上的TCR和⑶4受體向T-輔助細胞呈遞抗原片段。MHC類 別III包括其它免疫組分，比如補體組分(例如，C2，C4，B因子)和一些編碼細胞因子(例 如TNF-α)的組分以及hsp。典型的MHC的受體/靶標是發(fā)現(xiàn)于T細胞上的T細胞受體，其對于在該MHC復(fù)合 物中存在的各種抗原(例如MART-1，巨細胞病毒，酪氨酸酶等等)可以是特異性的。基于所 感興趣的靶標并考慮MHC候選分子的結(jié)合特異性，技術(shù)人員可以確定對于特定靶標合適的 MHC。在一些實施方式中，MHC單體提供此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑的結(jié)合 分子。在這些實施方式中，靶標優(yōu)選由不被包括于受測細胞內(nèi)的狀態(tài)或者形式的分子生物 標記物或者其它分子提供。在一些實施方式中，MHC 二聚物和三聚物可以通過流細胞計數(shù)法 被用于檢測溶液中的抗原-特異性T細胞。在一些實施方式中，具有高親合力相互作用的 MHC 二聚物和三聚物(例如TCR-p/MHC)可期望檢測同樣在復(fù)合環(huán)境中的抗原特異性T細 胞，如實施例5和圖9a所示(左下的面板)，其中表達抗酪氨酸酶抗原的TCR的Jurkat細 胞用次優(yōu)的捕獲劑(參見圖8的二聚物和三聚物混合)進行分類。在一些實施方式中，MHC 四聚物與多核苷酸編碼支架聯(lián)合使用，其可以有利地用于涉及細胞檢測和/或分類的應(yīng)用 中。(例如，參見實施例9和10以及附圖5，6，9，10，11，12，和13-14，15，16，19，22。)特別地，在一些實施方式中，抗原-呈遞MHC的四聚物提供此處描述的模塊化多核 苷酸編碼捕獲劑的結(jié)合分子。MHC四聚物對于所感興趣的T細胞呈現(xiàn)比MHC單體或者二聚 物高得多的親合力的，其即為良好的用于通過流細胞計數(shù)法檢測抗原-特異性T細胞的試劑。當在此處公開的模塊化捕獲劑中和支架結(jié)合時，和本領(lǐng)域已知的方法相比，MHC四聚物 容許增加靈敏度和特異性的靶標檢測和/或分類。在以下包括附圖和實施例的公開內(nèi)容中，每當論述與此處公開的模塊化多核苷酸 編碼分子有關(guān)的結(jié)合分子的性能和用途時，將經(jīng)常用MHC作為參考。技術(shù)人員將能夠使此 種說明適用于制造和使用蛋白及其它非MHC的分子。特別地，技術(shù)人員將能理解，在使用非 p/MHC分子的結(jié)合蛋白時，選擇的主要決定因素是要被檢測的靶標。例如，如果需要檢測小 分子(例如咖啡因)，且存在對于咖啡因特異性的適配體，則技術(shù)人員將選擇該適配體作為 結(jié)合部分并將其用于支架構(gòu)造。(見實施例13)本文所用的術(shù)語“支架”或者“支架分子”指捕獲劑的分子結(jié)構(gòu)，其用于組成對編 碼多核苷酸(例如ssDNA tags)的親合劑(例如MHC)。此結(jié)構(gòu)可以源自于蛋白(比如鏈霉 親和素或者SA)，其它生物聚合物(比如多核苷酸，如RNA和DNA，肽核酸等等)，或者是可以 與該親合劑和該編碼多核苷酸在聚合物的不同和分開的部分相結(jié)合的其它聚合物。在此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑中，支架分子被設(shè)置為以支架結(jié)合區(qū)域 結(jié)合至少一個結(jié)合分子和編碼多核苷酸。本文所用的術(shù)語“域”指由區(qū)別性的結(jié)構(gòu)和功能特征標記的區(qū)域。特別地，支架結(jié) 合域是支架中被設(shè)置為結(jié)合另一個分子的區(qū)域。在本文公開內(nèi)容的意義上，支架結(jié)合域包 括用于結(jié)合另一個分子的官能團，以及在該支架上被另一個結(jié)合于支架的分子占據(jù)的支架 結(jié)合區(qū)域。官能團一經(jīng)確定，相關(guān)的支架結(jié)合區(qū)域可以用適合確定尺寸的技術(shù)加以確定，特 別是用所選擇的要附著的另一個分子的最大直徑。在若干實施方式中，對于根據(jù)本文公開 內(nèi)容的蛋白，取決于所選取的蛋白，最大直徑平均值介于約10人和約:5θΛ之間，對于小分 子介于約3Α和約IOA之間，對于多核苷酸介于約IOA和約20Α之間。適于確定分子尺寸的 技術(shù)但不限于，用于可結(jié)晶分子的X射線晶體照相法(見例如參考文獻39-41)，以及用于不 能結(jié)晶的分子(比如聚合物)的持續(xù)長度的技術(shù)(見例如參考文獻42-43)。這些用于檢測 分子尺寸的技術(shù)是技術(shù)人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可以確認的。在此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑中，支架結(jié)合域彼此之間是位置可區(qū)分 的，并因此不重疊。本文所用的詞語“位置可區(qū)分的”指分子或者其域，指基于該分子或者域占據(jù)的點 或者區(qū)域可區(qū)分的分子或者其域。相應(yīng)地，位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域是在支架上占據(jù)不 同點的或者區(qū)域的結(jié)合域，因此它們是位置可區(qū)分的。特別地，在此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑中，該支架分子包括被設(shè)置為 附著至少一個結(jié)合分子的第一支架結(jié)合區(qū)域和被設(shè)置為附著該編碼多核苷酸的第二支架 結(jié)合區(qū)域。在該模塊化多核苷酸編碼捕獲劑中，可以通過標記位置可區(qū)分的官能團和相關(guān)支 架結(jié)合區(qū)域?qū)Φ谝恢Ъ芙Y(jié)合域和第二支架結(jié)合域進行選擇，其被設(shè)置為在附著后使該附著 分子呈現(xiàn)于該支架上。本文所用的涉及具有化學反應(yīng)性并被包括于結(jié)構(gòu)中的分子或者其部分(例如，官 能團或者限制位點)的術(shù)語“呈現(xiàn)”指該結(jié)構(gòu)中的分子或者官能團的構(gòu)造，其中該分子或者 其部分保持這種化學反應(yīng)性的可檢測水平。相應(yīng)地，呈現(xiàn)在支架上的分子或者官能團是包 含在該支架中的分子或者其部分，其構(gòu)造容許在適當?shù)臈l件下進行或者檢測可化學地或生物學地表征所討論的該分子或者其部分的一個或多個化學反應(yīng)。因此，在本文公開內(nèi)容的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑中，結(jié)合分子以及編碼多核 苷酸附著支架后，該結(jié)合分子被呈現(xiàn)為用于和靶標結(jié)合，該編碼多核苷酸被呈現(xiàn)為用于和 基質(zhì)多核苷酸結(jié)合。在此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑中，結(jié)合分子和編碼多核苷酸在支架上 的呈現(xiàn)是通過選擇具有適當?shù)牡谝缓偷诙Ъ芙Y(jié)合域的支架實現(xiàn)的?？梢员话ㄓ诘谝恢Ъ芙Y(jié)合區(qū)域的用于結(jié)合結(jié)合分子的官能團依賴于該結(jié)合分 子的化學性質(zhì)，并且是技術(shù)人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可以確認的。例如，用于結(jié)合結(jié) 合分子的官能團包括但不限于，BirA聯(lián)接酶(將生物素基團聯(lián)接到預(yù)定肽序列的酶)，其它 酶，比如甲酰甘氨酸-生成酶(位點特異性地將醛基引入例如參考文獻44所述的重組蛋白 質(zhì))?？梢员话ㄓ诘诙Ъ芙Y(jié)合區(qū)域的用于結(jié)合多核苷酸的官能團也是技術(shù)人員依 據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可以確認的。示范性的呈現(xiàn)于支架上的用于結(jié)合多核苷酸的官能 團包括官能團，比如硫氫基(例如，在半胱氨酸殘基中)，伯胺及其它通過常規(guī)結(jié)合策略附 帶衍生DNA的官能團，熟悉技術(shù)的讀者應(yīng)能確認。這些官能團可以是該支架上的內(nèi)源性基團(例如支架蛋白上的天然賴氨酸殘 基)，或者通過比如基因克隆的方法(例如蛋白)，合成技術(shù)(聚合物，小分子)，及其它方法 而被引入?？梢砸栏街猎撝Ъ艿亩嗪塑账峄蛘呓Y(jié)合分子的拷貝數(shù)目將和該支架上可用的官 能團數(shù)目成正比。該特異性的第一和第二官能團和相關(guān)的支架結(jié)合域是考慮試驗設(shè)計而加以選擇。 通常，該支架經(jīng)過選擇以使得第一和第二支架結(jié)合區(qū)域的官能團允許用正交的化學過程附 著結(jié)合分子和編碼多核苷酸。如果在進行任何特定的化學過程時，這些在該特定化學過程 中參加和/或經(jīng)歷化學反應(yīng)的官能團不和該正交系中的任何其它化學過程反應(yīng)，則該組化 學過程是正交的。當支架為蛋白時，示范性的正交化學過程包括半胱氨酸-馬來酰亞胺結(jié) 合，胺-NHS結(jié)合，和鏈霉親和素-生物素結(jié)合，在支架為多糖時，具有NaI04的不同的支架 結(jié)合區(qū)域中的OH官能團受控氧化。在一些實施方式中，除包含區(qū)分的支架結(jié)合域以容納親合劑和編碼DNA之外，該 支架還經(jīng)過選擇以和所感興趣的靶標的環(huán)境相適應(yīng)(例如，如果該靶標是細胞表面標記 物，其應(yīng)當可溶于水性溶液)。在若干實施方式中，該支架包括高分子支架，其通過多配位體相互作用而形成，用 于和特定細胞類型的高親合力結(jié)合，隨之可用于這些不同細胞類型的空間導向的多重分 類。特別地，在一些實施方式中，該支架由非天然產(chǎn)生的分子提供，其被表達為具有模 塊設(shè)計特性。在這些實施方式中，該蛋白支架經(jīng)過設(shè)計，以使得多重和受控數(shù)目的特異性結(jié) 合分子和編碼多核苷酸的拷貝可以在特異性的支架多核苷酸結(jié)合域附著于該支架。在一些實施方式中，該支架可以被設(shè)置為在多重第二支架結(jié)合域中可啟動或者減 弱單股編碼多核苷酸(例如DNA低聚物)的附著。在這些實施方式中，第二支架結(jié)合域可 以經(jīng)過選擇，以允許以編碼多核苷酸雜化，用于將該支架空間導向至覆蓋有該基質(zhì)多核苷 酸的表面上的特定點。
在模塊化多核苷酸編碼捕獲劑被用于特定細胞類型的空間選擇性分類的實施方 式中，這樣設(shè)置的支架可能是有用的。例如，各自包含不同套親合劑，并以結(jié)合可區(qū)分的 ssDNA低聚物獨特標記的多重支架可以被采用，同時將許多細胞類型的混合物分離為單一 組分，借鑒本文公開的內(nèi)容，對于技術(shù)人員這是顯而易見的。例如，在一些實施方式中，可以 用具有生物素化抗體與ρ/MHC蛋白作為親合試劑的模塊化捕獲劑，其各自被編碼為結(jié)合可 區(qū)分的ssDNA低聚物。這些抗體可被用于根據(jù)細胞表面標記物如⑶4，⑶8，⑶3，等等對細 胞進行分類，而ρ/MHC蛋白將根據(jù)由TCRs測定的抗原特異性對細胞進行分類。在一些實施方式中，支架，特別是支架蛋白的所期望的構(gòu)造，可以通過用技術(shù)人員 已知技術(shù)修飾的候選支架的修飾實現(xiàn)，比如傳統(tǒng)克隆技術(shù)或者技術(shù)人員可以確認的其它技 術(shù)。在一些實施方式中，該支架可以針對特定的捕獲劑進行優(yōu)化。特別地，在特定的捕 獲劑中，優(yōu)化的支架具有明確定義的用于和結(jié)合分子與編碼多核苷酸單獨結(jié)合的支架結(jié)合 區(qū)域，以使得該結(jié)合分子和該編碼多核苷酸結(jié)合后，在該多核苷酸和該結(jié)合分子的組件之 間可能的干涉被最小化。對于靶標和基質(zhì)多核苷酸具有期望的結(jié)合親合力的捕獲劑，這通 常由最小化一個或多個該結(jié)合分子和附著于該支架的編碼多核苷酸之間的結(jié)構(gòu)重疊，而保 持該捕獲劑對于該靶標和該基質(zhì)多核苷酸所期望的結(jié)合親合力而加以實現(xiàn)。參照圖1和2，其顯示了根據(jù)本文公開內(nèi)容的模塊化捕獲劑的不同構(gòu)造。特別地， 在圖1和2的圖例中，支架域，結(jié)合分子域(蛋白結(jié)合域)和多核苷酸域(DNA域)被圖解 示出。如前所述，本文所用的術(shù)語“域”指由區(qū)別性的結(jié)構(gòu)和功能特征標記的區(qū)域。相應(yīng)地， 涉及該支架分子，該結(jié)合分子和該編碼多核苷酸的該術(shù)語“域”指由在某些溫度結(jié)合于捕獲 劑眾的該分子(支架分子，結(jié)合分子，多核苷酸)的構(gòu)型變化定義的專門區(qū)域。某個分子的 域可以用任何適于確定尺寸，特別是分子的三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)進行測定，其包括X射線晶體 照相術(shù)，篩析色譜法，質(zhì)譜法，凝膠電泳及其它技術(shù)人員可以確認的技術(shù)。在對于某捕獲劑優(yōu)化的支架中，該支架的結(jié)合域經(jīng)過選擇以最小化該支架上的結(jié) 合分子域和多核苷酸域的重疊，以使該捕獲劑具有所期望的結(jié)合親合力。在若干實施方式中，優(yōu)化的支架呈現(xiàn)結(jié)合分子和編碼多核苷酸，其與在該支架上 所有可用的位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域上形成的捕獲劑所期望的結(jié)合親合力相關(guān)。另一 方面，在若干實施方式中，在非優(yōu)化支架中，附著的結(jié)合分子和編碼多核苷酸的數(shù)目不匹配 該支架上可用位點的總數(shù)目。例如，如果該支架具有4個附著結(jié)合蛋白的位點以及3個附 著DNA的位點，該非優(yōu)化的支架將很可能每支架可包含<4個結(jié)合蛋白和<3個DNA，不管 摩爾量如何過剩。此種每支架的結(jié)合分子和/或多核苷酸的存在(或者缺乏)是可測量的 (見例如圖8)。該捕獲劑還可以用傳統(tǒng)的分析方法測試，如ELISA，流細胞計數(shù)法，SPR，等 等，以測量該捕獲劑的效能。在特異性的捕獲劑中，該支架還可以經(jīng)過修改，以最佳化該支架作為兩個部分 (即結(jié)合分子和編碼多核苷酸)的整合點的功能，而最小化在結(jié)合這些部分的支架域之間， 可能導致附著的部分功能效能降低的任何可能的相互作用。該被降低的功能效能可以是由 于空間位阻(在結(jié)合分子和編碼多核苷酸的重疊區(qū)域之間)，由于所應(yīng)用的結(jié)合化學過程 的性質(zhì)而在該支架上的附著區(qū)域的不可逆修飾，等等。實施例4-6和圖7-9顯示了未優(yōu)化 的支架(天然SA)和優(yōu)化的支架(半胱氨酸-SA)的T細胞俘獲效率的比較。
相應(yīng)地，通過標記結(jié)合結(jié)合分子和編碼多核苷酸的支架結(jié)合區(qū)域，以及改變支架 分子的剩余部分以布置該支架上的支架結(jié)合域，使結(jié)合分子和編碼多核苷酸之間的相互作 用最小化，可以針對那些結(jié)合分子和編碼多核苷酸優(yōu)化結(jié)合某個結(jié)合分子和編碼多核苷酸 的某支架分子。通過這樣的方式，可以衍生出某支架分子的優(yōu)化變體。在一些實施方式中，支架是蛋白。特別地，在一些實施方式中，蛋白支架已經(jīng)包含 對于結(jié)合分子允許特異性結(jié)合的官能團。例如，鏈霉親和素由于其對于生物素的天然親合 力使其對于生物素化的P/MHC分子具有特異性，是優(yōu)良的支架蛋白。另一個實例可以是蛋 白A/G。這些蛋白對于抗體的Fc區(qū)域具有天然的親合力，其中后者可以被用作結(jié)合蛋白。 這比沒有固有特異性存在的蛋白支架更加有利，在沒有固有特異性存在的情況下，需要引 入兩個化學正交的處理手段，用于結(jié)合結(jié)合蛋白和編碼多核苷酸。由于大多數(shù)的蛋白具有 窄范圍的尺寸和序列長度(即性能，比如溶解度，可用于修飾的位點數(shù)量)，可以預(yù)期任何 蛋白均可被用作支架分子。特別地，在用于生物結(jié)合的條件下穩(wěn)定的蛋白特別有望適用作 為支架。在若干實施方式中，支架蛋白由鏈霉親和素(SA或者SA)形成。鏈霉親和素是來 自鏈霉菌屬avidinii的四聚物蛋白，其具有序列HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVG NAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTffSGQYVGGAEARINTQffLLTSGTTEANAffKSTLV GHDTFTKVKPSAAS(SEQ ID NO 1)。SA具有出眾的親合力以及四個獨特的結(jié)合位點，其對于天 然的配位體生物素(Kd 10-15mol/L)四面體式布置。鏈霉親和素對于生物素的摩爾結(jié)合 量是4 1生物素SA。而SA無需和結(jié)合分子特異性結(jié)合(例如通過生物素相互作用)， 用其它結(jié)合方法將結(jié)合單元結(jié)合至SA的實施方式?jīng)]有利用SA對于生物素的4倍化合價和 強相互作用。特別地，在若干SA為支架的實施方式中，著眼于該蛋白的N末端部分上的生 物素的結(jié)合孔位置，C末端部分被選擇作為編碼多核苷酸附著位點。相應(yīng)地，在若干支架蛋白是鏈霉親和素的實施方式中，結(jié)合分子(例如MHC分子) 可以是生物素化的，以實現(xiàn)具有蛋白-配位體對SA的四聚物組件。在一些實施方式中，結(jié) 合分子還可以通過共價鍵(比如酰胺結(jié)合)結(jié)合至SA，并因此不必通過生物素-SA相互作 用結(jié)合。技術(shù)人員將能夠根據(jù)選擇的試驗設(shè)計確定最適當?shù)慕Y(jié)合。在本文公開內(nèi)容的若干 實施方式中，SA作為標準支架被用于將p/MHC單體組裝入四聚物中。在支架是SA的實施方式中，可以使用修飾的SA，以及從其中衍生的分子(特別是 SA-藻膽色素蛋白(PE或APC)結(jié)合物)。在一些實施方式中，可以使用的支架為用于熒光 性p/MHC四聚物制備的SA重組體突變株。在一些這類實施方式中，可以使用SA變體，例如 在從生物素結(jié)合孔去除的位點中，在羧基末端[參考文獻25，26，27]結(jié)合半胱氨酸殘基的 變體。在這些實施方式中，半胱氨酸-反應(yīng)性馬來酰亞胺衍生物的結(jié)合可以只限于C末端， 因為在天然的SA中不存在半胱氨酸殘基。更特別地，在一些實施方式中，可以使用名為鏈霉親和素-半胱氨酸(SAC)的優(yōu)化 鏈霉親和素，其在c末端包含若干外源性的氨基酸。這些殘基包括半胱氨酸氨基酸，衍生 DNA(或者任何其它馬來酰亞胺衍生分子)可以由其結(jié)合。該SAC支架具有序列HMGITGTWY NQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGG AEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVGGSGCP(SEQ ID NO :2)。在本文公開的內(nèi)容中，經(jīng)常以SA和SAC支架作為參照。技術(shù)人員將能夠?qū)⒄f明內(nèi)
20容用于非SA和和SAC的支架和優(yōu)化支架，也可以參考實施例部分提供的教導。特別地，其 它支架蛋白包括但不限于蛋白A/G，支鏈肽，小分子，如MBester PEG-馬來酰胺及其優(yōu)化 變體。采用以下方法可以衍生給定預(yù)定靶標和預(yù)選結(jié)合分子的其它支架和優(yōu)化支架。 (a)選擇第一結(jié)合化學過程，以將預(yù)選的結(jié)合分子附著于支架，以及選擇第二結(jié)合化學過 程，以將多核苷酸附著于支架(例如NHS-胺和硫醇-馬來酰亞胺化學過程)。(b)考慮形成 的捕獲劑的化合價和極性(例如支鏈肽增加化合價的應(yīng)用，甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-絲 氨酸延伸物在結(jié)合蛋白之間產(chǎn)生間距的應(yīng)用)，選擇候選的支架結(jié)構(gòu)。(c)用候選的支架結(jié) 構(gòu)進行多核苷酸以及結(jié)合分子的結(jié)合，由此提供候選捕獲劑。(d)實驗性地以及任選地測試 候選的捕獲劑和預(yù)定靶標的特異性結(jié)合。(e)如有必要或者需要，重復(fù)一些或者全部步驟， 以增加該捕獲劑對于該預(yù)定靶標的結(jié)合親合力和/或特異性。如果期望優(yōu)化，可以執(zhí)行選 擇候選支架的步驟，或者該步驟可以包括修飾該支架以減少，特別是最小化預(yù)選的結(jié)合分 子和多核苷酸之間重疊的步驟。本文所用的術(shù)語“編碼多核苷酸”指附著于此處描述的模塊化捕獲劑的支架，并且 和附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸互補的多核苷酸。在若干實施方式中，編碼對于第一靶標特 異性的模塊化捕獲劑的編碼多核苷酸和編碼對于第二靶標特異性的捕獲劑的編碼多核苷 酸是結(jié)合可區(qū)分的，特別是在第一靶標與第二靶標不同時。本文所用關(guān)于分子的詞語“結(jié)合可區(qū)分的”指基于其和特定分子特異性結(jié)合，并由 此被定義為與特定分子互補的能力而可區(qū)分的分子。相應(yīng)地，如果第一分子可特異性結(jié)合 第三分子并由此被定義為與第三分子互補，并且第二分子可特異性結(jié)合第四分子并由此被 定義為和第四分子互補，而第四分子不同于第三分子，則第一分子和第二分子是結(jié)合可區(qū) 分的。相應(yīng)地，如果第一編碼多核苷酸可特異性結(jié)合(并由此被定義為互補)于第一基質(zhì) 多核苷酸，并且第二編碼多核苷酸可特異性結(jié)合(并由此被定義為互補)于第二基質(zhì)多核 苷酸，而第一基質(zhì)多核苷酸不同于第二基質(zhì)多核苷酸，則第一和第二編碼多核苷酸是結(jié)合 可區(qū)分的。在此處描述的陣列基質(zhì)，方法和系統(tǒng)的若干實施方式中，各基質(zhì)多核苷酸和編碼 多核苷酸之間是結(jié)合可區(qū)分的。在此處公開的方法和系統(tǒng)的一些實施方式中，基質(zhì)的各基 質(zhì)多核苷酸彼此之間是序列特異性的以及位置可區(qū)分的。如上所述，本文所用的關(guān)于分子詞語“位置可區(qū)分的”指根據(jù)分子占據(jù)的點或者區(qū) 域，該分子是可區(qū)分的。相應(yīng)地，位置可區(qū)分的基質(zhì)多核苷酸是在基質(zhì)上占據(jù)不同的點或者 區(qū)域并且由此為位置可區(qū)分的基質(zhì)多核苷酸。在若干實施方式中，編碼多核苷酸可以包括一個或多個限制性內(nèi)切酶的限制位 點。詞語“限制位點”指可以由限制性內(nèi)切酶識別的特定核苷酸序列。詞語“限制性內(nèi)切酶” 指可在已知為限制性位點的特異性識別核苷酸序列處切割雙股或者單股DNA的任何酶。此 處描述的可以被包括于編碼多核苷酸中的示范性的限制位點包括6個堿基限制位點，比如 對于EcoRI BamHI，NdeI及其它可以由技術(shù)人員確認的酶的位點。其它示范性的限制位點 包括但不限于Aval，BglII, DraI, EcoRV和參考文獻45中公布的進一步的限制位點，其以 參考方式被全文合并于此。在若干實施方式中，支架本身在結(jié)合可區(qū)分的捕獲劑之間是可互換的，并且單種支架可被用于構(gòu)造不同的模塊化捕獲劑。另外該支架可以經(jīng)受改善和優(yōu)化。在若干實施方 式中，該支架和至少一個結(jié)合分子亦為結(jié)合可區(qū)分的。在一些實施方式中，支架可以被設(shè)置為提供極性捕獲劑，沒有圖1(上面板)的示 意圖所示的徑向?qū)ΨQ，圖1 (底面板)和圖2 (右上面板)的示意圖所示的對稱捕獲劑，或者 圖2(左上面板)的示意圖所示的準極性捕獲劑。特別地，極性捕獲劑是結(jié)合分子域，支架域和編碼多核苷酸的重疊被最小化的捕 獲劑。準極性捕獲劑是少數(shù)結(jié)合分子域和編碼多核苷酸域在彼此之間以及和該支架域重疊 的分子。在對稱捕獲劑中，所有的結(jié)合分子和編碼多核苷酸域在一定程度上重疊。在每一 種極性捕獲劑，準極性捕獲劑和對稱捕獲劑中，該支架可以被優(yōu)化，以最小化該一個或多個 結(jié)合分子域，支架分子域和一個或多個多核苷酸域之間的特定捕獲劑中的重疊。對于極性 捕獲劑，這種最小化被最大化。相應(yīng)地，在若干實施方式中，充分組合的極性多核苷酸編碼捕獲劑有望具備相對 于非極性捕獲劑更高的能力，因為在極性捕獲劑中該結(jié)合分子可自由地與所感興趣的靶標 相互作用，并且該編碼多核苷酸可自由地與該基質(zhì)上的cDNA相互作用。申請人已經(jīng)通過流 細胞計數(shù)法證明此種“反面(about-face) ”構(gòu)造的近似物導致更高的細胞表面標記物染色 (參見圖2，下面板)。特別地，申請人生產(chǎn)了 SAC-DNA構(gòu)造，使每SAC附著IDNA鏈(經(jīng)熒光標記)。這 個部分是準極性的，因為該MHC捕獲蛋白(結(jié)合域)沿支架徑向分布，而該DNA域是單一的 (因此和該構(gòu)造的其余部分相比是極性的)(見下文)。與徑向?qū)ΨQ的構(gòu)造直接對比，此構(gòu) 造結(jié)合細胞表面受體更好(平均強度178對比15 (參見圖2下面板)。在若干實施方式中，通過用將結(jié)合結(jié)構(gòu)庫和單一的支架配對，可以將具有相關(guān)編 碼多核苷酸的單個支架重復(fù)用于產(chǎn)生結(jié)合結(jié)構(gòu)庫。這些實施方式被示范于實施例5，8，9和 10，以及圖 5,6,9,12A, B，13B，15AB，16，19，22 中，其中相同的支架(SAC-A')被用作 NACS 捕獲劑，其具有對MART-I，OVA, Riiel，酪氨酸酶，和CMV的特異性。在這些實施方式中該系 統(tǒng)的模塊化和互換能力。在一些實施方式中，此處描述的多核苷酸編碼捕獲劑，特別是此處描述的模塊化 的多核苷酸編碼捕獲劑包括用于將結(jié)合分子連接到支架的可變長度的連結(jié)物。本文所用的 術(shù)語“連結(jié)物”指包含在模塊化多核苷酸編碼捕獲劑中用于結(jié)合或者連接支架與結(jié)合分子 的分子。該連結(jié)物可以源自于可以與包括其的捕獲劑的支架和結(jié)合分子反應(yīng)任何化學分 子。示范性的連接物包括但不限于肽(例如10肽)，核酸，聚合物(聚乙二醇)，和碳鏈。連結(jié) 物的長度可以由常規(guī)化學方法控制，對于具有技術(shù)專長的讀者這應(yīng)當是顯而易見的。該連結(jié) 物可以用常規(guī)的生物結(jié)合策略進行附著，這對于熟習技術(shù)的讀者而言也應(yīng)當是顯而易見的。在這些實施方式中，對于和所感興趣靶標的適當相互作用而言，包含連結(jié)物有望 增加結(jié)合蛋白的自由度。當該靶標被固定/限制在適當空間定向?qū)τ诟哂H合力相互作用為 決定性的特定域(例如靶細胞表面蛋白被限制于細胞膜)中時，這有望增加該相互作用。在一些實施方式中，該連結(jié)物還可以作為介于所包括的結(jié)合分子和編碼多核苷酸 之間的間隔團，以使得該結(jié)合分子域和多核苷酸域彼此不會干涉。示范性的連接物包括尺 寸在50Da和5000Da之間的分子。在以下進一步討論的一些實施方式中，連結(jié)物可以是條件性的連結(jié)物，其由于受控的刺激改變其構(gòu)造。在一些實施方式中，可以通過將多重結(jié)合單元結(jié)合至單個支架增加捕獲劑對于靶 標的親合力。該捕獲劑的化合價的提升增加了該組合復(fù)合物的親合力，因為每一個相鄰單 元均參與結(jié)合進程，所以凈效果是該靶標與多核苷酸編碼捕獲劑的總體聯(lián)合增加，如實施 例5和圖7，8和9所示。這對于結(jié)合分子(如MHC)特別相關(guān)，其特征是作為單體對于靶細 胞的親合力弱，但是以多體形式被束在一起時增加親合力。在結(jié)合分子由低親合力結(jié)合蛋白形成的實施方式中，捕獲劑對于靶標被增加的化 合價可能需要有效結(jié)合至靶標?？梢蚤_發(fā)與分子構(gòu)象的修飾有關(guān)的親合力變化，以即時控 制多核苷酸編碼分子對相應(yīng)的互補靶標的相互作用。例如，一些依據(jù)對互補配位體(該受 體對其特異性的分子)的結(jié)合控制細胞活動的細胞表面受體功能。當配位體不再與該受體 結(jié)合時，該活動可以被逆轉(zhuǎn)或者恢復(fù)。因此，通過開發(fā)結(jié)合分子對支架的分離和多價特性， 有可能可以用條件性連接物來控制結(jié)合。條件性連接物響應(yīng)外源性的外部刺激經(jīng)歷一些構(gòu) 象變化而導致化合價減少，因此該捕獲劑的結(jié)合親合力以及相應(yīng)的該多核苷酸編碼捕獲劑 無法保持與該靶標繼續(xù)結(jié)合。條件性連接物的實例為含有紫外線不穩(wěn)定堿的肽或者核酸， 紫外線不穩(wěn)定堿在暴露于紫外線燈時斷開。這種實施例在實踐中將用ρ/MHC蛋白通過紫外 線不穩(wěn)定的肽連接物結(jié)合至SAC-DNA支架。該捕獲劑將在結(jié)合于T細胞受體后激活靶細胞。 該多核苷酸編碼Ρ/MHC捕獲劑即可在暴露于紫外線燈所期望的時間后被去除。在若干實施方式中，此處描述的多核苷酸編碼捕獲劑包括彼此結(jié)合可區(qū)分的多重 結(jié)合分子。在這些實施方式中，多配位體編碼捕獲劑可被用于同時應(yīng)答多重目標。當這些 靶標被組合于域中，如被組合于細胞表面上時，這可能是最有利的，因為親合力的增加(如 上面所指出)可以等同地作用于此系統(tǒng)，其中該復(fù)合物的親合力可能大于獨立的結(jié)合蛋白 各自的親合力。多配位體編碼捕獲劑的實施例可以包括Ρ/MHC復(fù)合物，其中各蛋白可以由 不同肽序列組成。其它組合也是可能的，如Ab Ab，Ab肽，Ab適配體，肽適配體，和技術(shù)人員 依據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可以確認的其它分子。此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑可以著眼于根據(jù)技術(shù)人員可以確認的方 法的特異性的捕獲和試驗設(shè)計通過結(jié)合這些單元加以制造。例如，在結(jié)合分子特異性地結(jié) 合支架的實施方式中，編碼多核苷酸(例如DNA)可以在組裝該結(jié)合分子(例如MHC)之前 先結(jié)合至支架(例如SAC)。在其它的結(jié)合分子不是特異性結(jié)合至支架的實施方式中，結(jié)合 單元需要以共價形式被附著。這既可以發(fā)生在多核苷酸附著于支架前，也可以發(fā)生在之后。 將此處描述的模塊化捕獲劑與其它支架和結(jié)合分子進行組裝的其它方法對于熟習技術(shù)的 讀者將是易于確認的。不管試劑以何種次序組合，這些方法將適于組裝此處公開的捕獲劑， 只要該結(jié)合蛋白單元的特異性需要由該多核苷酸序列獨特編碼。在一些支架是鏈霉親和素的實施方式中，模塊化多核苷酸編碼蛋白可以通過酶促 混合生物素化的MHC分子和鏈霉親和素(SA)的商業(yè)制劑進行制備，通常比例為4 1，該鏈 霉親和素通常連接熒光染料分子。技術(shù)人員將可確認在此步驟上致力于改進MHC四聚物對 于流細胞計數(shù)法的細胞分類的變化。例如，在一些實施方式中，結(jié)合蛋白的附著可以通過蛋白-配位體相互作用(鏈霉 親和素生物素)，蛋白-蛋白相互作用(Fe域和蛋白A/G)，或者生物結(jié)合策略(胺結(jié)合，氫 硫基結(jié)合等等)。在一些結(jié)合分子是MHC的實施方式中，MHC可以在C末端被生物素化。在一
23些支架是SAC的實施方式中，SAC在該C末端以DNA修飾。在一些實施方式中，整個單元通過將 聯(lián)合生物素-MHC和SAC-DNA進行組裝，其中SAC通過生物素特異性結(jié)合至4個MHC蛋白分子。此處公開的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑的編碼多核苷酸與支架蛋白的結(jié)合可以 用普通的生物結(jié)合方法形成，比如化學交聯(lián)，其包括依賴于蛋白中可被結(jié)合的伯胺(通常 發(fā)現(xiàn)于賴氨酸殘基)存在的技術(shù)。特別地，多核苷酸編碼蛋白可以通過共價結(jié)合策略生成， 比如PCT申請W02008/016680中所述的策略，其以參考方式被全文合并于此。特別地，化學 結(jié)合被用于產(chǎn)生支架蛋白和多核苷酸之間的共價鍵，其包括NHS-胺結(jié)合，硫醇-硫醇結(jié)合， 硫醇-馬來酰亞胺結(jié)合，酰胼-醛結(jié)合等等。這些生物結(jié)合策略對于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當 是顯而易見的。要和特定多核苷酸編碼捕獲劑結(jié)合的編碼多核苷酸的數(shù)目可以變化。特別地，附 著于該蛋白組分的多核苷酸的數(shù)目可以被調(diào)整，以最小化尺寸，并由此最小化該待定部分 的空間位阻，而仍然保持結(jié)合特異性。該優(yōu)化可以通過PCT申請WO 2008/016680中所示方 法進行，其以參考方式被全文合并于此。(見圖3和實施例3)在這些實施方式中，捕獲劑的 優(yōu)化可以化學方式進行(即不同化學計量的反應(yīng)性小分子與捕獲劑(例如抗體))。在一些實施方式中，要附著于各蛋白的編碼多核苷酸的數(shù)目可以是1至6，甚至大 于6的任何一個數(shù)字。在一些實施方式中，比如細胞分類，每支架附著1到4個編碼多核苷 酸，其提供進一步的優(yōu)點在于，可以最小化標記的空間效應(yīng)，并因此允許為了與互補基質(zhì)多 核苷酸的高親合力雜化用復(fù)數(shù)個編碼多核苷酸標記多核苷酸編碼捕獲劑。形成該待定部分的多核苷酸的長度還可以被控制，以優(yōu)化多核苷酸編碼捕獲劑與 基質(zhì)的結(jié)合。特別地，該編碼多核苷酸的長度可以為了正交化目的而被優(yōu)化。在這些實施 方式中，編碼區(qū)域包含20mer識別序列。這些是根據(jù)PCT申請WO 2008/016680示范的方法 以計算機產(chǎn)生的，其以參考方式被全文合并于此。特別地，包含實施例中提及的限制位點的 這些序列是通過將6個堿基切割位點附加至原本根據(jù)PCT申請WO 2008/016680示范的方 法產(chǎn)生的序列而產(chǎn)生的，其以參考方式被全文合并于此。該基質(zhì)多核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)生產(chǎn)。例如，首先多核苷酸可以被化 學合成。這些核苷酸即可以是根據(jù)I^t Brown在斯坦福[參考文獻46]所列范例定點標示。 然后技術(shù)人員可以根據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解將這樣生成的基質(zhì)多核苷酸附著于基質(zhì)。特 別地，適合于生產(chǎn)基質(zhì)多核苷酸的多核苷酸在聚賴氨酸基質(zhì)上包括至少75mers長度。在一些實施方式中，編碼多核苷酸和/或基質(zhì)多核苷酸被正交化，以最小化編碼 多核苷酸和基質(zhì)多核苷酸的非特異性結(jié)合。相應(yīng)地，正交化的多核苷酸包括序列為計算機生 成以最小化殘缺堿基對，亞穩(wěn)狀態(tài)和/或其它二級結(jié)構(gòu)的多核苷酸，以最小化多核苷酸之間 的非特異性相互作用和通常與相關(guān)序列的隨機生成有關(guān)的在多核苷酸中的非線性二次干擾。本文所用的術(shù)語“正交化”指由計算生成一組多核苷酸的進程，其中殘缺堿基對， 亞穩(wěn)狀態(tài)及其它二級結(jié)構(gòu)被最小化，以使得多核苷酸只結(jié)合互補鏈而不結(jié)合其它。用于此 公開內(nèi)容的示范性的正交化技術(shù)包括根據(jù)Dirks等人所列范例[參考文獻47]進行的正交 化，其以參考方式被全文合并于此。特別地，在一些實施方式中，編碼多核苷酸和相應(yīng)的互補基質(zhì)多核苷酸為正交化 的多核苷酸，比如多核苷酸A，B，和C，其被詳細描述于實施例6和圖5，6，9-13，15，17，19， 22，以及多核苷酸AEcoRI，BBamHI，其被描述于實施例7和圖16。
其它正交化的多核苷酸可以通過一些方法和步驟進一步加以確定，比如根據(jù)技術(shù) 人員基于對本文公開內(nèi)容的理解顯而易見的方法的計算正交化(即電腦化的正交化)。此處描述的用MHC作為結(jié)合分子的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑可以使用[參考文 獻33]中廣泛描述的步驟進行制造，其以參考方式被全文合并于此。依據(jù)這種步驟，可以首 先合成通過受控刺激可修飾的犧牲肽，來產(chǎn)生ρ/MHC蛋白分子的庫。例如，在若干實施方式 中，此犧牲肽包含非天然氨基酸，其含有硝基-苯基側(cè)鏈。此官能團是紫外線不穩(wěn)定的；因 此在紫外線存在下，該犧牲肽被斷裂為兩個較小的肽。因此可以產(chǎn)生呈遞該犧牲肽的P/MHC 復(fù)合物，將全部復(fù)合物暴露于紫外線，而在包含摩爾過量交換肽的溶液中實行后者。接觸紫 外線后，該犧牲肽將被斷裂為兩部分，并將為全長的交換肽置換，MHC因其將具有更高的親 合力。通過使用肽庫，將可以在一個紫外線交換步驟中產(chǎn)生巨大的Ρ/MHC庫。此處公開的方法和系統(tǒng)可以被用于進行靶標的檢測分析，包括單參數(shù)分析，和多 參數(shù)分析，其全部可以作為多重分析被進行。本文所用的術(shù)語“單參數(shù)分析”指為測定一個靶標的存在，缺乏，或者數(shù)量所進行 的分析。術(shù)語“多參數(shù)分析”指為了測定復(fù)數(shù)個靶標的存在，缺乏，或者數(shù)量所進行的分析。 術(shù)語“多重的”或者“多重化的”分析指在單個反應(yīng)室中進行多重分析反應(yīng)的分析，例如多 重被分析物的同時分析，和/或以單一的分隔及檢測形式進行的分析。在一些實施方式中，此處公開的方法和系統(tǒng)可以有利地被用于進行診斷分析，其 中要被檢測的一個或多個靶標是與預(yù)定疾病有關(guān)的預(yù)定生物標記物。在從通常不均質(zhì)的組 織樣品的不同區(qū)域各自測量不同類別的生物材料和生物分子，因此會引入不可避免且難以 測定的干擾源的診斷方法中，這些實施方式特別有利。在一些此處公開的方法和系統(tǒng)的實施方式中，多核苷酸編碼捕獲劑和基質(zhì)多核苷 酸被用于組合物中，如圖3，4，21所示。在圖3，4，21所示的實施方式中，此處公開的多核苷酸編碼捕獲劑形成蛋白陣列， 其可以接觸樣品以檢測該樣品中的靶標。圖3，4，21的實施方式對于檢測和/或分類蛋白 靶標特別有利。在其它特別適于檢測和/或分類細胞靶標的實施方式中，一些或者全部模塊化多 核苷酸編碼捕獲劑在用互補的基質(zhì)多核苷酸接觸模塊化的多核苷酸編碼抗體之前接觸樣 品。在這些其它實施方式中，該抗體和一個或多個相應(yīng)的靶標可以在不存在基質(zhì)的情況下 結(jié)合，例如在液相中，其中兩個分子均具有完全的定向自由度并且該靶標對該親合劑的結(jié) 合部位的接入不會被該基質(zhì)削弱。另外，與現(xiàn)有技術(shù)的相應(yīng)方法和系統(tǒng)相比，所進行的分析 的靈敏度和特異性，以及結(jié)合至該基質(zhì)的模塊化多核苷酸編碼的靶標復(fù)合物的探測能力可 以被改進。顯示以上一些優(yōu)點的示范性的實施方式被示意于實施例12和圖17中。在一些實施方式中，多重細胞類型可以在陣列上通過使用蛋白結(jié)合劑庫進行分 類，在該庫中它們結(jié)合的支架用不同的多核苷酸進行編碼，以使得各個不同的蛋白結(jié)合體 的特異性由不同的DNA序列編碼。此方法的在實踐中實施例示意于實施例8-11和圖5b， 12b, 15b, 16 中。在此處公開的方法和系統(tǒng)的一些實施方式中，結(jié)合至基質(zhì)的模塊化多核苷酸編碼 靶標復(fù)合物最后從該基質(zhì)被檢測。在一些實施方式中，通過提供標記分子進行復(fù)合物的檢測，其包括可以特異性結(jié)合要檢測的模塊化多核苷酸編碼蛋白靶標復(fù)合物(例如抗體，適配子，肽等等)的任何分 子，以及提供標記信號的標記，附著于該分子的標記化合物。將該標記分子與該多核苷酸編 碼捕獲劑-靶標復(fù)合物接觸，則技術(shù)人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容，特別是實施例部分的理解， 即可檢測來自該基質(zhì)上結(jié)合于多核苷酸編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物的標記化合物的標記信號。在如下更詳細敘述的一個或多個靶標和/或復(fù)數(shù)個靶標被檢測的實施方式中，標 記分子可以由復(fù)數(shù)個標記分子形成。各標記分子包括特異性結(jié)合一個或多個靶標/復(fù)數(shù)個 靶標中一個靶標的分子，以及附著于該分子的標記化合物，該標記化合物提供標記信號，各 標記分子之間是檢測可區(qū)分的。本文所用的關(guān)于標記分子的詞語“檢測可區(qū)分的”指基于附著于該分子的標記化 合物提供的標記信號可區(qū)分的分子?？梢员挥糜谔峁z測可區(qū)分的標記分子的示范性標記 化合物包括但不限于放射性同位素，熒光發(fā)生團，化學發(fā)光染料，發(fā)色團，酶，酶基質(zhì)，酶協(xié) 同因子，酶抑制劑，染料，金屬離子，納米微粒，金屬溶膠，配位體(比如生物素，抗生物素蛋 白，鏈霉親和素或者半抗原)以及技術(shù)人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可以確認的其它化 合物。在一些實施方式中，將復(fù)數(shù)個標記分子和復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑-靶 標復(fù)合物在允許該復(fù)數(shù)個多核苷酸編碼捕獲劑靶標復(fù)合物與該復(fù)數(shù)個標記分子結(jié)合的條 件下接觸一段時間。然后在該基質(zhì)上從結(jié)合于該復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑-靶標 復(fù)合物的復(fù)數(shù)個標記分子檢測標記信號。在一些實施方式中，檢測方法可以通過熒光讀數(shù)方法進行，其中被標記的抗體是 用熒光發(fā)色團進行標記，其包括但不限于小分子染料，蛋白發(fā)色團，量子點，和金納米微粒。 特別地，在一些此處公開的任何方法和系統(tǒng)的實施方式中，可以在金納米微粒標記的第二 檢測系統(tǒng)中進行檢測，其中普通的照相顯影溶液可以放大金納米微粒，進一步內(nèi)容如下所 述。而且，如果讀數(shù)來自金顆粒的暗視野散射，則啟動單個分子數(shù)字式蛋白組學方法。技術(shù) 人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可以確認的其它技術(shù)將不作詳細討論。本文所用的作為復(fù)合物或者分子的組分的術(shù)語“標記”和“標記分子”指能檢測的 分子，其包括但不限于放射性同位素，熒光發(fā)生團，化學發(fā)光染料，發(fā)色團，酶，酶底物，酶協(xié) 同因子，酶抑制劑，染料，金屬離子，納米微粒，金屬溶膠，配位體(比如生物素，抗生物素蛋 白，鏈霉親和素或者半抗原)等等。術(shù)語“熒光發(fā)生團”指在可檢測的圖像中能夠顯現(xiàn)熒光 的物質(zhì)或者其一部分。因此本文所用的詞語“標記信號”指容許該標記檢測的標記發(fā)射出 的信號，其包括但不限于放射能，熒光，化學發(fā)光，酶促反應(yīng)產(chǎn)物中化合物的產(chǎn)生等等。特別 地，金納米微?？杀挥糜谌髦涡问降臋z測分析，其中檢測復(fù)合物被連接至金納米微粒。這 在小分子類蛋白，肽等等的檢測最為相關(guān)，因為檢測細胞可以簡單采用傳統(tǒng)的顯微技術(shù)進 行。在一些實施方式中，檢測一種特定靶標。在這些實施方式中，可以在將該多核苷酸 編碼捕獲劑與基質(zhì)接觸之前或者之后將模塊化多核苷酸編碼捕獲劑與該靶標接觸。特別 地，形成該模塊化捕獲劑的單元可以在單一的反應(yīng)混合物中被接觸。然而，此種方法將要求 支架和結(jié)合分子之間，以及支架和編碼多核苷酸之間具有特異性(其通常已經(jīng)為特異性)。模塊化多核苷酸編碼捕獲劑與靶標的接觸在模塊化多核苷酸編碼蛋白與基質(zhì)接觸之前進行的實施方式特別適合于細胞分類或者檢測。此方法被示范于實施例12和圖17 中。模塊化多核苷酸編碼捕獲劑與靶標的接觸在模塊化多核苷酸編碼蛋白與基質(zhì)接 觸之后進行的實施方式特別適合于高靈敏度的蛋白分類或者檢測。此處公開的多核苷酸編碼捕獲劑與靶標的接觸在多核苷酸編碼捕獲劑與基質(zhì) 接觸之后進行的方法和系統(tǒng)的實施方式被示范于實施例3，7，8，9，10，11和圖5-6，9-13， 15-16，19，22中。在這些實施方式中，結(jié)合于靶標的多核苷酸編碼蛋白和非結(jié)合于該靶標的 多核苷酸編碼蛋白之間對于相同的特定基質(zhì)的競爭可以被去除，并且分析的靈敏度因此被 增加。進一步地，在這些實施方式中，基質(zhì)上的多核苷酸的濃度可以被優(yōu)化，以使得高濃度 的多核苷酸編碼捕獲劑可以結(jié)合至該基質(zhì)，根據(jù)調(diào)節(jié)各結(jié)合的熱力學平衡法則，這將接著 使正確組裝的復(fù)合物的濃度更高，隨之增加總體檢測靈敏度。可以用圖5&，6，9-11，12六(；，1313，15&(1，1713，19，22和實施例 1,7-10 中示范的方法
和系統(tǒng)進行的單參數(shù)分析包括但不限于，用于血清中單一標記物檢測，生物樣品中單一蛋 白檢測，根據(jù)表面標記物的細胞分類，以及技術(shù)人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可以確認 的其它分析中的任何分析方法。特別地，可以在樣品CD8細胞，CD4細胞或者抗原特異性T-細胞(即在T細胞受 體(TCRs)上彼此區(qū)別的細胞，這給予它們抗原特異性)中進行單參數(shù)分析檢測。在一些實施方式中，根據(jù)實施例3，8，10和11，以及圖3-6，12b，15b，16，22所示的 策略，進行了復(fù)數(shù)個靶標的檢測。在一些實施方式中，可以生產(chǎn)由復(fù)數(shù)個結(jié)合可區(qū)分的并且位置可區(qū)分的模塊化多 核苷酸編碼捕獲劑組成的蛋白陣列。這些實施方式特別有利于不同蛋白-靶標的高靈敏度 分類和/或檢測。在其它實施方式中，復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑在接觸基質(zhì)多核苷酸之前 和樣品接觸，以檢測相關(guān)靶標。在這些實施方式中，此處公開的方法和系統(tǒng)可被用于進行多 重的多參數(shù)分析，其中由于和結(jié)合蛋白與靶標在無基質(zhì)時的結(jié)合有關(guān)的改進的靈敏度和選 擇性，并慮及被減少的生物淤積和蛋白變性，許多生物標記物可以有效地被定量和/或定 性檢測?？梢杂脤嵤├?，8-11和圖3-6，12b，15b，16，22所示方法和系統(tǒng)進行的多參數(shù) 分析包括但不限于任何蛋白組分析，組織分析，血清診斷，生物標記物，血清描繪(serum profiling)，多參數(shù)細胞分類，單細胞研究，和本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解 可以確認的其它分析方法。在一些這類實施方式中，可以進行多參數(shù)分析，以多重檢測方式在樣品⑶8細胞， CD4細胞和抗原特異性T細胞中進行檢測。復(fù)數(shù)個靶標由不同類型的細胞組成的方法和系統(tǒng)的實施方式相比于現(xiàn)有技術(shù)的 相應(yīng)的方法和系統(tǒng)(比如細胞與印在基礎(chǔ)基質(zhì)上的表面標記物-特異性抗體相互作用的淘 選[參考文獻48])特別有利。特別地，相對于現(xiàn)有技術(shù)方法和系統(tǒng)，由于捕獲抗體的淘洗 和三級結(jié)構(gòu)通過吸收/共價附著于普通衍生基質(zhì)而有害地和不可逆地被損壞，基質(zhì)上的細 胞捕獲效率可以被改進。和實施例7和圖10和11所示的NACS比較，這導致較低反應(yīng)性的 表面。
在若干實施方式中，此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑被用于細胞分類方法。用實施例1-11和圖3-13，15-17，19，21，22所示的方法和系統(tǒng)可實施的分類靶標 的分析方法包括需要檢測混合物中的特定靶標(包括但不限于細胞靶標，蛋白-靶標或者 基因靶標)的任何分析方法，這是技術(shù)人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可以確認的。特別地，此處描述的方法和系統(tǒng)允許從細胞類型復(fù)合混合物中至少1 1000稀度 進行特定細胞類型的多重分類。即使在細胞特異性親合劑呈現(xiàn)相對弱的結(jié)合親合力時，這 種稀少細胞的分類也被證實。在一些實施方式中，用于編碼捕獲劑的多核苷酸(“例如DNA低聚物”)被設(shè)計成 包括不同的限制性內(nèi)切酶位點，其可以被互補的限制性核酸內(nèi)切酶裂開(此處也稱可釋放 的多核苷酸捕獲劑)。特別地，這些限制位點被包括，以使得不同的限制性內(nèi)切酶識別結(jié)合可區(qū)分捕獲 劑上不同的DNA序列。因此通過使用復(fù)數(shù)個不同限制性內(nèi)切酶，不同群體的捕獲劑的粘著， 以及由此而來的不同群體的靶標，特別是細胞，可以通過添加對用于分類該細胞類型的序 列特異性的互補限制性內(nèi)切酶而被獨立地控制。釋放的細胞可以通過細胞富集培養(yǎng)在體內(nèi) 擴張，或者可以用本文公開內(nèi)容所述的單參數(shù)或者多參數(shù)分析方法進行基因組或者蛋白生 物學分析(例如PCR，蛋白質(zhì)印跡等等)。采用多核苷酸編碼捕獲劑的任何捕獲靶標的控制釋放將允許用其它常規(guī)的生物 分析技術(shù)進一步分析該靶標，如PCR，質(zhì)譜，蛋白質(zhì)印跡等等，以及技術(shù)人員可以確認的其它 技術(shù)。相應(yīng)地，在一些實施方式中，此處描述的可釋放的多核苷酸編碼捕獲劑可被用于 相關(guān)的方法，其中提供靶標，特別是復(fù)數(shù)個靶標，該多核苷酸編碼捕獲劑和靶標以及附著有 基質(zhì)多核苷酸的基質(zhì)在允許多核苷酸-編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物形成于基質(zhì)上的條件下接 觸一段時間。然后將針對可釋放的多核苷酸編碼捕獲劑的限制位點的限制性內(nèi)切酶和可釋 放的多核苷酸-編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物接觸，以允許該互補限制位點裂開，由此允許包括 該與限制性內(nèi)切酶互補限制位點的可釋放的多核苷酸-編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物的選擇性 釋放。在一些實施方式中，用此處描述的方法進行的釋放可以被選擇性控制，以通過受控方 式(例如在不同的時間)釋放不同的可釋放多核苷酸-編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物。在一些實施方式中，可釋放的多核苷酸-編碼捕獲劑是此處描述的模塊化多核苷 酸編碼捕獲劑。特別地，在一些實施方式中，根據(jù)此方法的可釋放的模塊化多核苷酸編碼捕 獲劑進一步包括連結(jié)物分子，以允許此處描述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑的控制釋放， 由此允許缺少該捕獲劑時對靶標的其它分析。在若干實施方式中，在陣列中捕獲的靶標，特別是在陣列上捕獲的細胞也將接受 進一步的分析。特別地，可以使用免疫-PCR以描繪細胞表面受體。此外或者另外，可以采 用一組多核苷酸編碼捕獲劑，比如以參考方式被全文合并于此的WO 2008/016680所述的 捕獲劑進行這種分析，其可以根據(jù)實施例16和圖20-22所示方法進行。特別地，在圖20-22 的實施例中，抗靶標表面生物標記物的抗體被獨特的DNA序列標記。然后這些多核苷酸編 碼抗體被用于染色在該陣列上被捕獲的細胞。該編碼抗體上的DNA標記即可被分析，且這 些靶標細胞生物標記物的存在或者缺乏將和該細胞生物標記物相關(guān)的DNA標記的存在或者缺乏相關(guān)聯(lián)。這些DNA標記可以用常規(guī)方法檢測，如PCR，測序，微陣列，以及技術(shù)人員可 以確認的其它技術(shù)。相應(yīng)地，在一些實施方式中，此處描述的多核苷酸編碼捕獲劑和模塊化多核苷酸 編碼捕獲劑可被組合用于檢測，特別是分析靶標的方法中，其中至少一個模塊化多核苷酸 編碼捕獲劑和多核苷酸編碼捕獲劑和靶標和/或附著在基質(zhì)上的基質(zhì)多核苷酸接觸，以形 成模塊化多核苷酸編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物和/或多核苷酸編碼捕獲劑靶標復(fù)合物。其它 多核苷酸-編碼捕獲劑和/或模塊化多核苷酸編碼捕獲劑可以進一步和這些復(fù)合物接觸， 以允許和該靶標和/或該靶標上呈現(xiàn)的其它靶標結(jié)合，以形成其它多核苷酸-編碼捕獲劑 復(fù)合物。因此可以檢測其它多核苷酸-編碼捕獲劑和/或模塊化多核苷酸編碼捕獲劑與其 它靶標的復(fù)合物。基于使用可釋放的多核苷酸捕獲劑和/或含有連結(jié)物，特別是條件性連 結(jié)物的多核苷酸-編碼捕獲劑，其它變體對于技術(shù)人員將是顯而易見的。在其它實施方式中，此處公開的任何方法和系統(tǒng)的基質(zhì)可以和微流組分有關(guān)，因 此允許基于分析的微流操作。基于分析的微流具有各種優(yōu)點，比如減少樣品和試劑體積，縮 短分析時間[參考文獻49]。例如，在某些操作條件下，表面結(jié)合分析動力學主要通過被分 析物(蛋白)濃度和被分析物/抗原結(jié)合親合力被測定，而不是通過擴散測定[參考文獻 50] ο本文所用的術(shù)語“微流”指具有微流特征的組分或者系統(tǒng)，如通常以微米或者亞微 米尺度制造的通道和/或腔室。例如，代表性的通道或者腔室至少具有一個橫截面的尺寸 在約0. 1微米至約1500微米范圍內(nèi)，更具有代表性地為約0.2微米至約1000微米，更具有 代表性為約0. 4微米至約500微米。個別的微流特征通常容納非常小量的流體，例如約10 納升至約5毫升，更具有代表性地為約100納升至約2毫升，更具有代表性地為約200納升 至約500微升，或者更具有代表性地為約500納升至約200微升。微流組分可以被包括于集成器件中。在此應(yīng)用時，“集成器件”指具有兩個(或以 上)彼此物理式或者操作式聯(lián)合的器件。這些組分可以(全部或者部分)被彼此分離地制 造并在它們的(完全或者部分)制造后被聯(lián)合，或者該集成器件可以被制造為將不同組分 包括于該集成器件中。集成的微流陣列裝置包括被聯(lián)合至微流組分的陣列組件，其中該微 流組分和該陣列組件彼此成可操作的聯(lián)合，以使得該陣列組件的陣列基質(zhì)和該微流組分的 微流特征呈流體連通。微流組分是包括微流特征，并且適合于和陣列組件成可操作聯(lián)合的 組分。陣列組件是包括基質(zhì)，并且適合于和微流組分成可操作聯(lián)合的組分。該微流系統(tǒng)還可以為模塊化的形式?！澳K化的”表示系統(tǒng)或裝置具有多個一起應(yīng) 用的標準化組分，其中一類組分的多個不同實施例之一可以被另一個同類組分代替，以改 變該系統(tǒng)或裝置的功能或者性能；在這種系統(tǒng)或裝置中，每一個標準化組分即為“模塊”。在此處公開的方法和系統(tǒng)的微流實施方式中，在極小的樣本體積和非常緊縮的基 礎(chǔ)/生物淤積中進行大面板蛋白生物標記物的測量是可能的。在此處公開的方法和系統(tǒng)的微流實施方式中，還可以提升分析的靈敏度。另外，此處公開的微流方法和系統(tǒng)允許進行(i)單步驟分析(其中多核苷酸編碼 捕獲劑一個或多個靶標和標記抗體在單一步驟中接觸)和(ii)減少時間內(nèi)的多步驟分析 (其中基質(zhì)被連續(xù)地暴露于模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，一個或多個靶標，然后是第二抗 體)，和現(xiàn)有技術(shù)的相應(yīng)微流方法和系統(tǒng)以及其它用于分子檢測的非微流方法和系統(tǒng)相比，
29其樣品尺寸減少，靈敏度更高。其它與此處公開的微流方法和系統(tǒng)有關(guān)的優(yōu)點包括，可以在微流環(huán)境中進行任何 涉及基質(zhì)支持抗體的分析，而用現(xiàn)有技術(shù)不可能有微流芯片組件可以繼續(xù)存在。與此處公開的方法和系統(tǒng)有關(guān)的進一步的優(yōu)點為可以用低成本試劑進行靈敏的 測量，比如用玻璃，塑料；以及可以將基質(zhì)與其它組分組合應(yīng)用與樣品預(yù)處理和提純。此處公開的方法和系統(tǒng)允許多重的多參數(shù)檢測，分類，和所感興趣的生物標記物 以及相關(guān)的診斷分析。此處公開的用于診斷分析的方法和系統(tǒng)的應(yīng)用示范描述于實施例 9-10和圖13-15,21-22中，以及技術(shù)人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可以確認的任何其它 分析方法。特別地，在圖13-15的示范性的診斷分析中，用來自人PBMCs的NACS導向檢測抗 原特異性T細胞群體。這些T細胞的檢測對于診斷目的很重要，因為它們參與抗癌和病毒 病原體的免疫反應(yīng)。治療學分析的實施例作為替代提供于圖13中。在此人PBMCs用對于 癌癥有關(guān)抗原特異性的TCR進行轉(zhuǎn)染。這些T細胞在隨后注入患者之前在NACS陣列上被 檢測。此處公開的系統(tǒng)可以為陣列或者部分試劑盒的形式。陣列有時候被稱為“微陣 列”，其包括可尋址區(qū)域的任一種一維，二維或者三維空間布置，該可尋址區(qū)域帶有和該區(qū) 域有關(guān)的特定分子。通常該特征尺寸是微米。實施例3-11，圖3-6,9-13，15-17，19,21-22 提供了示范性的微陣列。在部分試劑盒中，該模塊化多核苷酸編碼捕獲劑和/或任何有關(guān)的組分獨立地和 基質(zhì)一起被包含于該試劑盒中。特別地，該模塊化多核苷酸編碼捕獲劑可以被包括于一種 或多種組合物中，并且每一種模塊化多核苷酸編碼捕獲劑均可以和適宜的媒介載體或者助 劑一起被包含于組合物中。提供于該系統(tǒng)的基質(zhì)可以具有附著其上的基質(zhì)多核苷酸。在一些實施方式中，該 基質(zhì)多核苷酸可以進一步被提供為該試劑盒的其它組分。其它組分可以包括標記了的多核 苷酸，標記了的抗體，標簽，微流芯片，參照標準，和技術(shù)人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可 以確認的其它組分。特別地，該試劑盒的組分可以被提供為具有適宜的說明及其它必要的 試劑，以實行此處公開的方法。該試劑盒通常將在單獨的容器中包含所述組合物。用于實 施該分析方法的說明，例如書面或者聲音的在紙上或者電子載體(比如磁帶或者CD-ROMs) 上的說明，將通常被包含于該試劑盒中。根據(jù)使用的特定方法，該試劑盒還可以包含其它封 裝的試劑和材料(即洗滌緩沖劑及類似物)。本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)對本文公開內(nèi)容的理解可以確定關(guān)于所述組合物的適宜的 載體或者助劑的識別的更詳細資料，通常是該試劑盒的制造和包裝。
具體實施例方式此處公開的方法和系統(tǒng)被進一步示范于下列實施例中，其用于示例而不是限制。 ^mm ι sac支奧g白的牛產(chǎn)SaC的表達根據(jù)在先出版的規(guī)程[參考文獻36]進行。簡而言之，克隆入pET_3a 質(zhì)粒的鏈霉親和素-半胱氨酸6aC)基因是來自TakeshiSano博士(Harvard Medical School)的慷慨禮物?？寺∵x擇和整夜開始培養(yǎng)后，包含該質(zhì)粒的BI21 (DE;3)-pLysE通過在LB媒介中振動在37°C下生長，并對于pET-3a-SaC選擇抗生素氨芐西林(501tg/ml)，對于 PLysE選擇氯霉素Q51tg/ml)。當A600達到0. 6時發(fā)生細胞誘導，在該處加入b_D_硫代 半乳糖苷(IPTG)至0. 4mM的最終濃度。接著在37°C保持誘導細胞4小時。然后在1600g 離心培養(yǎng)物10分鐘，并用IOOmM NaCl,lmM EDTA, IOmM Tris-HCl, pH 8. 0洗滌。然后用溶 胞緩沖液溶化細胞(2mM EDTA, 30mM Tris-HCl, 0. 1% Triton X-100, pH 8.0)。為了減少該溶液的粘性，該溶胞產(chǎn)物隨后用去氧核糖核酸酶和核糖核酸酶(各 101tg/ml, J2mM MgS04)在室溫下處理20分鐘。然后通過在39，OOOg離心15分鐘將不可 溶的包含體與該溶胞產(chǎn)物分離，之后用溶胞緩沖液再次洗滌沉淀物。將該沉淀物溶解于6M 胍-HCl，pH 1. 5至原始培養(yǎng)體積。為了去除細胞生物素，將IOOml的溶解沉淀物溶液在IL 的pH 1. 5的6M胍-HCl中進行滲析。然后將滲析液轉(zhuǎn)移至pH 6. 0的0. 2M醋酸鈉，以去除 胍并重折疊&iC。這里關(guān)鍵之處是去掉攪拌棒緩慢進行滲析。然后在3000g旋轉(zhuǎn)滲析液10 分鐘，以去除沉淀析出物，并將其過濾通過0.2 ！ -LmtllteH次微粒)。最后以的50mM碳 酸氫鹽，500mM NaCl, pH 11對重折疊的SaC進行滲析。如下對&iC進行提純。將重折疊的SaC和結(jié)合緩沖液(50mM碳酸氫鈉，500mM NaCl, IOmM b-Me, pH 11)1 1混合。用10毫升結(jié)合緩沖液洗滌裝有1. 5毫升亞氨基生物素瓊 膠糖樹脂(Pierce)的重力柱。然后將該重折疊混合物添加至該柱，收集流出部分并再次 添加至該柱，以最大化回收。用20毫升結(jié)合緩沖液洗滌該柱后，用pH4的洗脫緩沖液 (50mM乙酸鈉，IOmM -Me)洗出&iC。以0D280監(jiān)視，收集包含的部分，緩沖液更換為 包含IOmM -Me的PBS，并用IOK mwco過濾器(Millipore)濃縮至1毫克/毫升的最終濃 度。如下進行SaC低聚核苷酸結(jié)合。在使用之前，用脫鹽柱(Pierce)將原料SaC緩沖 液更換為含有5mM TCEP的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBS)。TCEP是含還原劑的nonthiol， 其在結(jié)合期間保持SaC的還原形式。將MHPH(3-N-馬來酰亞胺基-6-胼吡啶鹽酸鹽， Solulink)的DMF溶液在300 1摩爾過量下加入&iC。同時將SFB的DMF溶液(琥珀酰 亞胺基4-甲酰苯甲酸酯，Solulink)以40 1摩爾過量添加至5'胺化低聚物(IDT)。該混合物在室溫下反應(yīng)3-4小時。用脫鹽旋轉(zhuǎn)柱(Pierce)去除過量MHPH和SFB， 緩沖液更換為檸檬酸鹽緩沖液(50mM檸檬酸鈉，150mM NaCl, pH 6.0)。然后將該SFB標記 的低聚物以20 1摩爾過量和該衍生的SaC結(jié)合，并在轉(zhuǎn)移至4°C培育整夜之前在室溫下 使其反應(yīng)2-3小時。用Wiarmacia Superdex 200凝膠過濾柱以0. 5毫升/分鐘等濃度PBS 流去除未反應(yīng)的低聚物。用10K mwco濃度過濾器(Millipore)濃縮包含該MC-低聚物軛 合物的部分。用非還原的8% Tris-HCI SDS-PAGE檢驗&iC-低聚物構(gòu)造的合成。實施例 2 制造微陣列DNA微陣列是通過標準方法用系統(tǒng)生物學研究所(ISB-西雅圖，WA)的微陣列設(shè) 備印在胺涂覆玻片上。代表性的點尺寸是600f. lm(SMPXB 15針，Arrayit)。全部DNA鏈為 購買的集成DNA工藝，并且全部補體均為5'胺化。全部六個3D-mers的序列及其相應(yīng)的標 識給出于下表1和下表2中。表1.序列標識
權(quán)利要求
1.一種模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其被設(shè)置為與靶標特異性結(jié)合，該模塊化多核苷 酸編碼捕獲劑含有至少一個被設(shè)置為與靶標特異性結(jié)合的結(jié)合分子，被設(shè)置為與附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸特異性結(jié)合的編碼多核苷酸，和被設(shè)置為以位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域與該至少一個結(jié)合分子和該編碼多核苷酸結(jié) 合的支架分子，該位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域被布置在支架分子上，以在該至少一個結(jié)合分子以及該 編碼多核苷酸附著后，呈現(xiàn)至少一個用于特異性結(jié)合靶標的結(jié)合分子和呈現(xiàn)用于特異性結(jié) 合該基質(zhì)多核苷酸的編碼多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中該支架結(jié)合域包括用于結(jié)合該至少一個結(jié)合分子的第一支架結(jié)合區(qū)域，以及用于結(jié)合 該編碼多核苷酸的第二支架結(jié)合區(qū)域，和其中該第一支架結(jié)合域和該第二支架結(jié)合域通過正交化學過程結(jié)合該至少一個結(jié)合 分子和該編碼多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中該第一支架結(jié)合域和該第二 支架結(jié)合域被布置在該支架結(jié)合分子上，以最小化結(jié)合于該支架分子的該至少一個結(jié)合分 子和結(jié)合于該支架分子的該編碼多核苷酸之間的相互作用。
4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中該支架分子包括 多個第一支架結(jié)合域和/或多個第二支架結(jié)合域。
5.如權(quán)利要求4所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中該支架分子上的每一個多重 第一支架結(jié)合域結(jié)合至該至少一個結(jié)合分子，并且該支架分子上的每一個多重第二支架結(jié) 合域結(jié)合至該編碼多核苷酸。
6.如權(quán)利要求2至5任一項所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中該第一支架結(jié)合 域用連結(jié)物分子結(jié)合至該至少一個結(jié)合分子，該連結(jié)物分子用至少一個結(jié)合分子連接第一 支架結(jié)合域。
7.如權(quán)利要求6所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中該連結(jié)物分子是條件性連結(jié)物。
8.如權(quán)利要求1至7任一項所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中該至少一個結(jié)合 分子包括用于結(jié)合靶細胞的多個相同的或者不同的結(jié)合分子。
9.如權(quán)利要求1至8任一項所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中該編碼多核苷酸 包括至少一個布置限制性內(nèi)切酶位點，其被布置在該編碼多核苷酸中，以用于通過相應(yīng)的 限制性內(nèi)切酶裂解。
10.如權(quán)利要求1至9任一項所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中至少一個該支架 分子和該至少一個結(jié)合分子是蛋白。
11.如權(quán)利要求10所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中該支架分子是鏈霉親和 素，SAC, SAC3，抗體或者其優(yōu)化變體。
12.如權(quán)利要求10或11所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中至少一個結(jié)合分子是 MHC 二聚物，MHC三聚物，或者MHC四聚物，適配體，小分子或者抗體。
13.如權(quán)利要求1至12任一項所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，其中該模塊化多核苷酸編碼捕獲劑是極性的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑。
14.一種在樣品中檢測靶標的方法，該方法包括將附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸和模塊化多核苷酸編碼捕獲劑結(jié)合，該模塊化多核苷酸 編碼捕獲劑包括結(jié)合至少一個結(jié)合分子和編碼多核苷酸的支架分子，其中該至少一個結(jié)合 分子特異性結(jié)合至該靶標，并且該編碼多核苷酸特異性結(jié)合至附著于該基質(zhì)的該基質(zhì)多核 苷酸；和檢測與附著于該基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸結(jié)合的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中將附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸和模塊化多核苷酸 編碼捕獲劑進行結(jié)合是通過提供附著于該基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸；提供包括附著有至少一個結(jié)合分子和編碼多核苷酸的支架分子的模塊化多核苷酸編 碼捕獲劑，其中該至少一個結(jié)合分子特異性結(jié)合至該靶標，并且該編碼多核苷酸特異性結(jié) 合至該基質(zhì)多核苷酸；和將該模塊化多核苷酸編碼捕獲劑和樣品并且和基質(zhì)在允許該結(jié)合分子和模塊化多核 苷酸編碼捕獲劑-靶標復(fù)合物中的靶標結(jié)合的條件下接觸一段時間；和將該編碼多核苷酸與該基質(zhì)多核苷酸結(jié)合。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該模塊化的多核苷酸捕獲劑是權(quán)利要求1至13任 一項所述的模塊化的多核苷酸捕獲劑。
17.一種用于在樣品中檢測靶分子的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括具有附著于該基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸的基質(zhì)；至少一個特異性結(jié)合靶標的結(jié)合分子，特異性結(jié)合附著于該基質(zhì)的該基質(zhì)多核苷酸的編碼多核苷酸，和被設(shè)置為以位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域與該至少一個結(jié)合分子和該編碼多核苷酸結(jié) 合的支架分子，該位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域被布置在該支架分子上，以在和該至少一個結(jié)合分子和 該編碼多核苷酸結(jié)合后，呈現(xiàn)至少一個用于特異性結(jié)合靶標的結(jié)合分子和呈現(xiàn)用于特異性 結(jié)合該基質(zhì)多核苷酸的編碼多核苷酸。
18.如權(quán)利要求17所述的系統(tǒng)，其中該支架結(jié)合域包括用于結(jié)合該至少一個結(jié)合分子 的第一支架結(jié)合區(qū)域和用于結(jié)合該編碼多核苷酸的第二支架結(jié)合區(qū)域，和其中該第一支架結(jié)合域和該第二支架結(jié)合域通過正交化學過程結(jié)合該至少一個結(jié)合 分子和該編碼多核苷酸。
19.如權(quán)利要求18所述的系統(tǒng)，其中該第一支架結(jié)合域和該第二支架結(jié)合域被布置在 該支架結(jié)合分子上，以最小化結(jié)合于該支架分子的該至少一個結(jié)合分子和結(jié)合于該支架分 子的該編碼多核苷酸之間的相互作用。
20.一種用于分類復(fù)數(shù)個靶標中的靶標的方法，該方法包括將復(fù)數(shù)個附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸和復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑結(jié)合，各基 質(zhì)多核苷酸是序列特異性和彼此位置可區(qū)分的，并且該復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑 中每一個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑包括附著有至少一個結(jié)合分子和編碼多核苷酸的支架分子，其中該至少一個結(jié)合分子特異性結(jié)合每一個該復(fù)數(shù)個靶標，并且該編碼多核苷酸 特異性結(jié)合該復(fù)數(shù)個基質(zhì)多核苷酸中序列特異性和位置可區(qū)分的基質(zhì)多核苷酸，每一個結(jié) 合分子和編碼多核苷酸彼此是結(jié)合可區(qū)分的；和在復(fù)數(shù)個結(jié)合至基質(zhì)的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑-靶標-復(fù)合物中分類該復(fù)數(shù)個靶標。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑包括權(quán)利要 求1至13任一項所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑。
22.一種用于在樣品中分類復(fù)數(shù)個靶標中的靶標的方法，該方法包括提供復(fù)數(shù)個附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸，各基質(zhì)多核苷酸是序列特異性和彼此位置可 區(qū)分的；提供復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑，各模塊化多核苷酸編碼捕獲劑包括附著至少 一個結(jié)合分子和編碼多核苷酸的支架分子，其中該至少一個結(jié)合分子特異性結(jié)合該復(fù)數(shù)個 靶標中的預(yù)定靶標，并且該編碼多核苷酸特異性結(jié)合該復(fù)數(shù)個基質(zhì)多核苷酸中序列特異性 和位置可區(qū)分的基質(zhì)多核苷酸，各結(jié)合分子和編碼多核苷酸是彼此結(jié)合可區(qū)分的；將該復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑和該樣品在允許該至少一個結(jié)合分子和該靶 標結(jié)合的條件下接觸一段時間，由此提供復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑-目標體系； 和將該復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑-目標體系和該復(fù)數(shù)個基質(zhì)多核苷酸在允許 該編碼多核苷酸結(jié)合至附著于該基質(zhì)的該基質(zhì)多核苷酸條件下接觸一段時間，由此在復(fù)數(shù)個結(jié)合至基質(zhì)的多核苷酸-編碼蛋白-靶標-復(fù)合物中分類該復(fù)數(shù)個靶標。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中該復(fù)數(shù)個模塊化多核苷酸編碼捕獲劑包括權(quán)利要 求1至13任一項所述的模塊化多核苷酸編碼捕獲劑。
24. 一種用于分類復(fù)數(shù)個靶標的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括具有復(fù)數(shù)個附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸的基質(zhì)，附著于該基質(zhì)的該復(fù)數(shù)個基質(zhì)多核苷 酸的各多核苷酸是序列特異性和彼此位置可區(qū)分的；復(fù)數(shù)個結(jié)合分子，各結(jié)合分子特異性結(jié)合該復(fù)數(shù)個靶標中的互補靶標， 復(fù)數(shù)個編碼多核苷酸，各編碼多核苷酸特異性結(jié)合附著于該基質(zhì)的該復(fù)數(shù)個基質(zhì)多核 苷酸的每個多核苷酸，至少一個支架分子，其被設(shè)置為用位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域結(jié)合該復(fù)數(shù)個結(jié)合分子 中每個結(jié)合分子，以及該復(fù)數(shù)個編碼多核苷酸中每個編碼多核苷酸，該位置可區(qū)分的支架結(jié)合區(qū)域被布置在該支架分子上，以在和該至少一個結(jié)合分子和 該編碼多核苷酸結(jié)合后，呈現(xiàn)至少一個用于特異性結(jié)合靶標的結(jié)合分子和呈現(xiàn)用于特異性 結(jié)合該基質(zhì)多核苷酸的編碼多核苷酸。
25.一種支架分子，包括被設(shè)置為附著至少一個結(jié)合分子的第一支架結(jié)合區(qū)域和 被設(shè)置為附著編碼多核苷酸的第二支架結(jié)合區(qū)域，其中該至少一個結(jié)合分子被設(shè)置為與靶標特異性結(jié)合，并且該編碼多核苷酸被設(shè)置為 與附著于基質(zhì)的基質(zhì)多核苷酸特異性結(jié)合；和其中該第一支架結(jié)合域和該第二支架結(jié)合域是位置可區(qū)分的，并被布置于該支架分子 中，以在該至少一個結(jié)合分子和該第一結(jié)合域結(jié)合，并且該編碼多核苷酸和該第二結(jié)合域 結(jié)合后，最小化該至少一個結(jié)合分子和該編碼多核苷酸之間的相互作用。
26.如權(quán)利要求25所述的支架分子，其中該支架分子是SAC或者SAC3。
27.一種多核苷酸編碼捕獲劑，包括 特異性結(jié)合靶標的結(jié)合分子和附著于該結(jié)合分子的編碼多核苷酸，其中該編碼多核苷酸包括特異性結(jié)合至基質(zhì)多核苷酸的序列，并且該序列包括至少一 個布置限制性內(nèi)切酶位點，其被布置在該編碼多核苷酸中，以用于通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切 酶裂解。
全文摘要
用于靶標檢測的多核苷酸-編碼捕獲劑，特別是模塊化的多核苷酸-捕獲劑，以及相關(guān)的組合物方法和系統(tǒng)。該多核苷酸-捕獲劑包括靶標結(jié)合組分，支架組分，和由能夠以受控方式結(jié)合和分離的標準化分子單元形成的編碼組分。
文檔編號C12Q1/68GK102112626SQ200980121611
公開日2011年6月29日 申請日期2009年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月9日
發(fā)明者凱厄斯·G·拉度, 安東尼·里巴斯, 歐文·威特, 蓋布里埃爾·A·古昂, 詹姆士·赫斯 申請人:加利福尼亞大學董事會, 加州理工學院