專利名稱：一種同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生方法及其培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物細(xì)胞培養(yǎng)，尤其涉及一種同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生方法及其培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代生命科學(xué)及其生物技術(shù)的快速發(fā)展，植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Somatic Embryogenesis)已經(jīng)成為針葉樹細(xì)胞工程、基因工程等分子與細(xì)胞高效育種技術(shù)中植株再生的重要途徑，可以用來研究干細(xì)胞無性系的細(xì)胞起源、調(diào)控和發(fā)育，利于闡明植物有性胚與無性胚發(fā)生機理，還是植物細(xì)胞全能性、分化及其形態(tài)建成研究的理想實驗體系，也是進行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、種質(zhì)保存、微體快繁、人工種子研制的重要手段。迄今，高效穩(wěn)定的體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)已成為針葉樹新種質(zhì)實現(xiàn)規(guī)?；療o性繁殖的主要途徑，是世界林業(yè)高新技術(shù)必須完成的迫在眉睫的任務(wù)，尤其是將其用于針葉樹育種與繁殖工程，理論價值與經(jīng)濟意義重大。
科學(xué)研究表明，裸子植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的發(fā)育進程不同于被子植物，以針葉樹為試材才能更科學(xué)地探索與揭示胚性細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育與增殖、分化以及生物體形成等生命現(xiàn)象。
目前，培養(yǎng)獲得針葉樹種體細(xì)胞胚的方法主要有直接發(fā)生、間接發(fā)生和混合發(fā)生三種。其中，直接發(fā)生即體細(xì)胞胚直接從原外植體不經(jīng)愈傷組織階段發(fā)育而成，其來源細(xì)胞可以是外植體表皮、亞表皮、合子胚等，約20多種外植體可按直接方式產(chǎn)生體細(xì)胞胚。但有相當(dāng)部分植物，尤其是木本植物的體細(xì)胞胚發(fā)生是間接方式，即體細(xì)胞胚是從愈傷組織，或從已形成體細(xì)胞胚的一組細(xì)胞中發(fā)育而成。此外，某些植物既可按直接方式又可按間接方式進行體細(xì)胞胚發(fā)生，叫混合發(fā)生方式，如取自鴨茅葉基的外植體，先形成愈傷組織，再進行體細(xì)胞胚發(fā)生；若取其葉尖則體細(xì)胞胚直接從外植體上產(chǎn)生，所用的培養(yǎng)基為MS、DCR、SH、LP、GD等針葉樹離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基。其存在的問題主要有早期原胚形成的狀態(tài)不好、胚性愈傷組織質(zhì)量不高、早期原胚發(fā)育不完全與子葉發(fā)育不正常、玻璃化問題、下胚軸不伸長、體細(xì)胞胚不生根等。
生理生化及分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型、不同細(xì)胞系以及不同階段發(fā)育形態(tài)的原胚繼代培養(yǎng)狀況，直接影響體細(xì)胞胚(Somatic Embryo)的質(zhì)量，如若增殖的早期原胚發(fā)育不好，直接影響其正常發(fā)育；原胚就不能發(fā)育到下一環(huán)節(jié)，而體細(xì)胞胚異常發(fā)育就會導(dǎo)致畸形胚發(fā)生。
因此現(xiàn)有技術(shù)有待改進和提高。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種能提高胚性細(xì)胞誘導(dǎo)頻率，改善早期原胚質(zhì)量的同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生方法及其培養(yǎng)基。
本發(fā)明提供了一種用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的基本培養(yǎng)基，其中，每升基本培養(yǎng)基溶液中包括以下組分 KNO3 2036～2936mg， NH4NO3233～340mg， KH2PO460～120mg， CaCl2.2H2O380～380mg， MgSO4.7H2O130～230mg， H3BO3 2～13mg， ZnSO4.7H2O3～8mg， MnSO4.H2O 5.5～11.5mg， Na2MoO4.2H2O 0.10～0.23mg， KI0.31～0.71mg， CuSO4.5H2O0.01～0.029mg， CoCl20.01～0.029mg。
一種用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其中，包括前面所述的基本培養(yǎng)基的各組分，每升誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液中還包括以下組分 FeSO4.7H2O13～21mg， 乙二胺四乙酸二鈉 15～27mg， 肌醇 50～1500mg， 維生素B1 0.4～0.6mg， 谷氨酰胺 400～700mg， 蔗糖 20,000～55,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg， 酸水解酪蛋白 350～1050mg， 6-芐氨基嘌呤 0.05～3.1mg， 激動素0.05～2.6mg， 瓊脂 2,500～7,000mg。
本發(fā)明所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其中的基本培養(yǎng)基中各組分含量為 KNO3 2273mg， NH4NO3267mg， KH2PO482mg， CaCl2.2H2O326mg， MgSO4.7H2O160mg， H3BO3 3.1mg， ZnSO4.7H2O4.3mg， MnSO4.H2O 8.4mg， Na2MoO4.2H2O 0.12mg， KI0.42mg， CuSO4.5H2O0.0125mg， CoCl2 0.0125mg。
一種用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的繼代培養(yǎng)基，其中，包括前面所述的基本培養(yǎng)基的各組分，每升繼代培養(yǎng)基溶液中還包括以下組分 FeSO4.7H2O13～21mg， 乙二胺四乙酸二鈉 15～27mg， 肌醇 50～1500mg， 維生素B1 0.4～0.6mg， 谷氨酰胺 400～700mg， 甘露醇1000～4000mg， 蔗糖 20,000～55,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸0.3～2.7mg， 酸水解酪蛋白 350～1050mg， 6-芐氨基嘌呤 0.05～3.1mg。
本發(fā)明所述的繼代培養(yǎng)基，其中的基本培養(yǎng)基中各組分含量為 KNO32718mg， NH4NO3 328mg， KH2PO4 112mg， CaCl2.2H2O 326mg， MgSO4.7H2O 201mg， H3BO3 8.9mg， ZnSO4.7H2O 4.8mg， MnSO4.H2O 10.5mg， 乙二胺四乙酸二鈉0.14mg， KI 0.48mg， CuSO4.5H2O 0.0125mg， CoCl2 0.0125mg。
一種用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的增殖培養(yǎng)基，其中，包括前面所述的基本培養(yǎng)基的各組分，每升增殖培養(yǎng)基溶液中還包括以下組分 FeSO4.7H2O 12～22mg， 乙二胺四乙酸二鈉 13～28mg， 肌醇 50～1750mg， 維生素B1 0.3～0.9mg， 谷氨酰胺 400～800mg， 甘露醇 700～4200mg， 蔗糖 15,000～75,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸 0.2～3.7mg， 酸水解酪蛋白 350～850mg， 6-芐氨基嘌呤 0.05～2.7mg。
本發(fā)明所述的增殖培養(yǎng)基，其中的基本培養(yǎng)基中各組分含量為 KNO3 2336mg， NH4NO3 276mg， KH2PO4 86mg， CaCl2.2H2O 326mg， MgSO4.7H2O 172mg， H3BO3 3.1mg， ZnSO4.7H2O 4.3mg， MnSO4.H2O 8.45mg， Na2MoO4.2H2O 0.125mg， KI 0.42mg， CuSO4.5H2O 0.0125mg， CoCl20.0125mg。
一種用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的成熟培養(yǎng)基，其中，包括前面所述的基本培養(yǎng)基的各組分，每升成熟培養(yǎng)基溶液中還包括以下組分 FeSO4.7H2O9～17mg， 乙二胺四乙酸二鈉 12～32mg， 肌醇 50～1750mg， 維生素B1 0.3～0.9mg， 谷氨酰胺 400～800mg， 甘露醇700～4200mg， 蔗糖 15,000～75,000mg， 聚乙二醇 10000～220000mg， 酸水解酪蛋白 350～850mg， 脫落酸3～200mg， 瓊脂 2,000～7,000mg。
本發(fā)明所述的成熟培養(yǎng)基，其中的基本培養(yǎng)基中各組分含量為 KNO3 2542mg， NH4NO3285mg， KH2PO488mg， CaCl2.2H2O326mg， MgSO4.7H2O188mg， H3BO3 8.9mg， ZnSO4.7H2O4.52mg， MnSO4.H2O 8.89mg， Na2MoO4.2H2O 0.131mg， KI0.46mg， CuSO4.5H2O0.0125mg， CoCl2 0.0125mg。
一種同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生方法，包括以下步驟 A、將針葉樹種未成熟胚消毒后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在23±5℃溫度，及暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，得到胚性細(xì)胞系； B、將胚性細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)兩次后，選取新分化的胚性細(xì)胞，轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，控制搖床轉(zhuǎn)速為110±30轉(zhuǎn)/分鐘，在23±5℃溫度，及暗培養(yǎng)條件下進行胚性保持繼代培養(yǎng)； C、將繼代后的胚性細(xì)胞系接種于增殖培養(yǎng)基中，控制搖床轉(zhuǎn)速為110±30轉(zhuǎn)/分鐘，在23±5℃溫度，及暗培養(yǎng)條件下，進行同步化調(diào)控培養(yǎng)，增殖獲得同步化的胚性細(xì)胞系； D、將步驟C中得到的胚性細(xì)胞系培養(yǎng)物接種于增殖培養(yǎng)基中，在23±5℃溫度，及暗培養(yǎng)條件下，進行胚性細(xì)胞系原胚的規(guī)?；鲋撑囵B(yǎng)； E、胚性細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)到預(yù)定數(shù)量后，轉(zhuǎn)接于成熟培養(yǎng)基中進行成熟培養(yǎng)，在23±5℃溫度，及暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，得到體細(xì)胞胚。
本發(fā)明所述的體細(xì)胞胚發(fā)生方法，其中，所述步驟A中采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每升溶液包括以下組分 KNO3 2036～2936mg， NH4NO3233～340mg， KH2PO460～120mg， CaCl2.2H2O380～380mg， MgSO4.7H2O130～230mg， H3BO3 2～13mg， ZnSO4.7H2O3～8mg， MnSO4.H2O 5.5～11.5mg， Na2MoO4.2H2O 0.10～0.23mg， KI0.31～0.71mg， CuSO4.5H2O0.01～0.029mg， CoCl2 0.01～0.029mg， FeSO4.7H2O13～21mg， 乙二胺四乙酸二鈉 15～27mg， 肌醇 50～1500mg， 維生素B1 0.4～0.6mg， 谷氨酰胺 400～700mg， 蔗糖 20,000～55,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg， 酸水解酪蛋白 350～1050mg， 6-芐氨基嘌呤 0.05～3.1mg， 激動素0.05～2.6mg， 瓊脂2,500～7,000mg。
本發(fā)明所述的體細(xì)胞胚發(fā)生方法，其中，所述步驟B中采用的繼代培養(yǎng)基中，每升溶液包括以下組分 KNO32036～2936mg， NH4NO3 233～340mg， KH2PO4 60～120mg， CaCl2.2H2O 380～380mg， MgSO4.7H2O 130～230mg， H3BO3 2～13mg， ZnSO4.7H2O 3～8mg， MnSO4.H2O 5.5～11.5mg， Na2MoO4.2H2O0.10～0.23mg， KI 0.31～0.71mg， CuSO4.5H2O 0.01～0.029mg， CoCl2 0.01～0.029mg， FeSO4.7H2O 13～21mg， 乙二胺四乙酸二鈉15～27mg， 肌醇50～1500mg， 維生素B10.4～0.6mg， 谷氨酰胺400～700mg， 甘露醇 1000～4000mg， 蔗糖20,000～55,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg， 酸水解酪蛋白350～1050mg， 6-芐氨基嘌呤0.05～3.1mg。
本發(fā)明所述的體細(xì)胞胚發(fā)生方法，其中，所述步驟C或D中采用的增殖培養(yǎng)基中，每升溶液包括以下組分 KNO32036～2936mg， NH4NO3 3233～340mg， KH2PO4 60～120mg， CaCl2.2H2O 380～380mg， MgSO4.7H2O 130～230mg， H3BO3 2～13mg， ZnSO4.7H2O 3～8mg， MnSO4.H2O 5.5～11.5mg， Na2MoO4.2H2O0.10～0.23mg， KI 0.31～0.71mg， CuSO4.5H2O 0.01～0.029mg， CoCl2 0.01～0.029mg， FeSO4.7H2O 12～22mg， 乙二胺四乙酸二鈉 13～28mg， 肌醇 50～1750mg， 維生素B1 0.3～0.9mg， 谷氨酰胺 400～800mg， 甘露醇 700～4200mg， 蔗糖 15,000～75,000mg， 2，4-二氯苯氧乙酸 0.2～3.7mg， 酸水解酪蛋白 350～850mg， 6-芐氨基嘌呤 0.05～2.7mg。
本發(fā)明所述的體細(xì)胞胚發(fā)生方法，其中，所述步驟E中采用的成熟培養(yǎng)基中，每升溶液包括以下組分 KNO3 2036～2936mg， NH4NO3233～340mg， KH2PO460～120mg， CaCl2.2H2O380～380mg， MgSO4.7H2O130～230mg， H3BO3 2～13mg， ZnSO4.7H2O3～8mg， MnSO4.H2O 5.5～11.5mg， Na2MoO4.2H2O 0.10～0.23mg， KI0.31～0.71mg， CuSO4.5H2O0.01～0.029mg， CoCl2 0.01～0.029mg， FeSO4.7H2O9～17mg， 乙二胺四乙酸二鈉 12～32mg， 肌醇 50～1750mg， 維生素B1 0.3～0.9mg， 谷氨酰胺 400～800mg， 甘露醇700～4200mg， 蔗糖 15,000～75,000mg， 聚乙二醇 10000～220000mg， 酸水解酪蛋白 350～850mg， 脫落酸3～200mg， 瓊脂 2,000～7,000mg。
本發(fā)明通過對培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，提高了胚性細(xì)胞誘導(dǎo)頻率，提高了胚頭與胚柄正常率，原胚的愈傷化和畸形胚減少，且可見的子葉胚基本為同步化、標(biāo)準(zhǔn)化，其生根、伸長率達到90％，解決了胚性細(xì)胞系培養(yǎng)過程中原胚發(fā)育同步化癥結(jié)，在針葉樹中首先建立了體細(xì)胞胚同步化與規(guī)模化培養(yǎng)體系。



圖1為本發(fā)明實施例的同步化調(diào)控后發(fā)生的落葉松體細(xì)胞胚； 圖2為本發(fā)明實施例的同步化調(diào)控后液體上規(guī)模化發(fā)生的落葉松體細(xì)胞胚； 圖3為本發(fā)明實施例的成熟培養(yǎng)基上發(fā)生的落葉松體細(xì)胞胚形態(tài)； 圖4為本發(fā)明實施例的同步化調(diào)控后固體上規(guī)?；l(fā)生的落葉松體細(xì)胞胚。

具體實施例方式 以下對本發(fā)明的較佳實施例加以詳細(xì)說明。
本發(fā)明所提供的同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的培養(yǎng)基，包括誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基，可應(yīng)用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的各個步驟中。其中，這四種培養(yǎng)基均以基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，針對不同的培養(yǎng)基，可適當(dāng)調(diào)整基本培養(yǎng)基中各成分的含量，以提高胚性細(xì)胞誘導(dǎo)頻率、胚頭與胚柄正常率等，下面逐一舉例說明。
實施例1 本發(fā)明的用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的基本培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基溶液中各組分及其含量如表1所示。
以下表1中示出了5組基本培養(yǎng)基的組分，分別為組分1、組分2、組分3、組分4和組分5。
表1基本培養(yǎng)基各組分(單位mg/L) 實施例2 本發(fā)明的用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括實施例1中的基本培養(yǎng)基各組分，每升誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液中還包括鐵鹽、維生素及其他有機成分。
以下表2中示出了5組誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組分，分別為組分1、組分2、組分3、組分4和組分5，溶液pH值為5.4-6.4。
表2誘導(dǎo)培養(yǎng)基中各組分(單位mg/L) 實施例3 本發(fā)明的用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的繼代培養(yǎng)基，包括實施例1中的基本培養(yǎng)基各組分，每升繼代培養(yǎng)基溶液中還包括鐵鹽、維生素及其他有機成分。
以下表3中示出了5組繼代培養(yǎng)基的組分，分別為組分1、組分2、組分3、組分4和組分5，溶液pH值為5.4-6.4。
表3繼代培養(yǎng)基中各組分(單位mg/L) 實施例4 本發(fā)明的用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的增殖培養(yǎng)基，包括實施例1中的基本培養(yǎng)基各組分，每升增殖培養(yǎng)基溶液中還包括鐵鹽、維生素及其他有機成分。
以下表4中示出了5組增殖培養(yǎng)基的組分，分別為組分1、組分2、組分3、組分4和組分5，溶液pH值為5.4-6.4。
表4增殖培養(yǎng)基中各組分(單位mg/L) 實施例5 本發(fā)明的用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的成熟培養(yǎng)基，包括實施例1中的基本培養(yǎng)基各組分，每升成熟培養(yǎng)基溶液中還包括鐵鹽、維生素及其他有機成分。
以下表5中示出了5組誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組分，分別為組分1、組分2、組分3、組分4和組分5，溶液pH值為5.4-6.4。其中優(yōu)選采用分子量為4000的聚乙二醇(PEG4000)。
表5成熟培養(yǎng)基中各組分(單位mg/L) 實施例6 本實施例給出了在誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、成熟培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基(以下以“四種培養(yǎng)基”代稱)中優(yōu)選的基本培養(yǎng)基所含有的組分，如下表6所示。
表6四種培養(yǎng)基中分別優(yōu)選的基本培養(yǎng)基組分(單位mg/L) 實施例7 本實施例給出了同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生方法，包括實驗材料、實驗方法以及實驗結(jié)果，下面分別描述如下 一、實驗材料與方法 1、實驗材料 選用華北落葉松、日本落葉松、長白落葉松、雜種落葉松等針葉樹的未成熟合子胚誘導(dǎo)與建立胚性細(xì)胞系。
采用前述各實施例中的培養(yǎng)基溶液進行培養(yǎng)，也可調(diào)整培養(yǎng)基各組分含量，使之應(yīng)用于云杉、華山松、白皮松、北美喬松、思茅松等針葉樹的未成熟合子胚誘導(dǎo)與建立胚性細(xì)胞系。
需要說明的是，本發(fā)明以下方法中的生物反應(yīng)器規(guī)?；鲋撤椒ㄖ贿m合于各種落葉松，其它針葉樹種適合采用三角瓶液體培養(yǎng)方法。
2、實驗方法 1)接種、誘導(dǎo)培養(yǎng) 用鑷子從球果中取出種子，采用70％酒精浸泡1分鐘，采用0.1％升汞溶液浸泡6分鐘，采用無菌水沖洗5次后，接種備用；在超凈臺中剝?nèi)》N胚，從側(cè)部劃開種殼，取出種仁，劃破內(nèi)種皮，挑開胚乳，將嫩胚同胚柄一起接種于培養(yǎng)基上，每皿接種15～25個，整齊排放、重復(fù)4次；在溫度21～27℃下暗培養(yǎng)，20～30天根據(jù)顏色、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等特征，初步確定胚性細(xì)胞組織； 2)繼代培養(yǎng) 針葉樹胚性細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)兩次，然后轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中進行胚性保持繼代培養(yǎng)，每次轉(zhuǎn)接時均選取新分化的胚性細(xì)胞，在三角瓶中液體繼代時，按照重量于體積比2％進行接種，即100ml液體培養(yǎng)基中接種2克新鮮的胚性細(xì)胞系，搖床轉(zhuǎn)速110±30轉(zhuǎn)/分鐘，在溫度為23±5℃、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)； 3)同步化調(diào)控培養(yǎng) 針葉樹胚性愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)兩次后，轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中進行增殖、繼代培養(yǎng)，每次轉(zhuǎn)接時均選取新分化的胚性細(xì)胞，再將繼代保持得到的胚性細(xì)胞系接種于液體培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基中的三角瓶內(nèi)，在130±50轉(zhuǎn)/分、23±5℃、暗培養(yǎng)條件下進行同步化調(diào)控培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物生長情況調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件，增殖獲得同步化頻率90％以上的胚性細(xì)胞系，如圖1所示； 4)規(guī)模化增殖培養(yǎng)將上述胚性細(xì)胞系培養(yǎng)物接種于液體培養(yǎng)基的相同新鮮增殖培養(yǎng)基，用生物反應(yīng)器中進行胚性細(xì)胞系原胚的規(guī)模化增殖培養(yǎng)。在專用生物反應(yīng)器中液體增殖時按照重量于體積比0.5～1％進行接種，即100ml液體培養(yǎng)基中接種0.5～1克新鮮、游離的胚性細(xì)胞系，在23±5℃、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，觀察同步化調(diào)控后液體上規(guī)?；l(fā)生的落葉松體細(xì)胞胚如圖2所示，同步化調(diào)控后固體上規(guī)模化發(fā)生的落葉松體細(xì)胞胚如圖4所示； 5)成熟培養(yǎng)針葉樹胚性細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)到一定數(shù)量后，轉(zhuǎn)接于成熟培養(yǎng)基中進行成熟培養(yǎng)，在23±5℃、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。在成熟培養(yǎng)基上約20～65天時間段內(nèi)，不同胚性細(xì)胞系的成熟時間差異較大，有可見的小胚發(fā)生后，移到25±3℃、1600～2000lx的光照條件下進行光培養(yǎng)，不同胚性細(xì)胞系選擇成熟培養(yǎng)基發(fā)生體細(xì)胞胚的數(shù)量與質(zhì)量差異較大，觀察成熟培養(yǎng)基上發(fā)生的落葉松體細(xì)胞胚形態(tài)如圖3所示。
本實施例中，所采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、成熟培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基，可以是實施例2至5中對應(yīng)的四種培養(yǎng)基，優(yōu)選采用以下組分，如表7所示，各培養(yǎng)基溶液pH值優(yōu)選配置為5.8。
表7四種培養(yǎng)基優(yōu)選組分(單位mg/L) 二、實驗結(jié)果 采用上述培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件得到的體細(xì)胞胚照片如圖1至圖4所示；落葉松不同胚性細(xì)胞系體細(xì)胞胚發(fā)生數(shù)量及畸形胚比率見表8。
表8落葉松不同胚性細(xì)胞系體細(xì)胞胚發(fā)生數(shù)量及畸形胚比率 以上結(jié)果表明，使用本發(fā)明的同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生方法后，提高了胚性細(xì)胞誘導(dǎo)頻率，早期原胚質(zhì)量大大改善，胚頭與胚柄正常率達到90％以上，原胚的愈傷化和畸形胚減少45％，高質(zhì)量子葉胚90％以上，每升增殖后的液體培養(yǎng)基中含有30000～50000個原胚，每克胚性愈傷組織上可發(fā)生260～460個子葉胚，畸形胚近于10％以下，且可見的子葉胚基本為同步化、標(biāo)準(zhǔn)化，其生根、伸長率達到90％；比現(xiàn)有技術(shù)中胚性細(xì)胞系的增殖頻率和增殖數(shù)量提高15～20倍。子葉胚發(fā)生頻率與固體培養(yǎng)體系相當(dāng)，但由于增殖的胚性細(xì)胞或原胚數(shù)量大，所以實際獲得的正常子葉胚的數(shù)量是固體系統(tǒng)的10～15倍。
綜上所述，通過采用本發(fā)明方案，包括同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生方法及其配套使用的基本培養(yǎng)基，及其對應(yīng)的四種培養(yǎng)基，大大改善了現(xiàn)有固體培養(yǎng)系統(tǒng)中，每克胚性愈傷組織上發(fā)生5～25個子葉胚、畸形胚占到70％以上、體細(xì)胞胚生根率0～7％等狀況，解決了胚性細(xì)胞系培養(yǎng)過程中原胚發(fā)育同步化癥結(jié)，真正突破了針葉樹體細(xì)胞胚規(guī)?；l(fā)生難關(guān)，目前已在落葉松等針葉樹胚性細(xì)胞系上獲得成功，在針葉樹中首先建立了體細(xì)胞胚同步化與規(guī)模化培養(yǎng)體系。
應(yīng)當(dāng)理解，上述針對具體實施例的描述較為詳細(xì)，并不能因此而認(rèn)為是對本發(fā)明專利保護范圍的限制，本發(fā)明的專利保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1、一種用于同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生的基本培養(yǎng)基，其特征在于，每升基本培養(yǎng)基溶液中包括以下組分
KNO3 2036～2936mg，
NH4NO3 233～340mg，
KH2PO4 60～120mg，
CaCl2.2H2O 380～380mg，
MgSO4.7H2O 130～230mg，
H3BO32～13mg，
ZnSO4.7H2O 3～8mg，
MnSO4.H2O5.5～11.5mg，
Na2MoO4.2H2O 0.10～0.23mg，
KI 0.31～0.71mg，
CuSO4.5H2O 0.01～0.029mg，
CoCl20.01～0.029mg。
2、一種包括如權(quán)利要求1所述基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，每升誘導(dǎo)培養(yǎng)基溶液中還包括以下組分
FeSO4.7H2O 13～21mg，
乙二胺四乙酸二鈉15～27mg，
肌醇50～1500mg，
維生素B10.4～0.6mg，
谷氨酰胺400～700mg，
蔗糖20,000～55,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg，
酸水解酪蛋白350～1050mg，
6-芐氨基嘌呤0.05～3.1mg，
激動素 0.05～2.6mg，
瓊脂2,500～7,000mg。
3、如權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的基本培養(yǎng)基中各組分為
KNO32273mg，
NH4NO3267mg，
KH2PO482mg，
CaCl2.2H2O326mg，
MgSO4.7H2O160mg，
H3BO3 3.1mg，
ZnSO4.7H2O4.3mg，
MnSO4.H2O 8.4mg，
Na2MoO4.2H2O 0.12mg，
KI0.42mg，
CuSO4.5H2O0.0125mg，
CoCl2 0.0125mg。
4、一種包括如權(quán)利要求1所述基本培養(yǎng)基的繼代培養(yǎng)基，其特征在于，每升繼代培養(yǎng)基溶液中還包括以下組分
FeSO4.7H2O 13～21mg，
乙二胺四乙酸二鈉15～27mg，
肌醇50～1500mg，
維生素B10.4～0.6mg，
谷氨酰胺400～700mg，
甘露醇 1000～4000mg，
蔗糖20,000～55,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg，
酸水解酪蛋白350～1050mg，
6-芐氨基嘌呤0.05～3.1mg。
5、如權(quán)利要求4所述的繼代培養(yǎng)基，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)基中基本培養(yǎng)基中各組分為
KNO3 2718mg，
NH4NO3 328mg，
KH2PO4 112mg，
CaCl2.2H2O 326mg，
MgSO4.7H2O 201mg，
H3BO38.9mg，
ZnSO4.7H2O 4.8mg，
MnSO4.H2O10.5mg，
Na2MoO4.2H2O 0.14mg，
KI 0.48mg，
CuSO4.5H2O 0.0125mg，
CoCl2 0.0125mg。
6、一種包括如權(quán)利要求1所述基本培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基，其特征在于，每升增殖培養(yǎng)基溶液中還包括以下組分
FeSO4.7H2O12～22mg，
乙二胺四乙酸二鈉 13～28mg，
肌醇 50～1750mg，
維生素B1 0.3～0.9mg，
谷氨酰胺 400～800mg，
甘露醇700～4200mg，
蔗糖 15,000～75,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.2～3.7mg，
酸水解酪蛋白 350～850mg，
6-芐氨基嘌呤 0.05～2.7mg。
7、如權(quán)利要求6所述的增殖培養(yǎng)基，其特征在于，所述增殖培養(yǎng)基中的基本培養(yǎng)基中各組分為
KNO32336mg，
NH4NO3 276mg，
KH2PO4 86mg，
CaCl2.2H2O 326mg，
MgSO4.7H2O 172mg，
H3BO3 3.1mg，
ZnSO4.7H2O 4.3mg，
MnSO4.H2O 8.45mg，
Na2MoO4.2H2O0.125mg，
KI 0.42mg，
CuSO4.5H2O 0.0125mg，
CoCl2 0.0125mg。
8、一種包括如權(quán)利要求1所述基本培養(yǎng)基的成熟培養(yǎng)基，其特征在于，每升成熟培養(yǎng)基溶液中還包括以下組分
FeSO4.7H2O 9～17mg，
乙二胺四乙酸二鈉12～32mg，
肌醇50～1750mg，
維生素B10.3～0.9mg，
谷氨酰胺400～800mg，
甘露醇 700～4200mg，
蔗糖15,000～75,000mg，
聚乙二醇10000～220000mg，
酸水解酪蛋白350～850mg，
脫落酸 3～200mg，
瓊脂2,000～7,000mg。
9、如權(quán)利要求8所述的成熟培養(yǎng)基，其特征在于，所述成熟培養(yǎng)基中的基本培養(yǎng)基中各組分為
KNO3 2542mg，
NH4NO3 285mg，
KH2PO4 88mg，
CaCl2.2H2O 326mg，
MgSO4.7H2O 188mg，
H3BO38.9mg，
ZnSO4.7H2O 4.52mg，
MnSO4.H2O8.89mg，
Na2MoO4.2H2O 0.131mg，
KI 0.46mg，
CuSO4.5H2O 0.0125mg，
CoCl20.0125mg。
10、一種同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生方法，包括以下步驟
A、將針葉樹種未成熟胚消毒后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在23±5℃溫度、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，得到胚性細(xì)胞系；
B、將胚性細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)兩次后，選取新分化的胚性細(xì)胞，轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，控制搖床轉(zhuǎn)速為110±30轉(zhuǎn)/分鐘，在23±5℃溫度、暗培養(yǎng)條件下進行胚性保持繼代培養(yǎng)；
C、將繼代后的胚性細(xì)胞系接種于增殖培養(yǎng)基中，控制搖床轉(zhuǎn)速為110±30轉(zhuǎn)/分鐘，在23±5℃溫度、暗培養(yǎng)條件下，進行同步化調(diào)控培養(yǎng)，增殖獲得同步化的胚性細(xì)胞系；
D、將步驟C中得到的胚性細(xì)胞系培養(yǎng)物接種于增殖培養(yǎng)基中，在23±5℃溫度、暗培養(yǎng)條件下，進行胚性細(xì)胞系原胚的規(guī)模化增殖培養(yǎng)；
E、胚性細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)到預(yù)定數(shù)量后，轉(zhuǎn)接于成熟培養(yǎng)基中進行成熟培養(yǎng)，在23±5℃溫度、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，得到體細(xì)胞胚。
11、如權(quán)利要求10所述的體細(xì)胞胚發(fā)生方法，其特征在于，所述步驟A中采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每升溶液包括以下組分
KNO32036～2936mg，
NH4NO3 233～340mg，
KH2PO4 60～120mg，
CaCl2.2H2O 380～380mg，
MgSO4.7H2O 130～230mg，
H3BO3 2～13mg，
ZnSO4.7H2O 3～8mg，
MnSO4.H2O 5.5～11.5mg，
Na2MoO4.2H2O0.10～0.23mg，
KI 0.31～0.71mg，
CuSO4.5H2O 0.01～0.029mg，
CoCl2 0.01～0.029mg，
FeSO4.7H2O 13～21mg，
乙二胺四乙酸二鈉15～27mg，
肌醇50～1500mg，
維生素B10.4～0.6mg，
谷氨酰胺400～700mg，
蔗糖20,000～55,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg，
酸水解酪蛋白350～1050mg，
6-芐氨基嘌呤0.05～3.1mg，
激動素 0.05～2.6mg，
瓊脂2,500～7,000mg。
12、如權(quán)利要求10所述的體細(xì)胞胚發(fā)生方法，其特征在于，所述步驟B中采用的繼代培養(yǎng)基中，每升溶液包括以下組分
KNO32036～2936mg，
NH4NO3 233～340mg，
KH2PO4 60～120mg，
CaCl2.2H2O 380～380mg，
MgSO4.7H2O 130～230mg，
H3BO3 2～13mg，
ZnSO4.7H2O 3～8mg，
MnSO4.H2O 5.5～11.5mg，
Na2MoO4.2H2O0.10～0.23mg，
KI 0.31～0.71mg，
CuSO4.5H2O 0.01～0.029mg，
CoCl2 0.01～0.029mg，
FeSO4.7H2O 13～21mg，
乙二胺四乙酸二鈉15～27mg，
肌醇50～1500mg，
維生素B10.4～0.6mg，
谷氨酰胺400～700mg，
甘露醇 1000～4000mg，
蔗糖20,000～55,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.3～2.7mg，
酸水解酪蛋白350～1050mg，
6-芐氨基嘌呤0.05～3.1mg。
13、如權(quán)利要求10所述的體細(xì)胞胚發(fā)生方法，其特征在于，所述步驟C或D中采用的增殖培養(yǎng)基中，每升溶液包括以下組分
KNO3 2036～2936mg，
NH4NO3233～340mg，
KH2PO460～120mg，
CaCl2.2H2O380～380mg，
MgSO4.7H2O130～230mg，
H3BO3 2～13mg，
ZnSO4.7H2O3～8mg，
MnSO4.H2O 5.5～11.5mg，
乙二胺四乙酸二鈉 0.10～0.23mg，
KI0.31～0.71mg，
CuSO4.5H2O0.01～0.029mg，
CoCl2 0.01～0.029mg，
FeSO4.7H2O12～22mg，
Na2.EDTA.H2O13～28mg，
肌醇50～1750mg，
維生素B10.3～0.9mg，
谷氨酰胺400～800mg，
甘露醇 700～4200mg，
蔗糖15,000～75,000mg，
2，4-二氯苯氧乙酸 0.2～3.7mg，
酸水解酪蛋白350～850mg，
6-芐氨基嘌呤0.05～2.7mg。
14、如權(quán)利要求10所述的體細(xì)胞胚發(fā)生方法，其特征在于，所述步驟E中采用的成熟培養(yǎng)基中，每升溶液包括以下組分
KNO3 2036～2936mg，
NH4NO3233～340mg，
KH2PO460～120mg，
CaCl2.2H2O380～380mg，
MgSO4.7H2O130～230mg，
H3BO3 2～13mg，
ZnSO4.7H2O3～8mg，
MnSO4.H2O 5.5～11.5mg，
Na2MoO4.2H2O 0.10～0.23mg，
KI0.31～0.71mg，
CuSO4.5H2O0.01～0.029mg，
CoCl2 0.01～0.029mg，
FeSO4.7H2O9～17mg，
乙二胺四乙酸二鈉 12～32mg，
肌醇 50～1750mg，
維生素B1 0.3～0.9mg，
谷氨酰胺 400～800mg，
甘露醇700～4200mg，
蔗糖 15,000～75,000mg，
聚乙二醇 10000～220000mg，
酸水解酪蛋白 350～850mg，
脫落酸3～200mg，
瓊脂 2,000～7,000mg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同步化調(diào)控針葉樹體細(xì)胞胚發(fā)生方法及其培養(yǎng)基，其中所提供培養(yǎng)基包括誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基。應(yīng)用上述培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)獲得針葉樹種體細(xì)胞胚的方法，包括如下步驟誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、同步化調(diào)控培養(yǎng)、規(guī)?；鲋撑囵B(yǎng)和成熟培養(yǎng)，最后得到體細(xì)胞胚。本發(fā)明通過對培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，提高了胚性細(xì)胞誘導(dǎo)頻率，提高了胚頭與胚柄正常率，原胚的愈傷化和畸形胚減少，且可見的子葉胚基本為同步化、標(biāo)準(zhǔn)化，其生根、伸長率達到90％，解決了胚性細(xì)胞系培養(yǎng)過程中原胚發(fā)育同步化癥結(jié)，在針葉樹中首先建立了體細(xì)胞胚同步化與規(guī)?；囵B(yǎng)體系。
文檔編號C12N5/04GK101633903SQ20091010926
公開日2010年1月27日 申請日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者齊玉琛 申請人:齊玉琛