專利名稱：狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸突變株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于重組病毒疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒 疫苗株，其表達(dá)的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣?氨酰胺Q。更具體地，本發(fā)明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸突變株 rLEP333Q。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述突變株的方法，以及所述突變株的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狂犬病即瘋狗癥，又名恐水癥，是由狂犬病病毒引起的、侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性 病毒性人獸共患性傳染病。幾乎所有的溫血?jiǎng)游锒紝?duì)狂犬病病毒易感。犬類動(dòng)物在傳播人 狂犬病過(guò)程中起主要作用，是本病的主要宿主之一。此外，貓、浣熊、狐貍和蝙蝠等也會(huì)患病 并傳播病毒?？袢鞑ネ緩街饕峭ㄟ^(guò)動(dòng)物咬傷后，唾液中的狂犬病病毒經(jīng)破損皮膚侵 入機(jī)體。此外，還可通過(guò)消化道、呼吸道以及動(dòng)物密切接觸等途徑傳播?？袢∈瞧駷橹?人類病死率最高的急性傳染病，一旦發(fā)病，病死率可高達(dá)100%?？袢∈且环N很重要的人 畜共患病，在世界范圍內(nèi)每年約有60，000余人死于狂犬病[1]，引起嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題， 主要分布在亞洲、非洲和拉丁美洲等發(fā)展中國(guó)家。中國(guó)也是受狂犬病危害最為嚴(yán)重的國(guó)家 之一?？袢〉念A(yù)防主要通過(guò)疫苗免疫的方式進(jìn)行。狂犬病疫苗種類繁多，效果不一。 自從1940年，Koprowski等人從病死女孩腦內(nèi)分離到狂犬病病毒Flury株，經(jīng)1日齡雛雞 腦內(nèi)、雞胚卵黃囊傳代后，再經(jīng)雞胚傳代178代以上，無(wú)論神經(jīng)內(nèi)、外接種都對(duì)動(dòng)物喪失致 病力，但對(duì)于新生乳鼠和猴在腦內(nèi)接種時(shí)仍具有殘留毒力。在雞胚傳代68代以前的稱為 “LEP” (雞胚低代株)，高于136代的稱為“HEP” (雞胚高代株)。Flury-LEP株具有優(yōu)良的 免疫原性，被廣泛用作人或動(dòng)物的狂犬病滅活疫苗種毒株，還被包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家 用作預(yù)防犬狂犬病的弱毒疫苗。科研工作者一直不間斷地對(duì)狂犬病疫苗進(jìn)行改進(jìn)和創(chuàng)新， 取得了豐碩的成果，但仍然存在很多不足。我國(guó)目前生產(chǎn)ERA株和Flury株活疫苗。狂犬 病弱毒疫苗在體內(nèi)的增殖過(guò)程與病原感染機(jī)體的過(guò)程相似，能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免 疫，且產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，在我國(guó)狂犬病防治工作中曾起到一定的積極作 用。但有的疫苗毒株本身對(duì)乳鼠致病，對(duì)懷孕動(dòng)物、免疫機(jī)能不全的動(dòng)物和幼小動(dòng)物使用不 安全，而且存在毒力回升、返祖的潛在危險(xiǎn)。因此，存在獲得更加安全的減毒活病毒疫苗株 的需要?？袢〔《緦儆趶棤畈《究啤⒖袢《緦?，為不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因 組長(zhǎng)約12kb，共編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、囊膜糖蛋白(G) 和RNA聚合酶(L)。囊膜糖蛋白G(簡(jiǎn)稱糖蛋白或G蛋白)是狂犬病病毒最主要的致病因 子[2’3]。G蛋白主要功能包括，與細(xì)胞表面受體相互作用以介導(dǎo)病毒快速侵入細(xì)胞[4’5’6]，與 RNA-NP-M復(fù)合物相互作用使病毒出芽[7]。G蛋白的表達(dá)水平必須控制在一定的水平以防止 對(duì)感染神經(jīng)細(xì)胞的功能性破壞[3]。多項(xiàng)研究表明G蛋白第333位為影響病毒毒力的關(guān)鍵位
占[2,8,9,10] W、O
Flury-LEP雖然已高度致弱，對(duì)狗沒(méi)有致病性，但是腦內(nèi)接種小鼠仍致死，且G蛋 白第333位仍是R。本研究采用負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳(reverse genetics)操作技術(shù)，對(duì) Flury-LEP G蛋白第333位R進(jìn)行人工突變，預(yù)期獲得進(jìn)一步致弱的狂犬病弱毒疫苗株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明屬于重組病毒疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒 疫苗株，具體地，所述突變?nèi)醵疽呙缰瓯磉_(dá)的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨 基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨０稱。更具體地，本發(fā)明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白 (G)第333位氨基酸突變株rLEP333Q，其中所述狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位 氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨０稱。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述突變株的方法，以及所述突變 株的應(yīng)用。在第一方面中，本發(fā)明構(gòu)建了 Flury-LEP全長(zhǎng)基因組cDNA (SEQ IDN0:1)克隆 pCI-LEP 和 cDNA 片段克隆 pCI_F2，pCI_F3，pCI_F31，pBlue-Fl，pBlue_F2 和 pBlue_F3，以 及轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒系統(tǒng)pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG_L，所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒分別包括編碼狂犬病 病毒Flury-LEP核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因的開(kāi)放閱讀框架(ORF)的 cDNA序列。在第二方面中，本發(fā)明利用第一方面構(gòu)建的Flury-LEP全長(zhǎng)基因組cDNA片段克隆 pBlue-F2和pCI-F31，設(shè)計(jì)帶有糖蛋白(G)第333氨基酸位點(diǎn)突變(R333Q)的PCR引物，成 功構(gòu)建了 Flury-LEP G333突變?nèi)L(zhǎng)基因組cDNA重組載體pCI_LEP333Q。在所述重組載體 PCI-LEP333Q中，編碼狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)的核苷酸包含堿基突變，使得糖蛋白 (G)第333位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨０稱。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，用于構(gòu)建狂犬病病毒Flury-LEP全長(zhǎng)基因組 cDNA重組載體以及構(gòu)建Flury-LEP G333突變?nèi)L(zhǎng)基因組cDNA重組載體的質(zhì)粒包括，但不 限于，PCI，只要攜帶CMV啟動(dòng)子的質(zhì)粒都可以用于本發(fā)明，例如，pCAGG等。利用攜帶CMV 啟動(dòng)子的質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于，攜帶CMV啟動(dòng)子的質(zhì)粒利用細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄， 而無(wú)需傳統(tǒng)的T7聚合酶系統(tǒng)，因此理論上可以在任何真核細(xì)胞系中拯救病毒。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，本發(fā)明第一方面和第二方面所述的構(gòu)建狂犬 病病毒Flury-LEP全長(zhǎng)基因組cDNA突變重組載體的策略可以適用于構(gòu)建在Flury-LEP全 長(zhǎng)基因組cDNA中引入任何突變的重組載體。在第三方面中，本發(fā)明利用構(gòu)建的Flury-LEP G333突變?nèi)L(zhǎng)基因組cDNA重組載 體PCI-LEP333Q,和輔助質(zhì)粒系統(tǒng)pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG_L，在293T細(xì)胞中拯救了突變的 重組病毒株rLEP333Q。在第四方面中，本發(fā)明鑒定了突變株rLEP333Q的生物學(xué)活性。本發(fā)明人檢測(cè)了野 生株LEP(WtLEP)和突變株rLEP333Q在神經(jīng)元細(xì)胞NA和非神經(jīng)元細(xì)胞BHK-21上的生長(zhǎng)動(dòng) 力學(xué)曲線，如圖3所示，rLEP333Q在兩種細(xì)胞上的生長(zhǎng)性能與wtLEP沒(méi)有顯著差異，這表明糖 蛋白(G)第333位的精氨酸R突變?yōu)楣劝滨０稱后并不影響其生長(zhǎng)特性。此外，本發(fā)明人 還檢測(cè)了 wtLEP、突變株rLEP333Q和無(wú)毒株HEP的嗜神經(jīng)指數(shù)，結(jié)果顯示在表4中，wtLEP的 嗜神經(jīng)指數(shù)為0. 8，而rLEP333Q的嗜神經(jīng)指數(shù)已下降與無(wú)毒株Flury-HEP —樣接近于零。最 后，本發(fā)明人還檢測(cè)了 wtLEP、rLEP333Q以及HEP對(duì)小鼠的致病性，測(cè)定了 wtLEP和rLEP333Q的LD5tl，分別為8. 8個(gè)FFU和80個(gè)FFU。結(jié)果表明，rLEP333Q突變病毒株腦內(nèi)接種小鼠感染 仍致死，但與wtLEP相比，喪失了體外嗜神經(jīng)性，致病性略微下降。這表明本發(fā)明的狂犬病 病毒突變株rLEP333Q作為更安全的活毒疫苗應(yīng)用的潛力。在第五方面中，本發(fā)明提供上述生產(chǎn)突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的方 法，所述方法包括(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括在其中引入狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白 (G)第333位氨基酸突變的狂犬病病毒Flury-LEP全長(zhǎng)基因組cDNA序列；(2)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，所述輔助質(zhì)粒包括編碼狂犬病病毒 Flury-LEP核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因的開(kāi)放閱讀框架(ORF)的cDNA 序列；(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染允許狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗 復(fù)制的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；(4)收獲上清液，鑒定突變病毒株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒為pCI-LEP333Q，在所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中，編碼狂 犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)的核苷酸包含堿基突變，使得糖蛋白(G)第333位氨基酸 由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨０稱。所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。所述 宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在第六方面中，本發(fā)明提供狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸突 變病毒株rLEP333Q的應(yīng)用，所述突變株rLEP333Q可以用作高安全性的活毒疫苗，其可以單獨(dú) 或與其它疫苗一起使用，還可以作為口服疫苗，對(duì)野生動(dòng)物進(jìn)行投食免疫，也可以在滅活后 進(jìn)一步用于人免疫，等等。在第七方面中，本發(fā)明提供Flury-LEP G333突變?nèi)L(zhǎng)基因組cDNA重組載體的應(yīng) 用，其可以作為狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用，例 如，其可以對(duì)除G蛋白333位氨基酸以外的Flury-LEP株基因組毒力相關(guān)的其它位點(diǎn)進(jìn)行 定點(diǎn)突變修飾，以研究不同毒力相關(guān)位點(diǎn)間的作用，尋找安全性更好的活毒疫苗；還可以在 所述病毒基因組插入導(dǎo)致病毒減毒或增強(qiáng)免疫反應(yīng)的外源基因，插入額外的G基因以增強(qiáng) 免疫原性，或者從基因組中刪除某個(gè)完整的病毒基因，使病毒無(wú)法繁殖而失去毒力。因此， 本發(fā)明的狂犬病病毒Flury-LEP G333突變?nèi)L(zhǎng)基因組cDNA重組載體還可以用于構(gòu)建表達(dá) 犬瘟熱等其它重要病原保護(hù)性免疫原的重組病毒，研制出可同時(shí)預(yù)防狂犬病及犬瘟熱等其 它疫病的重組二聯(lián)活載體疫苗。


從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中圖1顯示狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株全長(zhǎng)基因組cDNA的重組載體pCI_LEP的 構(gòu)建示意圖。圖2顯示向編碼LEP G蛋白的基因中引入點(diǎn)突變，構(gòu)建rLEP333Q。(A)rLEP和 rLEP333Q的基因組圖示；(B)左圖間接免疫熒光檢測(cè)拯救病毒rLEP333Q感染BHK-21細(xì)胞， 右圖陰性對(duì)照，以陰性血清(即，沒(méi)有狂犬病病毒抗體的血清)為一抗觀察IFA結(jié)果；(C) 重組病毒基因組RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，用BECKMAN CEQ 8000自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序顯示病毒基因組內(nèi)的堿基由GG突變?yōu)锳A，突變部分用邊框表示。圖3顯示野生型LEP (wtLEP)和突變的rLEP333Q在NA細(xì)胞(A)和BHK-21細(xì)胞⑶ 上的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線。圖4顯示pCI系列質(zhì)粒(A)、pCAGG質(zhì)粒(B)和pBluescriptSK+質(zhì)粒(C)的圖譜。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說(shuō)明 的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。實(shí)施例1狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸突變株的構(gòu)建及其生物學(xué) 活性鑒定1 材料1. 1質(zhì)粒、細(xì)胞株和病毒質(zhì)粒pCAGG、pCI_RBz購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，pBluescriptSK (+) 購(gòu)自 clonetech。BHK-21 細(xì)胞(ATCC CC1-10)，293T 細(xì)胞(CRL-11268)購(gòu)自 ATCC，培養(yǎng)基均 為含10%胎牛血清的DMEM(購(gòu)自GIBC0)。小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞NA細(xì)胞來(lái)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的MEM(購(gòu)自GIBC0)?？袢〔《綟lury-LEP 和HEP購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，在BHK-21細(xì)胞上擴(kuò) 增，-70°C凍存?zhèn)溆谩?.2主要試劑和儀器T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶Sph I，Mlu I等均購(gòu)自TaKaRa公司。Phusion 超保真DNA聚合酶。SuperScript III反轉(zhuǎn)錄試劑盒、無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM，轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000均購(gòu)自Invitrogen公司。犢牛血清購(gòu)自Gibco公司。LB培養(yǎng)基成 分均購(gòu)自O(shè)XOID公司。膠回收試劑盒(Gel Extraction Mini Kit)及質(zhì)粒小量提取試劑盒 (Plasmid Mini Kit)均購(gòu)自O(shè)MEGA公司。質(zhì)粒中量提取試劑盒QIAfilter Plasmid Midi Kit購(gòu)自QIAGEN公司。鼠抗狂犬病病毒高免血清由本研究室制備。FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光 二抗購(gòu)自Sigma公司。普通顯微鏡，購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司；熒光顯微鏡，購(gòu)自ZEISS公司。PCR 儀購(gòu)自Applied Biosystem公司。核酸測(cè)序采用BECKMAN CEQ 8000自動(dòng)測(cè)序儀，所用試劑 為BECKMAN公司產(chǎn)品。P2級(jí)生物安全柜購(gòu)LABC0NC0自公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo Electron公司。不同型號(hào)離心機(jī)均購(gòu)自BECKMAN公司。-70°C超低溫冰箱購(gòu)自NBS公司。 普通冰箱冰柜購(gòu)自海爾公司。全自動(dòng)凈水機(jī)MILI-Q購(gòu)自BIOCEL公司。各種規(guī)格細(xì)胞培養(yǎng) 瓶及細(xì)胞培養(yǎng)板均購(gòu)自CORNING公司。1.3 引物參照Gene Bank中所提供的Flury-HEP株基因組序列(Gene Bank序列號(hào) AB085828)，和 Flury-LEP 基因序列(Gene Bank 序列號(hào) DQ099524，F(xiàn)lury-LEP 全長(zhǎng)基因組 cDNA序列見(jiàn)SEQ ID NO 1)，將Flury-LEP基因組分為3段(即，F(xiàn)l，F(xiàn)2和F3)分別設(shè)計(jì)PCR 引物。其中，片段Fl為Flury-LEP基因序列的1-4063核苷酸序列(SEQ ID N0:2)，片段F2 為Flury-LEP基因序列的4013-8254核苷酸序列(SEQ ID NO :3)，片段F3為Flury-LEP基 因序列的8187-11925核苷酸序列(SEQ ID NO :4)。構(gòu)建全長(zhǎng)基因組cDNA所用引物(表1) 和構(gòu)建輔助質(zhì)粒所用引物(表2)均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)Flury-LEP基因組序列，設(shè)計(jì)將G蛋白第333位精氨酸突變?yōu)楣劝滨０返囊?表3)，突變堿基用邊框 表示，所述引物也由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。表IRT-PCR和全長(zhǎng)基因組cDNA構(gòu)建所用的引物
引物名稱引物序列
GTTAA^PrCTGAfdTG 丁CCdfdACJCMUdmCTAT^UdA/^CKMjiffddJW F1-PF .^G7rACGCTTAACAACAAAACCAAAGAA-3'
Fl-PR 5'- GGCACGCGTACTCCACATAACTTGAGTTTGC -3' F2-PF 5'- AGGCCTGTATAAGTCTTTAAAGGGAGCA -3' F2-PR 5'- ATCGGGGTTCCCGGCCTCTTGACACAAC -3' F3-PF 5'- TATGCTAGCTCTGGTTAAGCTCCCACGAATC -3'
F3-PR 5'-ATACCC/i CCGCGA GG AGGTGG A GA TGCCA TGCCGA CCCACGCTTAACAAATAAACAATAA AG -3'______注cDNA片斷與圖1相一致。下劃線部分為病毒特異序列，黑體表示酶切位點(diǎn)，錘 頭狀核酶(HamRz)和丁肝病毒核酶(HdvRz)用斜體表示。表2輔助質(zhì)粒構(gòu)建所用的引物
引物名稱
L-N- PF L-N - PR L-P 一 PF L-P - PR L-L-PF L-L-PR
引物序列
5'- GGCGAATTCGCC/jCCATGGATGCCGACAAGATTGT -3' 5'- CCGGGTACCTC囚TTATGAGTCACTCGAATACG -3' 5'- GGCGAATTCGCC/^CCATGAGCAAGATCTTTGTTAA -3'
5'- CCGGGTACCTCATTAGCATGATGTGTAGCGATCC -3'
5'- GGCGAATTCGCC/jCCATGCTGGATCCGGGAGAGGTTTA -3' 5'- CCGGGTACC|TTA|TTACAAACAACTC}TAGTCTA -3' 注下劃線部分為病毒特異序列，黑體表示酶切位點(diǎn)，突變堿基用字符邊框表示， Kozak序列用斜體表示。 表3G333定點(diǎn)突變所用的引物
引物名稱
引物序歹Ij
F2-PF RtoQ-PR
RtoQ-PF F2-PR
5·- AGGCCTGTATAAGTCTTTAAAGGGAGCA -3'(丨司表 1 中F2-PF)
5'-TCAAACACCCTTTTGAGGGGATGATCTCATTCCAGGTfTT|GGACAGACTTG
TAGTGAGCATCAGCCTCCATCAAGGT-3'
5'-GTCTGTCC|A^CCTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGA-3' 5'- ATCGGGGTTCCCGGCCTCTTGACACAAC -3' (iwj表 1 中F2-PR)
注突變堿基用字符邊框表示。
1. 4構(gòu)建Flury-LEP基因組全長(zhǎng)cDNA克隆和cDNA片段克隆以及輔助質(zhì)粒系統(tǒng)
7
1.4. 1病毒基因組的提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR取Flury-LEP病毒液250 μ L，加入750 μ L Trizol，經(jīng)常規(guī)方法提取基因組RNA。 提取的RNA用SUperSCriptTMIII反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(反轉(zhuǎn)錄引物見(jiàn)表1)按該 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，獲得末端部分重疊的3個(gè)病毒cDNA片段Fl、F2和F3片段。1. 4. 2RT-PCR 產(chǎn)物的克隆整個(gè)基因組分為末端部分重疊的3個(gè)片斷進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA公司)回收Fl、F2和F3片段，分別克隆至 pBluscript IIKS (+/-) (Clontech)的EcoR ν位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，選擇并提取陽(yáng) 性質(zhì)粒pBlue-Fl，pBlue-F2和pBlue_F3，測(cè)序確?？寺〉幕蚪M片段與病毒基因組RNA序 列完全一致(具體方法見(jiàn)《分子克隆試驗(yàn)指南》，J.薩姆布魯克編，2008年第三版，科學(xué)出版 社譯)。1. 4. 3Flury-LEP基因組全長(zhǎng)cDNA克隆和cDNA片段克隆的構(gòu)建利用基因組cDNA片段F1、F2和F3相鄰重疊部分存在的限制酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接組 裝(示意圖見(jiàn)圖1)。具體地，首先將F3段cDNA經(jīng)Nhe I和Rsr II位點(diǎn)克隆進(jìn)pCI-RBz，所得 質(zhì)粒命名為PCI-F3，再將Fl段經(jīng)Nhe I和Mlu I插入到pCI_F3，所得質(zhì)粒命名為pCI_F31。 最后將F2段經(jīng)Sph I和Mlu I克隆進(jìn)pCI-F31，至此Flury-LEP全基因組cDNA組裝完成， 構(gòu)建成的病毒基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒命名為pCI-LEP。該克隆在CMV啟動(dòng)子之下、兩個(gè)核酶之間的全長(zhǎng)cDNA可以在真核細(xì)胞RNA聚合酶 的作用下得到轉(zhuǎn)錄，并且由于核酶的自身催化功能，可以保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'末端與病毒基 因組精確一致。1. 4. 4構(gòu)建轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒系統(tǒng)以pCI-LEP為模板，PCR擴(kuò)增編碼核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因 的開(kāi)放閱讀框架(ORF) cDNA序列(核苷酸序列分別為SEQ ID NOs :5_7，引物序列見(jiàn)表2)， 分別克隆在PCAGG質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)(MCS)。在起始密碼子前引入Kozak序列(GCCACC)，以 增強(qiáng)蛋白表達(dá)[3’4]；在原有終止密碼子后增加一個(gè)終止密碼子，以有效終止輔助質(zhì)粒mRNA 的轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建成的輔助質(zhì)粒分別命名為pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG_L。1. 5 G333突變?nèi)L(zhǎng)基因組的構(gòu)建以在1. 4. 2中構(gòu)建好的pBlue-F2為模板，分別以F2-PF和RtoQ-PR、RtoQ-PF和 F2-ra為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將2個(gè)PCR產(chǎn)物回收后，再以2個(gè)PCR產(chǎn)物為模板，以F2-PF 和F2+R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)的F2’片段(含有G蛋白333位氨基酸突變，由精氨 酸R突變?yōu)楣劝滨０稱)。將PCR產(chǎn)物克隆至pBluscript IIKS(+/_)的多克隆位點(diǎn)，將陽(yáng)性 克隆質(zhì)粒pBlue-F2’ (G333Q)進(jìn)行測(cè)序，確保突變成功以及克隆的基因組片段與病毒基因組 RNA序列完全一致。最后將G333R突變?yōu)镼的F2’段經(jīng)Sph I和Mlu I克隆進(jìn)在1. 4. 3中已 構(gòu)建好的PCI-F31，至此Flury-LEP G333突變?nèi)蚪McDNA組裝完成，構(gòu)建成的病毒基因 組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒命名為pCI-LEP333Q。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明上述方面所述的構(gòu)建狂犬病病毒Flury-LEP全 長(zhǎng)cDNA突變重組載體PCI-LEP333Q的策略可以適用于構(gòu)建在Flury-LEP全長(zhǎng)cDNA基因中 引入任何突變的重組載體。1. 6病毒拯救
在轉(zhuǎn)染前一天，將293T細(xì)胞傳到35mm 6孔板上，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)即 可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將 pCI-LEP333Q、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L 分別以 4 μ g、2 μ g、1 μ g、1 μ g 的 比例加入到250 μ 1無(wú)血清培養(yǎng)基OPTI-MEM中，混勻；取15 μ 1 Lipofectamine 2000溶于 250 μ 1 OPTI-MEM中，混勻后在室溫靜置5min ；然后將Lipofectamine 2000與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 (即 pCI-LEP333Q、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L 各 4 μ g、2 μ g、1 μ g、1 μ g)混合均勻，室溫孵 育30min。在此期間用OPTI-MEM洗滌293T細(xì)胞兩次，然后每孔加入OPTI-MEM 1ml，最后將 Lipofectamine 2000-質(zhì)?；旌弦?00 μ 1加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，置于37°C CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)8h后吸棄轉(zhuǎn)染液，加入10% DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。72小時(shí)后，仔細(xì)吹落培養(yǎng)板上的細(xì)胞，將培 養(yǎng)液及細(xì)胞混合物全部接種BHK-21細(xì)胞。72h后，在BHK-21細(xì)胞上用間接免疫熒光(IFA) 檢測(cè)病毒滴度，簡(jiǎn)言之，即以鼠抗狂犬病病毒高免血清為一抗，相同倍數(shù)稀釋的小鼠陰性血 清為對(duì)照，熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma)為二抗，最后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。 收獲上清液，獲救突變病毒株，獲救病毒株命名為rLEP333Q株。1.7種毒的制備及滴定將拯救的病毒在BHK-21細(xì)胞上進(jìn)行擴(kuò)增，10% DMEM 37°C培養(yǎng)3天。在NA細(xì)胞或 BHK-21細(xì)胞上培養(yǎng)48h后，以IFA(步驟同1. 6)確定病毒滴度。病毒滴度用病灶形成單位 (focus forming unit) FFU 表不。1. 8病毒生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定為測(cè)定病毒生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，以M.0. I.為0.01分別感染單層NA細(xì)胞和BHK-21細(xì) 胞。感作Ih后，用無(wú)菌PBS洗2次后，分別加含0. 2% FBS的MEM 2ml和2% DMEM 2ml于 37°C培養(yǎng)。分別于接種后24h、72h和120h取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，在NA細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞上 測(cè)定滴度，繪制病毒生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線。1. 9小鼠半數(shù)致死量(LD5tl)的測(cè)定將HEP、wtLEP和rLEP333Q用滅菌的PBS作10倍倍比稀釋至10"，將1(Γ4 10"各 稀釋度分別取30 μ 1腦內(nèi)接種5只5 6周齡的Balb/c雌性小鼠。連續(xù)觀察21天，記錄每 組小鼠的平均體重變化和死亡情況。利用Reed-Muench法計(jì)算小鼠半數(shù)致死量(LD5tl)[11]。2.結(jié)果2. 1從突變的全長(zhǎng)cDNA克隆拯救突變病毒rLEP333Q為了從克隆的cDNA中拯救感染性RV，首先以pCI_LEP333Q及表達(dá)RVN、P、L蛋白 的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。3天后收獲細(xì)胞液，盲傳一代后IFA檢測(cè)呈陽(yáng)性結(jié)果(圖 2B)。對(duì)拯救病毒進(jìn)行RT-PCR及基因組序列分析結(jié)果顯示，救獲病毒糖蛋白(G)第333位 精氨酸R(CGG)已經(jīng)突變?yōu)楣劝滨０稱(CAA)，和預(yù)期完全相符(圖2C)。結(jié)果表明，通過(guò)反 向遺傳操作技術(shù)，成功拯救出具有感染性的糖蛋白(G)第333位突變?yōu)楣劝滨０返淖哟?毒 rLEP333Q。2. 2拯救的Flury-LEP突變株(rLEP333Q)生物學(xué)特性的鑒定2. 2.1動(dòng)力學(xué)曲線wtLEP和rLEP333Q在神經(jīng)元細(xì)胞NA和非神經(jīng)元細(xì)胞BHK-21上的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線 如圖所示(圖3)，可見(jiàn)兩種病毒的生長(zhǎng)性能并沒(méi)有顯著差異，這表明糖蛋白(G)第333位的 精氨酸突變?yōu)楣劝滨０泛蟛⒉挥绊懫渖L(zhǎng)特性。2. 2. 2嗜神經(jīng)指數(shù)
狂犬病病毒的體外嗜神經(jīng)指數(shù)是指病毒在NA細(xì)胞相對(duì)于BHK-21細(xì)胞上的感染性 比例[12]，嗜神經(jīng)指數(shù)為1即表示病毒在神經(jīng)元細(xì)胞上感染的能力比在非神經(jīng)細(xì)胞上的高10 倍。致病性毒株與弱毒株相比通常具有較高的嗜神經(jīng)指數(shù)。致病性毒株的嗜神經(jīng)指數(shù)一般 大于1，而弱毒株的嗜神經(jīng)指數(shù)通常接近于0[12’13’14]。WtLEP和rLEP333Q的嗜神經(jīng)指數(shù)分別 為0. 8和0 (表4)。與wtLEP相比，rLEP333Q的嗜神經(jīng)指數(shù)已下降與無(wú)毒株Flury-HEP —樣 接近于零。表4wt LEP、rLEP333Q和HEP的體外嗜神經(jīng)性
滴度(ffU/mla) 體外嗜神經(jīng)指 _4]母NA細(xì)胞_BHK-21 數(shù)匕_
wtLEP 3.7X IO85.3 XIO7 0.8
rLEP333Q 3.0X IO73.3 XIO7 0^￡
HEP 5. QX IQ6_5. OXlO6 0_a同一種毒在NA細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞上的滴度b體外嗜神經(jīng)指數(shù)=log (NA上的滴度)-log (BHK-21上的滴度)2. 2. 3對(duì)小鼠的致病性為了確定wtLEP、rLEP333Q以及HEP對(duì)小鼠的致病性，每只小鼠腦內(nèi)接種病毒 105FFU/30y L· HEP感染的小鼠只表現(xiàn)出輕微的癥狀如毛微亂、體重略減；而感染wt LEP和 rLEP333Q的小鼠則表現(xiàn)出麻痹、興奮，體重減輕等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床癥狀(數(shù)據(jù)未顯 示)。所有的老鼠在11天內(nèi)全部死亡。此外，我們測(cè)定了 wtLEP和rLEP333Q的LD5tl，分別為 8. 8個(gè)FFU和80個(gè)FFU。結(jié)果表明，rLEP333Q毒株腦內(nèi)接種小鼠感染仍致死，但與wtLEP相 比，致病性下降。3 討論狂犬病病毒的G蛋白是很重要的致病因子，與細(xì)胞粘附、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和免疫 應(yīng)答等有關(guān)。G蛋白的第333位氨基酸位點(diǎn)對(duì)小鼠的致病性至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)將 Flury-LEP糖蛋白(G)第333位的R突變?yōu)镼后，雖然小鼠腦內(nèi)接種仍能致死，但病毒喪失 了體外嗜神經(jīng)性，對(duì)小鼠的致病性有所下降。目前已報(bào)道的狂犬病病毒的細(xì)胞受體有煙堿乙酰膽堿受體 (nicotinicacetylcholine receptor) [15]> 神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)[16]和低親和力神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(low-affinity neurotrophinreceptor, p75NTR)[17]。G 蛋白結(jié)合 p75NTR 的能力依靠于第 330 位的 lysine 或是333位的R。因此，P75NTR可能與LEP獲得在CNS中傳播和擴(kuò)增有關(guān)系。表4顯示LEP 和LEP333Q體外的嗜神經(jīng)指數(shù)有顯著差異，表明333位上的R改變了病毒結(jié)合細(xì)胞種屬的特 性?？袢〔《驹诩?xì)胞間的傳遞有兩種假設(shè)模式一是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的病毒直接侵入到 毗鄰的細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞，二是自由的病毒粒子侵入到神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)[18]。病毒在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的傳 播以前者為主，333位的R對(duì)細(xì)胞間的傳遞極為重要。將LEP333位R突變后，其嗜神經(jīng)性降 低與無(wú)致病性毒株Flury-HEP —致。因此，本發(fā)明人認(rèn)為， 毒神經(jīng)嗜性的減弱能極大地提高其作為活毒疫苗使用時(shí)的安全性。所以，本發(fā)明的突變株rLEP333Q可以用作一種更加安 全的疫苗，同時(shí)還可以作為口服疫苗，對(duì)野生動(dòng)物進(jìn)行投食免疫，也可用于人免疫等。實(shí)施例2突變重組病毒rLEP333Q對(duì)比格犬的免疫試驗(yàn)為了評(píng)價(jià)突變重組病毒rLEP333Q對(duì)比格犬的免疫效果，將3月齡12只比格犬隨 機(jī)分成兩組，6條后腿肌肉注射IO6FFU的rLEP333Q，6條注射IO6FFU的wtLEP。免疫后3周 采血、分離血清，用于中和抗體滴度檢測(cè)。中和試驗(yàn)血清樣品首先56°C水浴處理30min滅活，隨后連續(xù)20倍至1280倍倍比稀釋，同 時(shí)設(shè)陰性、標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照。攻擊病毒采用標(biāo)準(zhǔn)固定毒CVS株，將稀釋好的血清與含10000個(gè) FFU的病毒等體積混合，37°C孵育lh，然后取100 μ 1加到過(guò)夜生長(zhǎng)的24孔ΒΗΚ-21細(xì)胞上。 每個(gè)樣品作3個(gè)重復(fù)。感染后48h進(jìn)行IFA檢測(cè)。被檢血清的中和抗體滴度為使熒光灶抑 制等于50%的血清最高倍數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)血清的起始稀釋效價(jià)為2IU/ml，待測(cè)抗體單位(IU/ml) =待測(cè)血清中和滴度/標(biāo)準(zhǔn)血清中和滴度X2。突變重組病毒rLEP333Q對(duì)比格犬的免疫保護(hù)性根據(jù)0. I. E標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定rLEP333Q和WtLEP誘導(dǎo)比格犬中和抗體水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯 示rLEP333Q免疫比格犬誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體達(dá)18. 7士6. 5IU/ml，wtLEP免疫比格犬誘 導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度為20士9. 7IU/ml，兩組數(shù)據(jù)并無(wú)顯著性差異。可見(jiàn)，突變重組病毒 rLEP333Q可誘導(dǎo)與wtLEP相當(dāng)?shù)闹泻涂贵w水平，且安全性較wtLEP更好，因此該病毒作為活 疫苗更具有優(yōu)勢(shì)。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述， 但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，而不背離 由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍。參考文獻(xiàn)[l]Martinez L. Global infectious disease surveillance. Int J Infect Dis, 2000,4(4) :222-8.[2]Dietzschold B, Wunner WH, Wiktor TJ, et al.Characterization of anantigenie determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity ofrabies virus. Proc Natl Acad Sci USA,1983,80(1) :70-4.[3]Morimoto K, Hooper DC, Spitsin S, et al. Pathogenicity of different rabiesvirus variants inversely correlates with apoptosis and rabies virus glycoproteinexpression in infected primary neuron cultures. J Virol,1999,73(1) 510-8.[4]Dietzschold B, Wiktor TJ, Trojanowski JQ, et al.Differences in cell-to-cellspread of pathogenic and apathogenic rabies virus in vivo and in vitro. J Virol. 1985,56(1) :12-8.[5] Faber M, Pulmanausahakul R, Nagao K, et al. Identification of viralgenomic elements responsible for rabies virus neuroinvasiveness. Proc NatlAcad Sci USA,2004，101(46) :16328_32.[6]Lentz TL, Burrage TG, Smith AL, et al. Is the acetylcholine receptor
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12
<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>11925<212>DNA<213>狂犬病病毒<400>1acgcttaacaSLCSLSLSLSLCCSLSLagaagaagcagacagcgtcagttgcaaagcaaaaatgtaa60
cacccctacaatggatgccgacaagattgtgttcaaagtcaataatcaggtggtctcttt120
gaagcccgagattatcgtggatcaatatgagtacaagtaccctgctatcaaagatttgaa180
aaagccttgtataaccctagggaaagcccccgatttaaacaaagcttacaaatcagtttt240
atcaggcatgaatgccgccaaacttgatcctgatgatgtatgctcctacttggcagcagc300
aatgcagttctttgaggggacatgtccggaagactggaccagctatggaatcctgattgc360
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13
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一種突變狂犬病病毒Flury LEP弱毒疫苗株，其表達(dá)的狂犬病病毒Flury LEP糖蛋白第333位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨０稱。
2.生產(chǎn)權(quán)利要求1的突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的方法，所述方法包括(1)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括在其中引入狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白第333 位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨０稱的狂犬病病毒Flury-LEP全長(zhǎng)基因組cDNA序列；(2)構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，所述輔助質(zhì)粒包括編碼狂犬病病毒Flury-LEP核 蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L基因的開(kāi)放閱讀框架的cDNA序列；(3)將所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染允許狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株復(fù) 制的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；(4)收獲上清液，獲救突變病毒株。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒為pCI-LEP333Q。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG_L。
5.權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1的突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株的應(yīng)用，其用作高安全性的活 毒疫苗，單獨(dú)或與其它疫苗一起使用。
7.狂犬病病毒Flury-LEPG333突變?nèi)L(zhǎng)基因組cDNA重組載體，其表達(dá)的狂犬病病毒 Flury-LEP糖蛋白第333位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨０稱。
8.權(quán)利要求7的狂犬病病毒Flury-LEPG333突變?nèi)L(zhǎng)基因組cDNA重組載體的應(yīng)用， 其與分別編碼LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L的轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒一起用于拯救狂 犬病病毒弱毒疫苗株的一種反向遺傳操作系統(tǒng)。
9.權(quán)利要求7的狂犬病病毒Flury-LEPG333突變?nèi)L(zhǎng)基因組cDNA重組載體的應(yīng)用， 其用于構(gòu)建預(yù)防狂犬病和其它疫病的重組二聯(lián)活載體疫苗。
10.權(quán)利要求8或9的應(yīng)用，其中所述狂犬病病毒Flury-LEPG333突變基因組cDNA重 組載體是 PCI-LEP333Qt全文摘要
本發(fā)明屬于重組病毒疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種突變狂犬病病毒Flury-LEP弱毒疫苗株，其表達(dá)的狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸由精氨酸R突變?yōu)楣劝滨０稱。更具體地，本發(fā)明涉及狂犬病病毒Flury-LEP糖蛋白(G)第333位氨基酸突變株rLEP333Q。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述突變株的方法，以及所述突變株的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101942418SQ20091024450
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者步志高, 王喜軍, 葛金英, 陶麗紅 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所