專利名稱：：一種利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是微生物利用木質(zhì)纖維素資源發(fā)酵生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的方法，具體涉及將木質(zhì)纖維素用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法。
背景技術(shù)：
：甲殼素，又名幾丁質(zhì)，是2-乙酰氨基葡萄糖直鏈多聚體，廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲(chóng)等甲殼類動(dòng)物的外殼、軟體動(dòng)物的器官(如烏賊的軟骨)中。殼聚糖是p-l，4-氨基葡萄糖的直鏈聚合物，可通過(guò)甲殼素的化學(xué)熱處理獲取，或從真菌細(xì)胞壁中分離。殼聚糖是一重要的化工產(chǎn)品，由于其粘合性好、成纖成膜性能優(yōu)良，無(wú)毒、無(wú)氣味，被廣泛應(yīng)用于食品保鮮技術(shù)；由于其具有抗衰老、防皺、美容和保健等作用，在化妝品領(lǐng)域有較大應(yīng)用；同時(shí)殼聚糖還可明顯降血脂、降血糖、增強(qiáng)免疫，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛；此外，殼聚糖還可應(yīng)用于環(huán)境治理過(guò)程，如去除污水中的重金屬等。目前市場(chǎng)上出售的殼聚糖主要由蝦、蟹等外殼提取的甲殼素經(jīng)脫乙酰化后制得，該方法在處理過(guò)程需大量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，對(duì)設(shè)備要求高，環(huán)境污染大，且所獲得的產(chǎn)品缺乏穩(wěn)定的物理-化學(xué)性能，工業(yè)應(yīng)用范圍較窄。研究表明，從真菌中提取的殼聚糖具有穩(wěn)定的物理化學(xué)特性，且殼聚糖的分子大小可通過(guò)發(fā)酵參數(shù)的改變進(jìn)行調(diào)整，能夠滿足不同工業(yè)應(yīng)用要求，目前利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖已成為各國(guó)的研究熱點(diǎn)。發(fā)酵法制備甲殼素/殼聚糖常用菌種為曲霉、毛霉、根霉，如黑曲霉"，rg飾s"/ger),魯氏毛霉(Mwcorraw;a7)，米根霉(腸'zow/wo，ae),少根根霉(i/7/z做戸arWzfeiw)等。現(xiàn)有技術(shù)中，S.Chatterjee通過(guò)考察糖蜜(MSM)、土豆汁(PDB)、葡萄糖酵母膏蛋白胨(YPG)等碳源對(duì)魯氏毛霉(Tl^c^rawxf/)積累殼聚糖的影響，認(rèn)為MSM最利于殼聚糖的積累；Kaplan通過(guò)延長(zhǎng)魯氏毛霉(A/wcorra欲//)的培養(yǎng)時(shí)間及變更培養(yǎng)基成分，增加了生物量同時(shí)殼聚糖的積累量得到提高，且分子質(zhì)量增大；Goksungur以糖蜜為原料發(fā)酵米根霉生產(chǎn)殼聚糖，通過(guò)改變通氣速率、攪拌轉(zhuǎn)速及初始糖濃度使殼聚糖產(chǎn)量從961mg/L提高至1109.32mg/L;Yoshihara在米根霉發(fā)酵產(chǎn)甲殼素/殼聚糖過(guò)程中，通過(guò)添加512g/L的D-psicose，大幅提高了二者的含量；SudiptaChatterjee在米根霉生長(zhǎng)過(guò)程中添加少量激素類物質(zhì)增進(jìn)了甲殼素的脫乙酰程度，殼聚糖的生成量獲得提高；陳世年以YPG培養(yǎng)米根霉，72小時(shí)后細(xì)胞干重達(dá)19.31g/L，經(jīng)提取殼聚糖產(chǎn)率為10.1%(按干重計(jì))，脫乙酰度為92%。由此看來(lái)，微生物發(fā)酵法制備殼聚糖的研究已取得較大進(jìn)展，但欲與化學(xué)工藝媲美，提高產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)，降低發(fā)酵成本仍是其關(guān)鍵要素。木質(zhì)纖維素是地球上儲(chǔ)量最豐富的生物可再生資源，主要來(lái)源于農(nóng)林廢棄物，包括玉米秸稈、玉米芯、廢木屑等，含35%50%的纖維素，20%35%的半纖維素和10%15%的木質(zhì)素。理論上，木質(zhì)纖維素的降解產(chǎn)物中富含大量的糖類，主要有纖維素的降解產(chǎn)物葡萄糖，及半纖維素的降解產(chǎn)物木糖等，這些降解后的糖均可被微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化。但目前較多的木質(zhì)纖維素資源都被遺棄或焚燒，在資源浪費(fèi)的同時(shí)還造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。若能以現(xiàn)代生物技術(shù)手段，將儲(chǔ)量豐富、廉價(jià)的木質(zhì)纖維素資源變廢為寶，對(duì)于我國(guó)這樣一個(gè)人口眾多，人均資源貧乏的農(nóng)業(yè)大國(guó)，將具有豐富的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和社會(huì)效率。目前關(guān)于微生物如何有效利用木質(zhì)纖維素的研究主要集中于將木質(zhì)纖維素降解得到的混合糖液用于乙醇、有機(jī)酸的發(fā)酵方面，產(chǎn)品多為大宗化學(xué)品，附加值低，且微生物在利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵過(guò)程中普遍存在對(duì)水解產(chǎn)物木糖利用率低，代謝效率差等諸多問(wèn)題，造成了木質(zhì)纖維素的低利用，發(fā)酵產(chǎn)品的高成本、低競(jìng)爭(zhēng)力的現(xiàn)狀，故有必要從木質(zhì)纖維素的有效利用，及高附加值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)這兩方面對(duì)木質(zhì)纖維素的應(yīng)用進(jìn)行更廣泛的技術(shù)方案的設(shè)計(jì)和應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)目的是提供一種能有效利用木質(zhì)纖維素的水解液用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品——甲殼素/殼聚糖的方法，使得該技術(shù)方案在實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素有效利用的同時(shí)，還具備高產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的能力，有效降低甲殼素/殼聚糖的生產(chǎn)成本。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于以稀酸處理木質(zhì)纖維素獲得的以木糖為主的水解液直接作為發(fā)酵底物配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，以霉菌作為發(fā)酵微生物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明技術(shù)方案的具體步驟如下(1)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將木質(zhì)纖維素酸水解后的水解液稀釋或濃縮成木糖濃度為1050g/L的溶液，將其直接作為發(fā)酵底物，并且加入菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物積累所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌并冷卻；由于木質(zhì)纖維素酸水解后的水解液本身含有豐富的金屬離子等培養(yǎng)基所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，故本發(fā)明所述的產(chǎn)物積累所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以僅為現(xiàn)有技術(shù)中的任意氮源；更優(yōu)化的，培養(yǎng)基所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括KH2PO40.1lg/L，MgSO4'7H2O0.1lg/L，ZnS04'7H200.00010.001g/L，F(xiàn)eS04'7H200.010.1g/L，尿素l4g/L，添加中和劑控制pH為2.56.0;其中，添加的中和劑為H2S04或HC1;(2)菌體培養(yǎng)及產(chǎn)物積累向配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入霉菌孢子懸浮液，于溫度3035。C下培養(yǎng)4284小時(shí)，得到富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物。具體的搖瓶一級(jí)培養(yǎng)的條件為向培養(yǎng)基中接種霉菌孢子終濃度為105107個(gè)/11^，接種量5%10%，于溫度3035。C，150220rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)1836小時(shí)，獲得發(fā)酵種子；以5%10%的接種量接入發(fā)酵罐，于3035°C，150400rpm，通氣量0.51vvm，培養(yǎng)2436小時(shí)，得到富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明所述的木質(zhì)纖維素酸水解后的水解液即對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行酸降解，得到以木糖為主的水解液；而本發(fā)明所述的對(duì)木質(zhì)纖維素的酸降解方法為現(xiàn)有技術(shù)中任意的酸水解木質(zhì)纖維素的方法。本發(fā)明所述的微生物發(fā)酵生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖及其衍生物的方法得到的富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物可以采用現(xiàn)有技術(shù)中任意的甲殼素的提取方法來(lái)提取甲殼素純品。例如，將所述的得到的發(fā)酵產(chǎn)物過(guò)濾并收集菌體，加入210%的NaOH溶液，于90120°C處理24小時(shí)脫除蛋白質(zhì)，離心并過(guò)濾，于離心的沉淀中加入210%的乙酸溶液，6010(TC處理26小時(shí)后離心，將得到的沉淀水洗至中性，再分別用95%乙醇和丙酮洗滌3次，干燥后即得到純品甲殼素。本發(fā)明所述的微生物發(fā)酵生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖及其衍生物的方法得到的富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物可以采用現(xiàn)有技術(shù)中任意的殼聚糖的提取方法來(lái)提取殼聚糖純品。例如，將所述的發(fā)酵產(chǎn)物過(guò)濾并收集菌體，加入210o/c的NaOH溶液，于90120。C處理24小時(shí)脫除蛋白質(zhì)，離心并過(guò)濾后得到的上清液用1030%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.010.0后離心，將得到的沉淀水洗至中性后分別用95%乙醇和丙酮洗滌3次，干燥即得到純品殼聚糖。本發(fā)明所述的霉菌包括曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、根霉屬；本發(fā)明所述的甲殼素/殼聚糖可以利用現(xiàn)有技術(shù)中任意的水解方法直接制得如脫乙5酰氨基葡萄糖等衍生物。本發(fā)明的有益效果在于(1)將木質(zhì)纖維素資源通過(guò)工藝成熟的酸水解法處理，將得到的主要含有木糖的水解液用于菌體生長(zhǎng)獲取細(xì)胞中的甲殼素/殼聚糖、以及其衍生物等高附加值產(chǎn)品，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中用木制纖維素生產(chǎn)乙醇等大宗化學(xué)品而言，更加有利用前景；(2)利用霉菌發(fā)酵產(chǎn)甲殼素/殼聚糖，所用原料為木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，來(lái)源廣泛，得到的水解液無(wú)需經(jīng)過(guò)分離提純就可直接用于生產(chǎn)，甚至不需要加入額外的金屬離子等發(fā)酵必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，僅加入適量氮源即可生物甲殼素/殼聚糖，有效降低了這類高附加值產(chǎn)物的生產(chǎn)成本；(3)木質(zhì)纖維素水解液能相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的其他高成本底物而言，反而更加有效地促進(jìn)了甲殼素/殼聚糖的積累，使發(fā)酵法生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖具備更優(yōu)異的工業(yè)化前景。說(shuō)明書(shū)附圖圖1利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的工藝流程圖具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本實(shí)施例說(shuō)明現(xiàn)有技術(shù)中一種酸水解法降解木質(zhì)纖維素得到糖液的方法，但是本發(fā)明所述的降解木質(zhì)纖維素的方法不受該方法的限制，應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中所有可適用于木質(zhì)纖維素水解的酸水解法。(1)將木質(zhì)纖維素原料如玉米秸稈。用除塵設(shè)備將植物秸稈中的雜質(zhì)除去，除雜后的秸稈經(jīng)粉碎機(jī)粉碎,粉碎到粒徑50目備用；(2)用1%的稀酸浸泡過(guò)夜處理后過(guò)濾得到秸稈濾渣，向其中加入3%的稀硫酸并于10(TC處理3小時(shí)；(3)過(guò)濾處理后的上清溶液即木質(zhì)纖維素的水解液，經(jīng)過(guò)Ca(OH)2調(diào)節(jié)至pH8.0，過(guò)濾CaS04沉淀以及不溶物，得到主要含有木糖的木質(zhì)纖維素水解液即可直接作為發(fā)酵碳源，備用以下一步配制發(fā)酵培養(yǎng)基用。實(shí)施例2本實(shí)施例說(shuō)明利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的歩驟。木糖的含量測(cè)定方法采用DNS法。1mL樣品液加入3mLDNS溶液，于100。C煮沸5min，定容至25mL，540nm處測(cè)定吸光度，于純木糖標(biāo)曲上找出對(duì)應(yīng)吸光度下木糖濃度，即為該樣品中木糖的含量。菌種米根霉(i^/zo;^w少z"eCICC3087)孢子懸浮液、少根根霉(i/2/^^"sarr/2/z船NRRL1526)孢子懸浮液、黑曲霉C4^wg/〃^m'gerCICC2160)孢子懸浮液、橘青霉(/^m'c朋wnd的'"wmCICC4011)孢子懸浮液、毛霉(Mwco"/egaraCICC3134)孢子懸浮液。(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基將實(shí)施例1中水解獲得的木質(zhì)纖維素混合溶液濃縮，得到木糖濃度為50g/L的溶液，以濃度為50g/L葡萄糖的溶液為對(duì)照，分別加入霉菌種子培養(yǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)KH2P040.6g/L，MgS04.7H200.5g/L，ZnS04.7H200.000498g/L，F(xiàn)eS04.7H200.0176g/L，尿素2g/L,添加H2S04控制pH為4.0。其中水解液與尿素、金屬離子分開(kāi)滅菌，115'C滅菌30分鐘。(2)菌體培養(yǎng)搖瓶一級(jí)培養(yǎng)的條件為向培養(yǎng)基中接種霉菌孢子終濃度為10S個(gè)/mL，接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量5%,于溫度35。C，200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)36小時(shí)，獲得發(fā)酵種子；以5。/。的接種量接入10L培養(yǎng)基的15L攪拌式發(fā)酵罐，于35'C，400rpm，通氣量1wm，培養(yǎng)36小時(shí)，得到富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物。(3)甲殼素的提取向菌體中加入10Q/。的NaOH溶液12(TC處理4小時(shí)脫蛋白質(zhì)，離心，過(guò)濾，在沉淀中加入10%的乙酸溶液100"處理6小時(shí)，離心，沉淀即為甲殼素，水洗至中性，分別用95%乙醇和丙酮洗滌3次，干燥得精制甲殼素。(4)殼聚糖的提取在甲殼素的提取過(guò)程中離心后得到的上清液即為殼聚糖溶液，用30。/。的NaOH溶液調(diào)pH至10.0，離心，水洗至中性，分別用95%乙醇和丙酮洗漆3次，干燥得精制殼聚糖。(5)結(jié)果對(duì)不同霉菌的菌體培養(yǎng)及甲殼素、殼聚糖的提取結(jié)果見(jiàn)表1及表2。表l以木質(zhì)纖維素水解液(木糖濃度50g/L)為主要營(yíng)養(yǎng)物的統(tǒng)計(jì)結(jié)果菌種菌體干重Cg/U甲殼素產(chǎn)量(g/g干菌體)殼聚糖產(chǎn)量(g/g干菌體)米根霉7.120.1530.161少根根霉6.920.1610.158黑曲霉7.230.1720.173橘青霉6.580.1670.182毛霉6.630.1540.174表2以50g/L葡萄糖為主要營(yíng)養(yǎng)物的統(tǒng)計(jì)結(jié)果菌種菌體干重Cg/L)甲殼素產(chǎn)量(g/g干菌體)殼聚糖產(chǎn)量(g/g干菌體)米根霉5.080.1180掘少根根霉6.130.1060.112黑曲霉5.980.1270.140橘青霉5.260.1360.13毛霉4.860.1280.121由表1和表2可見(jiàn)，利用本發(fā)明所述的技術(shù)方案更加有效地促進(jìn)了甲殼素/殼聚糖的積累，且大大降低了生產(chǎn)成本。實(shí)施例3本實(shí)施例的測(cè)定方法、發(fā)酵菌種等參數(shù)與實(shí)施例2方法相同。(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基將實(shí)施例1中水解木質(zhì)纖維素得到的溶液稀釋，使其中木糖濃度為35g/L，加入霉菌種子培養(yǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)KH2PO40.1g/L，MgSO4'7H2O0.1g/L，ZnS04.7H200.0001g/L，F(xiàn)eS04'7H200.01g/L，尿素1g/L，加HC1調(diào)節(jié)pH至2.5。以35g/L葡萄糖溶液為對(duì)照，添加其余必須營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及CaC032g/L，調(diào)節(jié)pH至2.5。其中水解液或葡萄糖、尿素、金屬離子等分開(kāi)滅菌，115〔滅菌30分鐘。(2)菌體培養(yǎng)搖瓶一級(jí)培養(yǎng)的條件為向培養(yǎng)基中接種霉菌孢子終濃度為5xl()S個(gè)/mL，接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量10%，于溫度3(TC，150rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)18小時(shí)，獲得發(fā)酵種子；以10%的接種量接入10L培養(yǎng)基的15L攪拌式發(fā)酵罐，于30°C，150卬m，通氣量0.5wm,培養(yǎng)24小時(shí)，得到富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物。(3)甲殼素的提取-向菌體中加入2。/。的NaOH溶液9(TC處理2小時(shí)脫蛋白質(zhì)，離心，過(guò)濾，在沉淀中加入2y。的乙酸溶液6(TC處理2小時(shí)，離心，沉淀即為甲殼素，水洗至中性，分別用95%乙醇和丙酮洗滌3次，干燥得精制甲殼素。(4)殼聚糖的提取在甲殼素的提取過(guò)程中離心后得到的上清液即為殼聚糖溶液，用10。/。的NaOH溶液調(diào)pH至8.0，離心，水洗至中性，分別用95%乙醇和丙酮洗滌3次，干燥得精制殼聚糖。(5)結(jié)果對(duì)不同霉菌的種子培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表3及表4。表3木質(zhì)纖維素水解液(木糖濃度35g/L)為主要營(yíng)養(yǎng)物的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果菌種菌體干重(g/L)甲殼素產(chǎn)量(g/g干菌體)殼聚糖產(chǎn)量(g/g干菌體)米根霉7.690.1610.126少根根霉7.340.1470.117黑曲霉7.210.〗500.124橘青霉7.140.1870.141毛霉6.390.1730.136表4以35g/L葡萄糖為主要營(yíng)養(yǎng)物的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果菌種菌體干重甲殼素產(chǎn)量(g/g干菌體)殼聚糖產(chǎn)量(g/g干菌體)米根霉7.050.1120.092少根根霉6.670.1170.098黑曲霉6.880.1240.128橘青霄7.380.1260.142毛霉6.840.1220.160實(shí)施例4本實(shí)施例的測(cè)定方法、發(fā)酵菌種等參數(shù)與實(shí)施例2方法相同。(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基將實(shí)施例1中水解木質(zhì)纖維素得到的溶液稀釋，使其中木糖濃度為40g/L，加入尿素3g/L，加H2S04調(diào)節(jié)pH至6.0。其中水解液、尿素分開(kāi)滅菌，115。C滅菌30分鐘。(2)菌體培養(yǎng)搖瓶一級(jí)培養(yǎng)的條件為向培養(yǎng)基中接種霉菌孢子終濃度為107+/mL,接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，接種量6%，于溫度32。C，220rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)249小時(shí)，獲得發(fā)酵種子；以6M的接種量接入10L培養(yǎng)基的15L攪拌式發(fā)酵罐，于32'C，220rpm，通氣量0.7vvm，培養(yǎng)30小時(shí)，得到富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物。(3)甲殼素的提取向菌體中加入5。/。的NaOH溶液10(TC處理3小時(shí)脫蛋白質(zhì)，離心，過(guò)濾，在沉淀中加入5。/。的乙酸溶液7(TC處理3小時(shí)，離心，沉淀即為甲殼素，水洗至中性，分別用95%乙醇和丙酮洗滌3次，干燥得精制甲殼素。(4)殼聚糖的提取在甲殼素的提取過(guò)程中離心后得到的上清液即為殼聚糖溶液，用20%的NaOH溶液調(diào)pH至9.0，離心，水洗至中性，分別用95%乙醇和丙酮洗滌3次，干燥得精制殼聚糖。'(5)結(jié)果對(duì)不同霉菌的培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表5。表5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例5本實(shí)施例的測(cè)定方法、發(fā)酵菌種等參數(shù)與實(shí)施例2方法相同。(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基將實(shí)施例1中水解獲得的木質(zhì)纖維素混合溶液濃縮，得到木糖濃度為10g/L的溶液，分別加入霉菌種子培養(yǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)KH2P041g/L，MgSCV7H201g/L，ZnS04.7H200.001g/L，F(xiàn)eSO4-7H2O0.1g/L，尿素4g/L，添加HC1控制pH為4.0。(2)菌體培養(yǎng)搖瓶一級(jí)培養(yǎng)的條件為向培養(yǎng)基中接種霉菌孢子終濃度為1()S個(gè)/mL，接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，接種量7%，于溫度32'C，220rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24小時(shí)，獲得發(fā)酵種子；以7M的接種量接入10L培養(yǎng)基的15L攪拌式發(fā)酵罐，于32'C，220rpm,通氣量0.6vvm，培養(yǎng)24小時(shí)，得到富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物。(3)甲殼素的提取向菌體中加入10%的NaOH溶液9(TC處理4小時(shí)脫蛋白質(zhì)，離心，過(guò)濾，在沉淀中加入10。/。的乙酸溶液10(TC處理2小時(shí)，離心，沉淀即為甲殼素，水洗至中性，分別用95%乙醇和丙酮洗滌3次，干燥得精制甲殼素。(4)殼聚糖的提取在甲殼素的提取過(guò)程中離心后得到的上清液即為殼聚糖溶液，用30。/。的NaOH溶液調(diào)pH至10.0，離心，水洗至中性，分別用95%乙醇和丙酮洗滌3次，干燥得精制殼聚糖。(5)結(jié)果對(duì)不同霉菌的培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表6。表6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果菌種菌體干重(g/L)甲殼素含量(g/g干菌體)殼聚糖產(chǎn)量(g/g干菌體)米根霉少根根霉黑曲霉毛霉2.822.592.642.333.090.1430.1580.1620.13601390.1560.1520.1420.1470.12權(quán)利要求1、一種利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于以稀酸處理木質(zhì)纖維素獲得的以木糖為主的水解液直接作為發(fā)酵底物配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，以霉菌作為發(fā)酵微生物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于所述的具體步驟如下(1)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將木質(zhì)纖維素酸水解后的水解液稀釋或濃縮成為木糖含量1050g/L的溶液，將其直接作為發(fā)酵底物，并且加入菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物積累所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌并冷卻；(2)菌體培養(yǎng)及產(chǎn)物積累向配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入霉菌孢子懸浮液，于溫度3035'C下培養(yǎng)4284小時(shí)，得到富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物。3、根據(jù)權(quán)利要求l至2所述的利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于所述的產(chǎn)物積累所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括氮源。4、根據(jù)權(quán)利要求l至2所述的利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于所述的產(chǎn)物積累所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括KH2PO40.1lg/L，MgS04'7H200.11g/L，ZnS04.7H200.00010.001g/L，F(xiàn)eS04'7H200.010.1g/L，尿素14g/L，添加中和劑控制pH為2.56.0。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于所述的添加的中和劑為H2SCU或HC1。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于所述的步驟(2)的具體方法為搖瓶一級(jí)培養(yǎng)的條件為向培養(yǎng)基中接種霉菌孢子終濃度為105107個(gè)/mL，接種量5%10%，于溫度3035。C,150220rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)1836小時(shí)，獲得發(fā)酵種子；以5%10%的接種量接入發(fā)酵罐，于3035。C,150400rpm，通氣量0.51vvm，培養(yǎng)2436小時(shí)，得到富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物。7、根據(jù)權(quán)利要求l至6所述的利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法，其特征在于所述的霉菌包括曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、根霉屬。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖的方法于以稀酸處理木質(zhì)纖維素獲得的以木糖為主的水解液直接作為發(fā)酵底物配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，以霉菌作為發(fā)酵微生物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到富集甲殼素/殼聚糖的發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明將木質(zhì)纖維素資源通過(guò)工藝成熟的酸水解法處理，將得到的主要含有木糖的水解液用于菌體生長(zhǎng)獲取細(xì)胞中的甲殼素/殼聚糖、以及其衍生物等高附加值產(chǎn)品，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇等大宗化學(xué)品而言，更加有利用前景；而且，木質(zhì)纖維素水解液能相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的其他高成本底物而言，反而更加有效地促進(jìn)了甲殼素/殼聚糖的積累。文檔編號(hào)C12P19/00GK101575627SQ20091003292公開(kāi)日2009年11月11日申請(qǐng)日期2009年6月1日優(yōu)先權(quán)日2009年6月1日發(fā)明者晴徐,霜李,超邰,和黃申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)