專利名稱：分支桿菌的快速檢測的制作方法
分支桿菌的快速檢測本發(fā)明涉及樣品中分支桿菌的快速檢測方法和其試劑及試劑盒。作為結(jié)核感染(TB)的病原體(aetiological agent)，結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis) (Μ. tuberculosis)是世界范圍傳染病死亡的主要原 因——潛伏感染影響差不多三分之一的世界人口。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)全球每年幾乎 九百萬的新的TB病例和幾乎二百萬的死亡出現(xiàn)。2005年中最大數(shù)量的新的TB病例出現(xiàn)在 東南亞(全球34%的新發(fā)病例)，并且估計(jì)在撒哈拉以南非洲的發(fā)病率幾乎為每100，000 人群中350例病例。然而，TB感染不限于發(fā)展中世界自從20世紀(jì)80年代后期，UK已經(jīng)觀察到結(jié)核 病的再現(xiàn)，并且目前每年超過8000例的新病例——每100，000人群中14. 0例的比例。大 約40%的這些新病例出現(xiàn)在倫敦地區(qū)，在這里的感染率為每100，000人群中44. 8例。高度 危險(xiǎn)的人群包括一些移民群體、無家可歸的人、犯人和問題藥物使用者。TB感染通常通過抗生素的6個月過程可以治療；然而，患者對藥物治療的依從性 改變，當(dāng)它們的癥狀停止時(shí)患者通常停止治療。另外，TB比例在移民人群中是高的，使得實(shí) 行跟進(jìn)的治療困難。如果不治療，活性TB疾病的每個人將在每年平均感染10到15個人之 間。WHO認(rèn)可的綜合策略——稱為“直接觀察治療短期過程(Directly Observed Therapy Short-course) “ (DOTS)是增加藥物依從性和減少多藥物抗性結(jié)核分枝桿菌菌株出現(xiàn)的一 種方法。該WHO方法的一方面集中能夠進(jìn)行和促進(jìn)研究，認(rèn)識到TB的消除將依賴于新的診 斷學(xué)、藥物和疫苗。因?yàn)樽罴训幕颊吖芾硇枰幬镏委煹谋M早開始和盡可能快地隔離感染的個體，所 以在現(xiàn)有技術(shù)中存在對快速和可靠的檢測技術(shù)的需要。然而，傳統(tǒng)的TB感染的診斷方法或是長時(shí)間(生物培養(yǎng))的，或者潛在地缺少靈 敏性(抗酸性涂片鏡檢)。肺外TB的診斷由于使用已知技術(shù)獲得足夠的檢測材料的困難性 而變得復(fù)雜。更具體地，檢測分支桿菌的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)需要熟練的技術(shù)人員并可能導(dǎo)致多達(dá) 八周的診斷結(jié)果延遲。當(dāng)前的WHO指導(dǎo)方針推薦具有可疑TB的人提交至少三份痰樣品(在 分開的場合產(chǎn)生)以增加檢測活動性TB的可能性。為了通過萋-尼染色(Ziehl Neelsen staining)檢測痰中的分支桿菌，需要每毫 升痰超過5，000個生物以通過光學(xué)顯微鏡看到桿菌。這樣，“涂片”試驗(yàn)通常缺少靈敏度和 特異性。而且，在患有活動性肺TB的患者中，只有估計(jì)的45%的感染通過痰顯微鏡方法檢 測到(Dye等人，2005)。分支桿菌的培養(yǎng)仍然是診斷和藥物敏感性測試的金標(biāo)準(zhǔn)，并且可以檢測少至每毫 升痰10個生物。然而，這種技術(shù)由于長的溫育時(shí)間(多至數(shù)周用于診斷)和在野外執(zhí)行的 困難性而受到妨礙(Kent和Kubica，1985)。結(jié)核分支桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex) (MTBc)包括五個 種結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、田鼠分枝桿菌(M. microti)、牛分支桿菌(M. bovis)、 Μ. canetti和非洲分支桿菌(M. africanum)——它們是全世界范圍內(nèi)大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌感染(TB)病例的病原體。在這些種之間的高水平的DNA序列同一性已經(jīng)限制了使用DNA 序列在MTBc的成員之間進(jìn)行區(qū)分。由于在診斷分支桿菌學(xué)領(lǐng)域中引入核酸擴(kuò)增分析，所以已經(jīng)發(fā)展了多種室內(nèi)和商 業(yè)分析。作為實(shí)例，Roche AMPLICOR. MTB系統(tǒng)擴(kuò)增所有分支桿菌共有的16S rRNA基因 序列的584-bp區(qū)域。目前檢測和分型MTB復(fù)合群“MTBc”的分支桿菌的分子方法學(xué)包括轉(zhuǎn)座因子 IS6110的擴(kuò)增(Thierry等人，1990 ；Yuen等人，1995)。然而，基于IS6110的方法具有不佳 的再現(xiàn)性和不佳的靈敏度。在這方面，IS6110的拷貝數(shù)在MTBc的成員之間不同，并且似乎是菌株依賴性的 (Poulet和Cole，1995)。盡管MTBc的許多成員包含在整個基因組中分散的8_15個拷貝的 IS6110，但是大約40%的結(jié)核分枝桿菌菌株僅具有該因子的一個或兩個拷貝，而牛分支桿 菌只包含(平均)單個拷貝。在20世紀(jì)90年代晚期，報(bào)道了使用基于PCR技術(shù)、稱為“間隔區(qū)寡核苷酸分型 (spacer oligotyping) ”(間隔區(qū)寡核苷酸分型法(spoligotyping))的技術(shù)，根據(jù)檢測在 MTBc菌株中廣泛存在的36bp同向重復(fù)(DR)基因座內(nèi)的25_41bp的43個已知的多態(tài)性“間 隔”區(qū)域的存在或不存在，同時(shí)進(jìn)行分支桿菌的檢測和菌株區(qū)分(Kamerbeek等人，1997)。 在基因組中的DRs總量以及特定間隔區(qū)域的存在或不存在方面，菌株存在變化。因此，像基 于IS6110的方法一樣，間隔區(qū)寡核苷酸分型法缺少區(qū)分能力?！癪木干胃！^^ 白勺；gL7t” (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) (MIRUs)是分散在位于整個MTBc分支桿菌基因組的約41個基因座中的可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù) 序列(VNTRs)。每個MIRU基因座包含可變數(shù)量的串聯(lián)的MIRU重復(fù)序列元件(多至每個基 因座約13個重復(fù)元件)。Supply等人2001，描述了基于確定在結(jié)核分枝桿菌基因組中MIRU基因座處的串 聯(lián)重復(fù)的數(shù)量對結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行基因分型的方法。Supply等人描述的方法包括使用 對位于MIRU基因座側(cè)翼的結(jié)核分枝桿菌基因組的區(qū)域特異的引物的PCR擴(kuò)增。生成的擴(kuò) 增子的大小反映在每個MIRU基因座的重復(fù)的數(shù)量。在本領(lǐng)域中存在對快速、簡單、特異和高度靈敏的分子方法的需求，所述方法在低 至單個基因組拷貝的水平下檢測樣品如痰和呼吸道樣本中的分支桿菌——優(yōu)選為“當(dāng)場 (on-the-spot)”技術(shù)，其被容易地被運(yùn)輸進(jìn)入現(xiàn)場，例如在發(fā)展中世界。本發(fā)明通過提供檢測樣品中屬于MTB復(fù)合群的分支桿菌的方法來滿足這種需求， 所述方法包括使樣品與一對正向和反向寡核苷酸引物接觸；其中所述正向引物與位于分支桿菌散布重復(fù)單元(MIRU)重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序 列雜交；和其中所述反向引物與位于分支桿菌散布重復(fù)單元(MIRU)重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序 列雜交；(b)延伸所述正向和反向引物以生成擴(kuò)增產(chǎn)物；和(c)檢測所述擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法有利地提供結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBc)的分支桿菌諸如結(jié)核分枝桿菌或牛分支桿菌的高度靈敏、快速和耐用的分子診斷分析。整個MTBc分支桿菌基因組中的MIRU重復(fù)的特定排列顯著增加分析的靈敏性。在一個實(shí)施方式中，有利地是，可以在兩個小時(shí)以內(nèi)從分析中獲得結(jié)果。在一個實(shí) 施方式中，有利地是，分析能夠從痰直接進(jìn)行單分子檢測。在一個實(shí)施方式中，有利地是，可 以從微體積的患者樣品(例如，痰)直接獲得結(jié)果而不需要耗時(shí)的核酸提取步驟。因此，在一個實(shí)施方式中，所述分析顯著地減少等待時(shí)間并且理論上允許近患者 ^驗(yàn)(near-patient testing)。本要求保護(hù)的分析的進(jìn)一步優(yōu)勢是它的簡單性——它優(yōu)選地可以通過非專家工 作人員進(jìn)行和讀取，并且是非勞動密集型的。MIRU重復(fù)元件包括對MTB復(fù)合群的成員特異的核酸序列。因此，在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的檢測方法基于該MTBCs-特異核酸序列的擴(kuò)+曰O
在一個實(shí)施方式中，與正向引物雜交的靶核酸序列對于MTB復(fù)合群的分支桿菌特 異。在一個實(shí)施方式中，與反向引物雜交的靶核酸序列對于MTB復(fù)合群的分支桿菌特異。在一個實(shí)施方式中，正向和反向引物的延伸生成包括MTB復(fù)合群特異的核酸序列 的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一個實(shí)施方式中，檢測包括MTB復(fù)合群特異的核酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一個實(shí)施方式中，與正向引物雜交的靶核酸序列不位于MIRU4重復(fù)元件(也稱 為ETRD重復(fù)元件)內(nèi)。在一個實(shí)施方式中，與反向引物雜交的靶核酸序列不位于MIRU4重 復(fù)元件(也稱為ETRD重復(fù)元件)內(nèi)。在一個實(shí)施方式中，正向引物和反向引物都不與位于 MIRU4重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序列雜交。在一個實(shí)施方式中，擴(kuò)增產(chǎn)物不包括MIRU4重復(fù)元件 核酸序列。在一個實(shí)施方式中，MIRU重復(fù)元件具有與選自以下的MIRU重復(fù)元件至少90%的 序列同一性(優(yōu)選為91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性):MIRU2重復(fù) 元件、MIRUlO重復(fù)元件、MIRU16重復(fù)元件、MIRU23重復(fù)元件、MIRU24重復(fù)元件、MIRU26重 復(fù)元件、MIRU27重復(fù)元件(也稱為QUB5重復(fù)元件)、MIRU31重復(fù)元件(也稱為ETRE重復(fù) 元件)和MIRU39重復(fù)元件。因此，在一個實(shí)施方式中，正向引物與位于MIRU重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序列雜交， 其中所述MIRU重復(fù)元件具有與選自以下的MIRU重復(fù)元件至少90%的序列同一性(優(yōu)選 為 91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性):MIRU2 重復(fù)元件、MIRUlO 重復(fù)元 件、MIRU16重復(fù)元件、MIRU23重復(fù)元件、MIRU24重復(fù)元件、MIRU26重復(fù)元件、MIRU27重復(fù) 元件(也稱為QUB5重復(fù)元件)、MIRU31重復(fù)元件(也稱為ETRE重復(fù)元件)和MIRU39重復(fù) 元件。在一個實(shí)施方式中，所述靶核酸序列對于MTB復(fù)合群的分支桿菌特異。在一個實(shí)施方式中，反向引物與位于MIRU重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序列雜交，其中所 述MIRU重復(fù)元件具有與選自以下的MIRU重復(fù)元件至少90 %的序列同一性(優(yōu)選為91、 92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 % 的序列同一性):MIRU2 重復(fù)元件、MIRUlO 重復(fù)元件、 MIRU16重復(fù)元件、MIRU23重復(fù)元件、MIRUM重復(fù)元件、MIR似6重復(fù)元件、MIRU27重復(fù)元件 (也稱為QUB5重復(fù)元件)、MIRU31重復(fù)元件(也稱為ETRE重復(fù)元件)和MIRU39重復(fù)元件。 在一個實(shí)施方式中，所述靶核酸序列對于MTB復(fù)合群的分支桿菌特異。
作為實(shí)例，結(jié)核分枝桿菌的⑶C1551菌株的基因組包括在MIRU2基因座處的3個 串聯(lián)重復(fù)元件、在MIRUlO基因座處的5個串聯(lián)重復(fù)元件、在MIRU16基因座處的3個串聯(lián)重 復(fù)元件、在MIRU23基因座處的5個串聯(lián)重復(fù)元件、在MIRUM基因座處的1個串聯(lián)重復(fù)元件、 在MR似6基因座處的5個串聯(lián)重復(fù)元件、在MIRU27/QUB5基因座處的4個串聯(lián)重復(fù)元件、 在MIRU31/ETRE基因座處的3個串聯(lián)重復(fù)元件和在MIRU39基因座處的2個串聯(lián)重復(fù)元件。因此，在一個實(shí)施方式中，正向引物與位于MIRU重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序列雜交， 其中所述MIRU重復(fù)元件具有與選自以下的MIRU重復(fù)元件(參照結(jié)核分枝桿菌的⑶C1551 菌株)至少90%的序列同一性(優(yōu)選為91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同 一性)MIRU2 重復(fù)元件 1、2 禾口 3 ；MIRUlO 重復(fù)元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU16 重復(fù)元件 1、2 和 3 ；MIRU23 重復(fù)元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU24 重復(fù)元件 1 ；MIRU26 重復(fù)元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU27/QUB5重復(fù)元件1、2、3和4(優(yōu)選為MIRU27/QUB5串聯(lián)重復(fù)元件2、3和4)；MIRU31/ETRE重復(fù)元件1、2和3 (優(yōu)選為MIRU31/ETRE重復(fù)元件2和3)；禾口MIRU39重復(fù)元件1和2。在一個實(shí)施方式中，反向引物與位于MIRU重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序列雜交，其中所 述MIRU重復(fù)元件具有與選自以下的MIRU重復(fù)元件(參照結(jié)核分枝桿菌的CDC1551菌株) 至少90%的序列同一性(優(yōu)選為91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性)MIRU2 重復(fù)元件 1、2 禾口 3 ；MIRUlO 重復(fù)元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU16 重復(fù)元件 1、2 和 3 ；MIRU23 重復(fù)元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU24 重復(fù)元件 1 ；MIRU26 重復(fù)元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU27/QUB5重復(fù)元件1、2、3和4(優(yōu)選為MIRU27/QUB5串聯(lián)重復(fù)元件2、3和4)；MIRU31/ETRE重復(fù)元件1、2和3 (優(yōu)選為MIRU31/ETRE重復(fù)元件2和3)；禾口MIRU39重復(fù)元件1和2。在一個實(shí)施方式中，所述MIRU重復(fù)元件包括(并且可以由以下組成)具有與選自 SEQ ID NOs :1- 的核苷酸序列(如在以下表1中顯示)或其互補(bǔ)序列的至少90%序列同 一性(優(yōu)選為91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性)的核苷酸序列。表 1SEQ ID NO:序列(5’到3’)1 2345678910 11 12 13AGGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTGTGCATC GTCGCTGGCGCGAGTCATAGGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTGTGCAT CGTCGCCGGCGCGAGTCATAGGCGCCGCTCTCCCCCGCAAGTGGGAGGTGCC CCCACCTCATGTGTGGTCAACT ATGGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTGCGCTCTGCAT CGTCGCCGGCGGTAGTTAATGGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTGCGCTCTGCAT CGTCGCCGGCGGTAGTCAATGGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTGCGCTCTGCAT CGTCGCCGGCGCGGGGGTCAT GCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTCTGCATCGTCG TCGGCGCGGTTCACGAGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTCTGCAT CGTCGTCGGCGCGGTTCACGAGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTCTGCAT CGTCGTCGGCGCGGCTCACGTGG TGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTCTGCATCG TCACCGGCGCGACTCATCTGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTCTGCATC GTCACCGGCGCGACTCATCTGCGCCGCTCCTGCTCATCGCTTCGCTCTGCAT CGTCACCGGCGCGACTCATCTGCGCCGCTCCTCTCATCGCTTCGCTCTGCATC10
權(quán)利要求
1.檢測樣品中屬于MTB復(fù)合群的分支桿菌的方法，所述方法包括(a)使所述樣品與一對正向和反向寡核苷酸引物接觸；其中所述正向引物與位于分支桿菌散布重復(fù)單元(MIRU)重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序列雜 交；并且其中所述反向引物與位于分支桿菌散布重復(fù)單元(MIRU)重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序列雜、-父；(b)延伸所述正向引物和反向引物以生成擴(kuò)增產(chǎn)物；和(c)檢測所述擴(kuò)增產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述MIRU重復(fù)元件選自MIRU2重復(fù)元件、MIRUlO 重復(fù)元件、MIRU16重復(fù)元件、MIRU23重復(fù)元件、MIRUM重復(fù)元件、MIR似6重復(fù)元件、MIRU27 重復(fù)元件、MIRU31重復(fù)元件和MIRU39重復(fù)元件。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述MIRU重復(fù)元件包括與選自SEQID NOs 1-24的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，或其互補(bǔ)序列。
4.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述正向引物和所述反向引物為15-30個 核苷酸長。
5.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述正向引物與靶核酸序列雜交，所述靶 核酸序列包括與選自SEQ ID NOs 25-39的核苷酸序列的互補(bǔ)序列至少90%同一性的核苷 酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述正向引物靶序列包括選自SEQID NOs :25-39 的核苷酸序列的互補(bǔ)序列。
7.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述反向引物與靶核酸序列雜交，所述靶 序列包括與選自SEQ ID NOs 40-46的核苷酸序列至少90%同一性的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述反向引物靶序列包括選自SEQID NOs :40-46 的核苷酸序列。
9.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述正向引物包括與選自SEQID NO 47 或48的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列、或包括其至少15個連續(xù)核苷酸的 其片段。
10.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述反向引物包括與選自SEQID NO 49-51的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列、或包括其至少15個連續(xù)核苷酸的 其片段。
11.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的方法，其中(i)所述正向引物具有與選自SEQID NO :47或48的核苷酸序列至少80%的同一性， 或具有包括其至少15個連續(xù)核苷酸的其片段；和(ii)所述反向引物具有與選自SEQID NOs :49-51的核苷酸序列具有至少80%同一性 的核苷酸序列、或包括其至少15個連續(xù)核苷酸的其片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求5至11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述正向引物和反向引物與位于相 同分支桿菌散布重復(fù)單元(MIRU)重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序列雜交。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物為30-55個核苷酸長，優(yōu)選為 40-50個核苷酸長，最優(yōu)選為約44個核苷酸長。
14.根據(jù)權(quán)利要求5至11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述正向引物和所述反向引物與位 于不同分支桿菌散布重復(fù)單元(MIRU)重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序列雜交。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物包括來自相同MIRU基因座內(nèi)的兩 個或更多個鄰近MIRU重復(fù)元件的核酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物包括來自不同MIRU基因座內(nèi)的兩 個或更多個MIRU重復(fù)元件的核酸序列。
17.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述正向引物和/或所述反向引物包括 標(biāo)記或標(biāo)簽。
18.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的方法，其中標(biāo)記或標(biāo)簽在引物延伸步驟期間摻入所 述擴(kuò)增產(chǎn)物中，并且其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物通過包括捕獲所述標(biāo)記或檢測所述標(biāo)簽的方法進(jìn)行 檢測。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物包括生物素標(biāo)記，并且其中所述 檢測步驟包括使所述樣品與捕獲所述生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈親和素包被的磁珠接觸。
20.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物通過包括以下的方法檢測(i)使所述樣品與寡核苷酸探針接觸，所述寡核苷酸探針與所述擴(kuò)增產(chǎn)物——如果存 在——形成雜交復(fù)合體，和( )檢測所述雜交復(fù)合體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述寡核苷酸探針為5-30個核苷酸長，優(yōu)選為 8-12個核苷酸長。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其中所述寡核苷酸探針包括與選自SEQID NOs :52-57的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列、或具有其至少8個連續(xù)核苷 酸的其片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22任一項(xiàng)所述的方法，其中所述寡核苷酸探針包括標(biāo)記或標(biāo)簽。
24.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物通過包括解鏈曲線分析的 方法檢測。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物具有在90-95°C范圍內(nèi)的Tm，優(yōu)選 在92-93°C范圍內(nèi)的Tm，最優(yōu)選為約92. 5°C的Tm。
26.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物通過包括以下的方法檢測 (i)使所述樣品與消化所述擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性核酸內(nèi)切酶接觸；和( )鑒定所述擴(kuò)增產(chǎn)物的消化產(chǎn)物。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的消化產(chǎn)物通過包括凝膠電泳的 方法檢測。
28.定量感興趣樣品中MTBc分支桿菌負(fù)載的體外方法，包括(a)在所述感興趣樣品上進(jìn)行根據(jù)任何前述權(quán)利要求的檢測方法；(b)在預(yù)先確定的已知MTB分支桿菌負(fù)載的測試樣品上進(jìn)行所述方法；和(c)比較檢測的所述感興趣樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的量與檢測的所述測試樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的量；并且由此定量所述感興趣樣品中的MTBc分支桿菌負(fù)載。
29.確定在藥物治療期間的過程中抗MTBc分支桿菌藥物的效力的體外方法，包括(a)在藥物治療期間之內(nèi)或之前的第一時(shí)間點(diǎn)獲得的第一樣品上進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求 1-27任一項(xiàng)的檢測方法；(b)在藥物治療期間之內(nèi)或之后的一個或多個稍后時(shí)間點(diǎn)獲得的一個或多個樣品上進(jìn) 所述方法；和(c)比較檢測的所述第一樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的量與檢測的所述一個或多個稍后樣品的擴(kuò) 增產(chǎn)物的量；并且由此確定在藥物治療期間的過程中的藥物效力，其中與檢測的所述第一樣品的擴(kuò) 增產(chǎn)物的量相比，檢測的所述一個或多個稍后樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的量的減少顯示所述藥物對 MTBc分支桿菌的效力。
30.確定疫苗對MTBc分支桿菌感染的效力的體外方法，包括(a)在接種疫苗之前的第一時(shí)間點(diǎn)從患者獲得的第一樣品上進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求1-27 任一項(xiàng)的檢測方法；(b)在接種疫苗和用MTBc分支桿菌攻擊之后的一個或多個稍后時(shí)間點(diǎn)從所述患者獲 得的樣品上進(jìn)行所述方法；和(c)比較檢測的所述第一樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的量與檢測的所述一個或多個稍后樣品的擴(kuò) 增產(chǎn)物的量；并且由此確定疫苗的效力，其中與檢測的所述第一樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的量相比，檢測的 所述一個或多個稍后樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的量的減少顯示所述疫苗對MTBc分支桿菌感染的效 力。
31.與位于MIRU重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序列雜交的正向寡核苷酸引物，所述靶核酸序列 包括與選自SEQ ID NOs 25-39的核苷酸序列的互補(bǔ)序列至少90%同一性的核苷酸序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的正向引物，其中所述正向引物包括與選自SEQID N0:47或 48的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列、或包括其至少15個連續(xù)核苷酸的其 片段。
33.與位于MIRU重復(fù)元件內(nèi)的靶核酸序列雜交的反向寡核苷酸引物，所述靶核酸序列 包括與選自SEQ ID NOs 40-46的核苷酸序列至少90%同一性的核苷酸序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的反向引物，其中所述反向引物包括與選自SEQID NOs 49-51的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列、或包括其至少15個連續(xù)核苷酸的 其片段。
35.一對正向和反向寡核苷酸引物，包括根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的正向引物和根據(jù) 權(quán)利要求33或34所述的反向引物。
36.檢測樣品中屬于MTB復(fù)合群的分支桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括根據(jù)權(quán)利要求 35所述的一對正向和反向寡核苷酸引物、擴(kuò)增MTB復(fù)合體特異的核酸序列的試劑和/或檢 測擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中檢測所述擴(kuò)增產(chǎn)物的所述試劑包括與所述擴(kuò) 增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的試劑盒，其中所述探針包括與選自SEQID NOs :52-57的 核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列，或包括其至少8個連續(xù)核苷酸的其片段。
39.根據(jù)權(quán)利要求36-38任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中檢測所述擴(kuò)增產(chǎn)物的所述試劑包 括消化所述擴(kuò)增產(chǎn)物的酶。
40.如在此之前描述的和/或在實(shí)施例和/或附圖
中說明的方法、正向引物、反向引物 或試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供檢測屬于樣品中的MTB復(fù)合體的分支桿菌的方法，所述方法包括(a)使所述樣品與一對正向和反向寡核苷酸引物接觸；其中所述正向引物雜交到位于分支桿菌散布重復(fù)單元(MIRU)重復(fù)因子內(nèi)的靶核酸序列；和其中所述反向引物雜交到位于分支桿菌散布重復(fù)單元(MIRU)重復(fù)因子內(nèi)的靶核酸序列；(b)延伸所述正向和反向引物生成擴(kuò)增產(chǎn)物；和(c)檢測所述擴(kuò)增產(chǎn)物。
文檔編號C12Q1/68GK102057055SQ200980121612
公開日2011年5月11日 申請日期2009年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月9日
發(fā)明者C·阿諾德 申請人:健康保護(hù)機(jī)構(gòu)