專利名稱：一種橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發(fā)生植株再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，具體地說，涉及一種以橡膠 樹試管苗無菌根作為外植體，通過體細胞胚發(fā)生途徑獲得再生植株的方法。
背景技術(shù)：
橡膠樹是多年生的異花授粉喬木，栽培于熱帶地區(qū)。橡膠樹的主 產(chǎn)品天然橡膠是重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資，在國民經(jīng)濟中占有重要 地位。由于我國熱帶地區(qū)可種植橡膠樹的土地資源有限，且天然橡膠 屬于不可替代的稀缺資源。因此，選育和推廣高產(chǎn)橡膠樹，是提高單 位面積產(chǎn)量、確保我國天然橡膠總產(chǎn)量逐步提高的關(guān)鍵。
隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，從上世紀七十年代以來，橡膠樹 組織培養(yǎng)技術(shù)也蓬勃開展，以期利用生物技術(shù)拓寬橡膠樹育種途徑， 改良其性狀，加速育種進程。目前橡膠樹不同外植體來源的組織培養(yǎng)， 如花藥、未授粉胚珠、子房、內(nèi)珠被、子葉培養(yǎng)均獲得成功，獲得了 再生植株。但橡膠樹根的組織培養(yǎng)還未見報道。
在其它植物中，從木本植物的根進行離體培養(yǎng)研究成功地誘導出
再生植株的報道較少。1990年Son等用銀白楊試管苗的根系切取外植 體，經(jīng)組織培養(yǎng)得到了再生植株。1991年法國的Pedrotti等進行了櫻桃 的根系離體培養(yǎng)，通過間接愈傷組織誘導和直接芽誘導，成功地培養(yǎng) 出植株。1992年Bhat等切取酸檸檬的根在MS培養(yǎng)基中進行組織培養(yǎng)， 有低頻的植株再生。1996年Sankhla等把合歡種子在無菌條件下誘導 萌發(fā)，取15 20天齡的幼苗的根作為外植體，經(jīng)組織培養(yǎng)得到再生植 株。
在橡膠樹栽培實踐中，最早使用的種植材料是實生樹，實生樹來自自然授粉的種子，具有生長快、經(jīng)濟壽命長、抗逆性強的優(yōu)點，但 存在株間差異大、平均產(chǎn)量低(僅為芽接樹的1/3)、不能保持母本優(yōu) 良性狀的缺點。
目前生產(chǎn)上普遍種植芽接樹，使用的橡膠樹繁殖的主要方法是嫁 接，即橡膠樹種植材料主要是用芽接苗；芽接樹減少了株間產(chǎn)量的差 異，大幅度提高了產(chǎn)量。但是砧木與接穗間存在相互作用，砧木對接 穗的影響不僅表現(xiàn)在生長、產(chǎn)量、生理生化特性及組織結(jié)構(gòu)上，而且 還表現(xiàn)在內(nèi)源植物激素方面，產(chǎn)量的變化與內(nèi)源激素之間存在某種 聯(lián)系。
近年來，發(fā)現(xiàn)一些具有優(yōu)良性狀的砧木，對芽接樹的產(chǎn)量、抗寒、 速生等性狀有重要影響。 一般在我國大規(guī)模種植的高產(chǎn)橡膠樹品種如
熱研7-33-97，單株年產(chǎn)干膠6 7公斤。但目前在云南發(fā)現(xiàn)有些品種有 超高產(chǎn)的橡膠樹，單株年產(chǎn)干膠100公斤以上，在西雙版納傣族自治 州景洪巿也有單株年產(chǎn)干膠98公斤的橡膠樹。橡膠樹育種工作者取一 些超高產(chǎn)橡膠樹的芽條與實生苗砧木進行嫁接后，并未發(fā)現(xiàn)嫁接苗長 大后在產(chǎn)量上出現(xiàn)超高產(chǎn)的情況。
從同一母本植株取芽條進行嫁接的芽接樹，其接穗的遺傳性狀是
相同的；而作為砧木的實生苗，由種子萌發(fā)而來，在有性生殖過程中 發(fā)生了基因分離，因而實生苗砧木的遺傳背景差別很大。芽接樹成年 后，普通高產(chǎn)橡膠樹之間產(chǎn)量差別小，但超高產(chǎn)橡膠樹和普通高產(chǎn)橡 膠樹之間產(chǎn)量差別則很大，相差幾倍到十幾倍，這與砧木的遺傳性狀 有關(guān)。
在科研和生產(chǎn)過程中，迫切需要對這些具有優(yōu)良性質(zhì)的砧木進行 擴大繁殖。但由于確定砧木具有優(yōu)良品性要等到開割以后，需要7年 以上時間，此時在砧木上難以找到芽點或芽眼，優(yōu)良砧木難以通過常 規(guī)育種方法擴大繁殖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用橡膠樹優(yōu)良品種的試管苗無菌根為外植體， 經(jīng)體細胞胚發(fā)生途徑獲得再生植株，以建立優(yōu)良砧木離體培養(yǎng)無性繁 殖體系、獲得在遺傳上整齊一致的砧木。
為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所述的橡膠樹試管苗無菌根體細
胞胚發(fā)生植株再生方法，包括如下步驟
1) 根的選擇和處理選取橡膠樹花藥培養(yǎng)經(jīng)過胚狀體發(fā)生途徑 得到的試管苗的無菌幼根，切成長度約1.0~ 1.5cm的根段；
2) 愈傷組織的誘導和繼代培養(yǎng)把根段接種于胚性愈傷組織誘 導培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)25 -40天；然后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)15-30 天，培養(yǎng)溫度為25~28°C;
3) 體細胞胚的誘導將繼代培養(yǎng)后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到體細 胞胚誘導培養(yǎng)基，進行暗培養(yǎng)20 50天，培養(yǎng)溫度為25-28°C，以 誘導出體細胞胚；
4) 植株再生再將成熟體細胞胚轉(zhuǎn)移到出苗培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)， 培養(yǎng)溫度在25 28。C之間，培養(yǎng)20 50天，長成完整植株。
本發(fā)明所述的根的選擇和處理，是選取長勢較好，且來源于性 狀優(yōu)良的橡膠樹品種，經(jīng)過橡膠樹花藥培養(yǎng)胚狀體發(fā)生途徑得到的 試管苗的無菌幼根，直徑為0.8-1.2mm，切成長度為1.0 ~ 1.5cm的 根段，作為根段外植體材料，用于誘導胚性愈傷組織。
本發(fā)明所述的愈傷組織的誘導和繼代培養(yǎng)是將根段外植體接 種于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基，進行暗培養(yǎng)，誘導出胚性愈傷組織。 培養(yǎng)溫度為25~28°C，暗培養(yǎng)25 40天，根段在胚性愈傷組織誘導 培養(yǎng)基中膨大，部分愈傷化，出現(xiàn)白色非胚性愈傷組織和鮮黃色胚 性愈傷組織。
然后將鮮黃色胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，進行暗培養(yǎng)，培 養(yǎng)溫度為25-28。C，暗培養(yǎng)15 30天。鮮黃色胚性愈傷組織進一步增殖。
本發(fā)明所述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，將MS
培養(yǎng)基中的無水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鎂的含
量調(diào)整為無水氯化鈣150~400mg/L、磷酸二氫鉀350 ~ 500mg/L、四 水硫酸錳15 ~ 40mg/L、七水硫酸鎂400 ~ 600mg/L;并添加2,4-D( 2,4-二氯苯氧乙酸)1 ~ 5mg/L、KT( 6-糠氨基嘌呤，又名激動素)1 ~ 5mg/L、 6-BA ( 6-節(jié)氨基嘌呤)0.5 ~ 5.0mg/L、 Phytagel (植物凝膠)2 ~ 3g/L、 蔗糖50 ~ 90g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
所述的繼代培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，并添加2,4-D 1 ~ 3mg/L、 KT l~3mg/L、 NAA (萘乙酸)l~3mg/L、 Phytagel 2~3g/L、蔗糖 5 0 ~ 90g/L 、椰子水40 ~ 90ml/L 。
本發(fā)明所述的體細胞胚的誘導是將鮮黃色胚性愈傷組織經(jīng)過繼 代培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移到體細胞胚誘導培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)，以誘導出體細 胞胚，暗培養(yǎng)20 50天，培養(yǎng)溫度為25~28°C。鮮黃色胚性愈傷組
織表面出現(xiàn)了長勢旺盛的乳白色的小體細胞胚， 一 塊胚性愈傷組織可 誘導出一至數(shù)十個體細胞胚。體細胞胚在此培養(yǎng)基上可進一步發(fā)育。 所述的體細胞胚誘導培養(yǎng)基是改良的MS培養(yǎng)基，并添加6-BA 0.5 ~ 2.0mg/L、 KT 0.5 ~ 3.0mg/L、 NAA 0.1 ~ 1.0mg/L、 GA3 0.1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2 ~3g/L、蔗糖50 90g/L、活性碳1 ~ 2g/L、椰子 水40 ~ 90ml/L。
本發(fā)明所述的植株再生方法，是將成熟子葉型體細胞胚轉(zhuǎn)移到出 苗培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)，以促其萌發(fā)，長成完整植株，培養(yǎng)溫度為25 28°C,培養(yǎng)20-50天。
所述的出苗培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，并添加KT 0.5 ~ 4.0mg/L、 NAA0.1 ~ 1.0mg/L、 GA3 (赤霉素)0.1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2~3g/L、蔗糖50-90g/L、活性碳1-2g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
本發(fā)明以橡膠樹根為外植體材料建立的植株再生體系，為橡膠樹研究領(lǐng)域一直關(guān)心的砧穗關(guān)系開辟了新的研究途徑。橡膠樹的砧木一 直釆用實生苗，遺傳背景差異大，用高產(chǎn)芽接樹的根通過組織培養(yǎng)方 法建立砧木自根無性系，可以為研究和生產(chǎn)提供優(yōu)良砧木材料，為研 究砧木和接穗相互作用提供實驗系統(tǒng)，為選擇最優(yōu)的砧穗組合提供了 可能，為研究橡膠樹超高產(chǎn)的機理打下基礎(chǔ)。
本發(fā)明設(shè)計的愈傷組織誘導、繼代培養(yǎng)、體細胞胚誘導和分化出 苗培養(yǎng)基和添加物及培養(yǎng)條件，適合于橡膠樹品種用本發(fā)明方法培養(yǎng) 出再生植株。
本發(fā)明工藝流程簡單，成本低，體細胞胚誘導率高，再生植株健 壯，具有很好的應用前景。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 實施例l
預先按要求配制好各種培養(yǎng)基。選取長勢較好，且來源于性狀優(yōu)
良的橡膠樹品種(如橡膠樹無性系熱研87-6-62),經(jīng)過橡膠樹花藥培 養(yǎng)胚狀體發(fā)生途徑得到的試管苗的幼根，直徑為lmm，在無菌條件 下切成長度為1.2cm的根段。
把根段接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)25天，培養(yǎng)溫度為 26±rC,以誘導出愈傷組織。所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基為改良的MS 培養(yǎng)基，將MS培養(yǎng)基中的無水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、 七水硫酸鎂的含量調(diào)整為無水氯化鉤250mg/L、磷酸二氫鉀400mg/L、 四水硫酸錳35mg/L、七水硫酸鎂500mg/L,并添加2，4-D 4mg/L、 KT 2.5mg/L、 6-BA3mg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖70g/L、椰子水50ml/L。
把誘導出的鮮黃色愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫 度為26士rC，暗培養(yǎng)15 30天，鮮黃色胚性愈傷組織進一步增殖。 所述繼代培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，添加2，4-D 2.5mg/L、KT 2mg/L、 NAA2mg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖70g/L、椰子水50ml/L。再把經(jīng)過繼代培養(yǎng)誘導出的鮮黃色胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到體細胞
胚誘導培養(yǎng)基上，進行暗培養(yǎng)30天，培養(yǎng)溫度為26士rc,以誘導出
體細胞胚。體細胞胚在體細胞胚誘導培養(yǎng)基上可以進一步發(fā)育，生長
為成熟的體細胞胚。體細胞胚誘導培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，添加 6-BA lmg/L、 KT 1.5mg/L、 NAA 0.5mg/L、 GA3 0.5mg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖70g/L、活性碳lg/L、椰子水50ml/L。
最后將成熟子葉型體細胞胚轉(zhuǎn)移到出苗培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，培 養(yǎng)溫度為26±1°C,以促其萌發(fā)，長成完整植株。成熟的子葉型體細 胞胚轉(zhuǎn)入出苗培養(yǎng)基后，20天后開始陸續(xù)萌發(fā)，形成的再生小植株 健壯、主根發(fā)達。出苗培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，添加KT1.5mg/L、 NAA 0.5mg/L、 GA3 0.5mg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖70g/L、活性碳lg/L、 椰子水50ml/L。
雖然，上文中已經(jīng)用 一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳 盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本 領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ) 上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1. 一種橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發(fā)生植株再生方法，其特征在于，包括如下步驟1)根處理選取橡膠樹花藥培養(yǎng)經(jīng)過胚狀體發(fā)生途徑得到的試管苗的幼根，直徑為0.8～1.2mm，切成長度為1.0～1.5cm的根段；2)胚性愈傷組織的誘導和繼代培養(yǎng)把根段接種于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)25～40天，誘導出胚性愈傷組織；再轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)15～30天，培養(yǎng)溫度為25～28℃；3)體細胞胚的誘導將繼代培養(yǎng)后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到體細胞胚誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25～28℃，暗培養(yǎng)20～50天，誘導出體細胞胚；4)植株再生再將成熟體細胞胚轉(zhuǎn)移到出苗培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～28℃，培養(yǎng)20～50天，長成完整植株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發(fā)生植株 再生方法，其特征在于，所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基為改良的MS 培養(yǎng)基，將MS培養(yǎng)基中的無水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、 七水硫酸鎂的含量調(diào)整為無水氯化鉤150 ~ 400mg/L、磷酸二氫鉀 350~ 500mg/L、四水硫酸錳15 ~ 40mg/L、七水硫酸鎂400 ~ 600mg/L， 并添加2，4-D 1 ~ 5mg/L、 KT 1 ~ 5mg/L、 6-BA0.5 ~ 5.0mg/L、 Phytagel 2~3g/L、蔗糖50 90g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發(fā)生植株 再生的方法，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，添 加2，4-D 1 ~ 3mg/L、 KT 1 一 3mg/L、 NAA 1 ~ 3mg/L、 Phytagel 2 3g/L、 蔗糖50 90g/L、椰子水40 90ml/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發(fā)生再生 植株的方法，其特征在于，所述體細胞胚誘導培養(yǎng)基為改良的MS培 養(yǎng)基中添加6-BA 0.5 ~ 2.0mg/L、 KT 0.5 ~ 3.0mg/L、 NAA 0.1 ~/L、 GA3 0.1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2 ~ 3g/L、蔗糖50 90g/L、活 性碳l ~ 2g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發(fā)生植 株再生方法，其特征在于，所述出苗培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基中添 加KT 0.5 ~ 4.0mg/L、 NAAO.l ~ 1.0mg/L、 GA3 0,1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2 ~ 3g/L、蔗糖50 ~ 90g/L、活性碳1 ~ 2g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發(fā)生植株再生方法，主要包括選擇橡膠樹試管苗無菌幼根，直徑為0.8～1.2mm，切成長度為1.0～1.5cm的根段，在胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基暗培養(yǎng)25～40天；再轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)15～30天；然后轉(zhuǎn)移到體細胞胚誘導培養(yǎng)基暗培養(yǎng)20～50天；最后轉(zhuǎn)移到出苗培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)，培養(yǎng)20～50天，培養(yǎng)溫度為25～28℃，長成完整植株。本發(fā)明所提供的橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發(fā)生植株再生方法，工藝流程簡單，可以取用優(yōu)良橡膠樹品種的樹根為外植體，經(jīng)體細胞胚發(fā)生途徑誘導再生植株，建立優(yōu)良砧木離體培養(yǎng)無性繁殖體系。
文檔編號C12N5/04GK101411306SQ20081022600
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月3日
發(fā)明者波 于, 周權(quán)男, 孫愛花, 哲 李, 林位夫, 汪秀華, 黃華孫, 黃天帶 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所