一種制備豬偽狂犬病病毒疫苗的方法及疫苗制品的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備豬偽狂犬病病毒疫苗的方法及疫苗制品，屬于獸藥生物技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬?。≒seudoraties，Pr)，是由皰疹病毒科豬皰疹病毒I型偽狂犬病病毒引 起多種家畜和野生動物共患的一種急性傳染病。豬是該病毒的自然宿主和儲存者，仔豬和 其他易感動物多為急性致死性癥狀，具有明顯的神經(jīng)癥狀、死亡率尚達(dá)100% ;成年豬多為 隱性感染，表現(xiàn)為繁殖障礙與呼吸道癥狀。疫苗免疫是防制偽狂犬病的主要措施。
[0003] 2013年廣東、江西、河南、山西、湖南等地豬場都在免疫偽狂犬疫苗后仍出現(xiàn)豬偽 狂犬病部分流行案例，2014偽狂犬病在河北、河南、湖北等地的一些豬場暴發(fā)流行，給發(fā)病 豬場帶來巨大的損失，說明現(xiàn)有商品化的偽狂犬疫苗已不能對市場流行毒株起到很好的保 護(hù)。其原因主要在于，偽狂犬滅活疫苗由于其在免疫動物體內(nèi)無法繁殖，需要較高的抗原 量，而現(xiàn)有技術(shù)的抗原量較低（l(f°TCID 5Q/0. lml)，如采用濃縮方法雖能提高抗原量，但也 會增加雜蛋白量，增加了疫苗的副反應(yīng)。因此，急需攻克制備高滴度的豬偽狂犬病病毒疫苗 的技術(shù)難題。
[0004] 目前商品化豬偽狂犬病病毒疫苗的制備工藝主要采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝，即將偽狂犬 病病毒接入已經(jīng)貼壁的傳代細(xì)胞或原代細(xì)胞，培養(yǎng)一段時間后收獲病毒液。如專利申請 CN101695573A公開了一種利用傳代細(xì)胞生產(chǎn)偽狂犬病病毒疫苗的方法，利用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生 產(chǎn)工藝，用ST、PK15和IBRS-2傳代細(xì)胞來繁殖偽狂犬病病毒。但由于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝中，每 個轉(zhuǎn)瓶均是獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)單元，每瓶細(xì)胞的質(zhì)量、病毒產(chǎn)量和病毒滴度都不相同，導(dǎo)致疫 苗批間差異大；轉(zhuǎn)瓶操作暴露點(diǎn)多，容易造成污染或隱性污染而引起病毒液報廢；且操作 勞動強(qiáng)度大，生產(chǎn)效率低，已不適合當(dāng)前疫苗大規(guī)模生產(chǎn)的要求。
[0005] 在偽狂犬病病毒大規(guī)模培養(yǎng)方面，還有關(guān)于利用微載體進(jìn)行生物反應(yīng)器培養(yǎng)偽狂 犬病病毒的報道。專利申請CN101695572A公開了一種利用TideCell固定床微載體生物反 應(yīng)器生產(chǎn)偽狂犬疫苗的方法；專利申請CN102038946A公開了 一種利用微載體培養(yǎng)攪拌式 的生物反應(yīng)器生產(chǎn)偽狂犬疫苗的方法。但是上述方法，均需借助價格昂貴的微載體才能進(jìn) 行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，生產(chǎn)成本相對較高；借助微載體培養(yǎng)時，需使用胰酶消化，消化后細(xì)胞利 用率低，生產(chǎn)工藝復(fù)雜。
[0006] 因此研制一種工藝簡單穩(wěn)定、批間差異小、生廣效率尚、并能制備尚含量的病毒的 豬偽狂犬病病毒疫苗的生產(chǎn)方法具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種制備豬偽狂犬病病毒疫苗的方法及 使用本發(fā)明所述方法制備的偽狂犬病病毒疫苗。
[0008] 本發(fā)明的第一方面是一種應(yīng)用生物反應(yīng)器不依賴微載體制備豬偽狂犬病病毒疫 苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
[0009] (1)制備懸浮傳代細(xì)胞；
[0010] (2)擴(kuò)增培養(yǎng)所述步驟（1)制備的懸浮傳代細(xì)胞；以及
[0011] ⑶在所述步驟⑵擴(kuò)增培養(yǎng)后的懸浮傳代細(xì)胞接種偽狂犬病病毒，擴(kuò)增培養(yǎng)偽 狂犬病病毒。
[0012] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟（a)中所述的傳代細(xì)胞系為BHK-21細(xì) 胞，來源于美國典型培養(yǎng)物典藏中心（ATCC)，保藏號為：CCL-10 ;
[0013] 所述偽狂犬病病毒毒株優(yōu)選豬偽狂犬變異株及其基因缺失株。
[0014] 術(shù)語"豬偽狂犬變異株"也稱為高致病性豬偽狂犬毒株，是指：表現(xiàn)為任何年齡的 豬都會感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短（1~2天），發(fā)病率在10%~100%之間，發(fā)病 豬死亡率在10%~100%之間（仔豬死亡率可高達(dá)1〇〇%)，感染后可引起豬只高熱（40~ 42°C，持續(xù)3日以上），呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐， 側(cè)臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質(zhì)量下降，懷孕母豬流 產(chǎn)（高達(dá)35%)，早產(chǎn)，死胎，弱仔（弱仔14日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥狀。
[0015] 最優(yōu)選地，所述偽狂犬病病毒毒株包括偽狂犬變異株及其基因缺失株，所述偽狂 犬變異株包括但不限于豬偽狂犬病病毒HN1201株（Pseudorabies virus, strain HN1201)， 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO. V 201311，保藏地址為中國武漢?武 漢大學(xué)，保藏日期為2013年5月20日J(rèn)S-2012株，公開于童武，張青占，鄭浩等，免疫 后發(fā)病仔豬中偽狂犬病病毒的分離和鑒定[J].中國動物傳染病學(xué)報2013, 21 (3):1-7); 豬偽狂犬HeNl株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號 為 CGMCCN0. 6656，公開于專利申請 CN102994458A ;NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株 和 NVDC-PRV-SD 株，公開于文獻(xiàn) Xiuling Yu, Zhi Zhou, Dongmei Hu, et al. Pathogenic PseudorabiesVirus, China, 2012EmergingInfectious Diseases, www.cdc.gov/eid ol. 20, No. 1，January 2014);豬偽狂犬病病毒 HN1202 株（Pseudorabies virus, strain HN1202)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO. V 201335,保藏地址為中國 武漢?武漢大學(xué)，保藏日期為2013年8月26日；PRV TJ strain (PRV TJ)株，公開于文獻(xiàn) China Chun-Hua Wang Jin Yuan, Hua-Yang Qin,et al，A novel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variantemerging in Bartha-K61_vaccinated swine population in China Vaccine 32 (2014) 3379 - 3385 ;豬偽狂犬病病毒變異株P(guān)RV-ZJ01，其保藏號為CGMCCNo. 8170,公開 于專利申請CN103627678A ;
[0016] 所述偽狂犬變異株的基因缺失株包括但不限于缺失gE基因的豬偽狂犬病HN1201 株，公開于中國專利申請CN103923884A ;豬偽狂犬病gE和gl基因缺失病毒株P(guān)RV-ZJ011G 株，保藏號為CGMCCNo. 7957,公開于中國專利申請CN103756977A ;豬偽狂犬病gE基因缺失 株，保藏號為CGMCC N0. 6657,公開于中國專利申請CN102994458A。
[0017] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟（2)中擴(kuò)增培養(yǎng)懸浮傳代細(xì)胞采用不 需胰酶消化，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋的連續(xù)放大方式培養(yǎng)，所述連續(xù)放大方式中單次培 養(yǎng)前懸浮傳代細(xì)胞濃度為〇. 2 X 106個/ml~2 X 10 6個/ml，所述單次培養(yǎng)過程至懸浮傳代 細(xì)胞濃度為1X 1〇6個/ml~10 X 10 6個/ml時結(jié)束。
[0018] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟（2)中擴(kuò)增培養(yǎng)懸浮傳代細(xì)胞采用連 續(xù)放大方式培養(yǎng)，所述連續(xù)放大方式中單次培養(yǎng)前懸浮傳代細(xì)胞濃度為0. 6 X 106個/ml~ 1 X 106個/ml，所述單次培養(yǎng)過程至懸浮傳代細(xì)胞濃度為3X 10 6~6X 10 6個/ml時結(jié)束。 最優(yōu)選地，所述步驟（2)中擴(kuò)增培養(yǎng)懸浮傳代細(xì)胞采用連續(xù)放大方式培養(yǎng)，所述連續(xù)放大 方式中單次培養(yǎng)前懸浮傳代細(xì)胞濃度為0. 6 X 106個/ml~1 X 10 6個/ml，所述單次培養(yǎng)過 程至懸浮傳代細(xì)胞濃度為3. 4 X 106~4 X 10 6個/ml時結(jié)束。
[0019] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方