一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，其特征在于，該愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為S培養(yǎng)基+2,4?D 1mg·L?1+6?BA2mg·L?1+KT 4mg·L?1，該培養(yǎng)基含34g·L?1蔗糖，8g·L?1瓊脂，0.5g·L?1水解酪蛋白，pH為5.8。本發(fā)明還涉及一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織的誘導(dǎo)方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在：誘導(dǎo)率達(dá)80％以上，此方法可為建立穩(wěn)定的青海云杉體細(xì)胞胚發(fā)生體系奠定基礎(chǔ)，對(duì)相關(guān)科研、技術(shù)人員具有一定的參考作用。
【專利說明】
一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及松科云杉屬植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究領(lǐng)域，具體涉及一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織的培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]松杉類針葉植物是林業(yè)生產(chǎn)和造林實(shí)踐的重要樹種，但是采用常規(guī)無性繁殖技術(shù)難以生根，致使其優(yōu)良基因型的利用受到制約。于是，人們嘗試通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)實(shí)現(xiàn)針葉樹的快速繁育。1985年，Hakman等首次報(bào)道采用歐洲云杉(Picea abies)的未成熟合子胚成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚形成并獲得再生植株。此后，針葉樹體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)、成熟和植株再生過程的研究取得了很大進(jìn)展，國(guó)際上普遍認(rèn)為體細(xì)胞胚胎發(fā)生是針葉樹良種基因型規(guī)模化擴(kuò)繁的最佳途徑。
[0003]青海云杉(P.crassifolia)是我國(guó)青藏高原東北邊緣特有樹種，屬云杉屬常綠針葉喬木。主要分布于祁連山區(qū)、青海(都蘭以東、西傾山以北)、甘肅(河西走廊及靖遠(yuǎn)、榆中、夏河、卓尼、舟曲)、寧夏(賀蘭山、六盤山)、內(nèi)蒙古大青山海拔1600-3800米的地帶。其材質(zhì)優(yōu)良、抗旱性較強(qiáng)，為青海東部、甘肅北部山區(qū)和祁連山區(qū)的優(yōu)良造林樹種，也是該地區(qū)森林演替的頂極群落和地帶性植被的建群種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種采用青海云杉成熟合子胚誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基及方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下技術(shù)方案:
[0006]—種青海云杉成熟合子胚愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，該愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為S培養(yǎng)基+2，4-D Img.L-W-BA 2mg.L^+KT 4mg.L—S 該培養(yǎng)基含34g.L-1 蔗糖，8g.L—1 瓊月旨，0.5g.L—1水解酪蛋白，pH為5.8 ο
[0007]本發(fā)明的再一目的是公開一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織的誘導(dǎo)方法，包括如下步驟:
[0008](I)培養(yǎng)基配制:按S培養(yǎng)基配方配置基本培養(yǎng)基，然后添加Img.L—1的2，4-D、2mg.L—1的6-BA、4mg.L—1的KT和0.5g.L—1的水解酪蛋白，以及34g.L—1蔗糖和8g.L—1瓊脂，pH為5.8，分裝滅菌后備用。
[0009](2)外植體消毒:將青海云杉種子于水中浸泡10_15h后，用鑷子剝?nèi)シN皮;然后，用75 %酒精對(duì)去皮的種子進(jìn)行表面消毒;再用0.1 ^HgCl2對(duì)種子深度滅菌，然后用無菌水沖洗;最后，在無菌條件下，用無菌濾紙吸干種子表面水分。
[0010](3)種胚分離:在無菌條件下，用消過毒的尖頭鑷子夾掉種子胚根段的尖端部分，然后用鑷子壓種子中部得到種胚；
[0011](4)接種和培養(yǎng):在無菌條件下，將種胚平行接種于培養(yǎng)基的表面，置于25°C條件下暗培養(yǎng)；
[0012](5)愈傷組織的增殖:愈傷組織形成后，將之轉(zhuǎn)接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。
[0013]作為一種進(jìn)一步的改進(jìn)方案，所述步驟(2)中，將青海云杉種子于水中浸泡12h。
[0014]作為一種進(jìn)一步的改進(jìn)方案，所述步驟(2)中，用酒精對(duì)去皮的種子進(jìn)行表面消毒的時(shí)間為5min。
[0015]作為一種進(jìn)一步的改進(jìn)方案，所述步驟(2)中，用無菌水沖洗5次，每次5min。
[0016]本發(fā)明公開的一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織的培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法，具有以下有益效果:
[0017]本發(fā)明的誘導(dǎo)率達(dá)80%以上，此方法可為建立穩(wěn)定的青海云杉體細(xì)胞胚發(fā)生體系奠定基礎(chǔ)，對(duì)相關(guān)科研、技術(shù)人員具有一定的參考作用。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0019]實(shí)施例1
[0020]一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，該愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為S培養(yǎng)基+2，4-D 8mg.L^+6-BA 0.5mg.L^+KT 2mg.L—1，該培養(yǎng)基含34g.L—1 蔗糖，8g.L—1 瓊月旨，0.5g.L—1水解酪蛋白，pH為5.8。該培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率平均為44.4%。
[0021]實(shí)施例2
[0022]一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，該愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為S培養(yǎng)基+2，4-D 4mg.L_1+6-BA 4mg.L_1+KT 0.5mg.L—1，該培養(yǎng)基含34g..L—1 瓊月旨，0.5g.L—1水解酪蛋白，pH為5.8。該培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率平均為51.5%。
[0023]實(shí)施例3
[0024]一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，該愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為S培養(yǎng)基+2，4-D Img.L^+6-BA 2mg.L^+KT 4mg.L—S 該培養(yǎng)基含34g.L—1 蔗糖，8g.L—1 瓊月旨，0.5g.L—1水解酪蛋白，pH為5.8。該培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率平均為80.1%。
[0025]一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織的誘導(dǎo)方法，包括如下步驟:
[0026](I)培養(yǎng)基配制:按S培養(yǎng)基配方配置基本培養(yǎng)基，然后添加Img.L—1的2，4_D、2mg.L—1的6-BA、4mg.L—1的KT和0.5g.L—1的水解酪蛋白，以及34g.L—1蔗糖和8g.L—1瓊脂，pH為5.8，分裝滅菌后備用。
[0027](2)外植體消毒:將青海云杉種子于水中浸泡10_15h后(優(yōu)選12h)，用鑷子剝?nèi)シN皮;然后，用75%酒精對(duì)去皮的種子進(jìn)行表面消毒5min;再用0.1 ^HgCl2對(duì)種子深度滅菌，然后用無菌水沖洗5次，每次5min;最后，在無菌條件下，用無菌濾紙吸干種子表面水分。
[0028](3)種胚分離:在無菌條件下，用消過毒的尖頭鑷子夾掉種子胚根段的尖端部分，然后用鑷子壓種子中部得到種胚；
[0029](4)接種和培養(yǎng):在無菌條件下，將種胚平行接種于培養(yǎng)基的表面，置于25°C條件下暗培養(yǎng)；
[0030](5)愈傷組織的增殖:愈傷組織形成后，將之轉(zhuǎn)接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。
[0031]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，而非對(duì)其限制;應(yīng)當(dāng)指出，盡管參照上述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，其依然可以對(duì)上述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或?qū)ζ渲胁糠只蛘呷考夹g(shù)特征進(jìn)行等同替換;而這些修改和替換，并不使相應(yīng)的技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，其特征在于，該愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為S培養(yǎng)基+2，4-D Img.L^+6-BA 2mg.L^+KT 4mg.L—S 該培養(yǎng)基含34g.L—1 蔗糖，8g.L-1瓊脂，0.5g.L—1水解酪蛋白，pH為5.8。2.—種青海云杉成熟合子胚愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)培養(yǎng)基配制:按S培養(yǎng)基配方配置基本培養(yǎng)基，然后添加Img.L—1的2，4-D、2mg.L—1的6-BA、4mg.L—1的KT和0.5g.L—1的水解酪蛋白，以及34g.L—1蔗糖和8g.L—1瓊脂，pH為5.8，分裝滅菌后備用。 (2)外植體消毒:將青海云杉種子于水中浸泡10-15h后，用鑷子剝?nèi)シN皮;然后，用75%酒精對(duì)去皮的種子進(jìn)行表面消毒;再用0.1^HgCl2對(duì)種子深度滅菌，然后用無菌水沖洗;最后，在無菌條件下，用無菌濾紙吸干種子表面水分。 (3)種胚分離:在無菌條件下，用消過毒的尖頭鑷子夾掉種子胚根段的尖端部分，然后用鑷子壓種子中部得到種胚； (4)接種和培養(yǎng):在無菌條件下，將種胚平行接種于培養(yǎng)基的表面，置于25°C條件下暗培養(yǎng)； (5)愈傷組織的增殖:愈傷組織形成后，將之轉(zhuǎn)接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟(2)中，將青海云杉種子于水中浸泡12h。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟(2)中，用酒精對(duì)去皮的種子進(jìn)行表面消毒的時(shí)間為5min。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種青海云杉成熟合子胚愈傷組織的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述步驟(2)中，用無菌水沖洗5次，每次5min。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK105850731SQ201610212622
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月7日
【發(fā)明人】張瑩花, 徐先英, 賀訪印, 王方琳
【申請(qǐng)人】甘肅省治沙研究所