一種大葉藻體細胞胚的誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明所屬植物組織培養(yǎng)研究領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種大葉藻體細胞胚的誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大葉藻iZostera marina L.)是北半球溫帶海域分布最為廣泛的海草，也是我國北方沿海(山東、河北和遼寧)海草場的優(yōu)勢種，具有極其重要的生態(tài)服務(wù)功能和經(jīng)濟價值。但近百年來全球大葉藻海草場生態(tài)系統(tǒng)遭到了嚴重的破壞，面積急劇縮小，在我國更甚，因此，近年來大葉藻海草場的修復(fù)已成為了我國北方海洋生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)中不可或缺的一項內(nèi)容，其草場修復(fù)中需要大量的種苗，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)在室內(nèi)培養(yǎng)出無菌苗是緩解目前大葉藻修復(fù)移栽中種苗短缺的一個有效方法。
[0003]盡管植物組織培養(yǎng)技術(shù)在許多植物的無菌苗再生和快速繁殖研究領(lǐng)域已成為不再是難題，但在植物組織培養(yǎng)中仍有一條培養(yǎng)難易的基本規(guī)律:陸生植物易于水生植物、雙子葉植物易于單子葉植物、淡水生植物易于海水生植物，而大葉藻等海草植物則屬于海洋生單子葉植物，因此，盡管有相關(guān)研究在不同海草中展開，但到目前為止，仍無突破性進展。
[0004]體細胞胚又名胚狀體，是植物組織培養(yǎng)中無菌苗再生的一個重要的中間環(huán)節(jié)，它的成功獲得可為無菌苗再生奠定重要的基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明通過大葉藻組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)其體細胞胚，目前采用該技術(shù)方案的相關(guān)專利和文獻未見報導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種大葉藻體細胞胚的誘導(dǎo)方法，采用花序為外植體，可有效地獲得體細胞胚，為大葉藻的快速繁殖和無菌組培苗再生提供重要的技術(shù)支撐。
[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
本發(fā)明的一種大葉藻體細胞胚的誘導(dǎo)方法，是以大葉藻的花序為誘導(dǎo)體細胞胚的外植體。
[0008]本發(fā)明的具體步驟如下:
(1)外植體的選取:以大葉藻花枝為外植體供體，取其健康幼嫩佛焰苞花序，經(jīng)表面除雜、清洗后在超凈工作臺內(nèi)進行消毒處理，剝?nèi)シ鹧姘ㄐ蛲獾陌~，得到無菌的花序；
(2)體細胞胚的誘導(dǎo)培養(yǎng):將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于培養(yǎng)基中，在15-25°C、黑暗或弱光條件下進行培養(yǎng)。約15-25d后可見到花序上組織萌動，產(chǎn)生小突起，逐漸發(fā)育為體細胞胚，期間不經(jīng)歷愈傷組織階段。體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以MS、N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加水解酪蛋白100-1000mg/L、蔗糖或葡萄糖30_120g/L、植物生長素(或生長素和細胞分裂素)、瓊脂5-7g/L、海鹽20-35 g/L,培養(yǎng)基pH=6_8。
[0009]本發(fā)明中，優(yōu)選培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖 60g/L、2，4-D 5 mg/L、瓊脂 5 g/L、海鹽 20 g/L，pH=7。
[0010]本發(fā)明中，優(yōu)選培養(yǎng)條件為16°C、暗培養(yǎng)。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點在于:大葉藻花期可持續(xù)3個月之久，因此外植體供體可獲取時間較長；以花序為外植體，表面消毒效果大大提升；體細胞胚誘導(dǎo)過程中不經(jīng)歷愈傷組織誘導(dǎo)和培養(yǎng)階段，不僅體細胞胚獲得時間較短，且有效避免了因愈傷組織不斷繼代培養(yǎng)過程中導(dǎo)致的細胞基因突變的風(fēng)險。本發(fā)明為大葉藻無菌組培菌再生提供了重要的技術(shù)支撐，也為海草組織培養(yǎng)的成功奠定了基礎(chǔ)。
[0012]
【具體實施方式】
[0013]以下通過【具體實施方式】對本發(fā)明進行一步說明，這里特別指出，下面的【具體實施方式】僅用來說明本發(fā)明，本發(fā)明還有其它多種植物激素、碳源、有機添加物、鹽度等成分組合的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員在理解本發(fā)明精神的前提下，可據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)和公知知識對本發(fā)明進行相應(yīng)變換，這些技術(shù)方案均落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0014]實施例1:一種大葉藻體細胞胚的誘導(dǎo)方法，其實施步驟包括:
(1)外植體的選取:以大葉藻花枝為外植體供體，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)，用10%的過氧化氫溶液浸泡15-20min，滅菌海水沖洗3次后，剝?nèi)シ鹧姘ㄐ蛲獾陌~，得到無菌的花序；
(2)體細胞胚的誘導(dǎo)培養(yǎng):將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在16°C、黑暗條件下和lOOOlux光照條件下進行培養(yǎng)，每半月轉(zhuǎn)接一次。17d后可見到花序上有小突起產(chǎn)生，約30 d后可見這些小突起發(fā)育為體細胞胚，期間不經(jīng)歷愈傷組織階段。體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH=7，并添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖60g/L、2，4-D 5 mg/L、瓊脂5 g/L、海鹽20 g/L。黑暗條件下體細胞胚誘導(dǎo)率為20.52%，光照條件下為18.84%。
[0015]實施例2:—種大葉藻體細胞胚的誘導(dǎo)方法，其實施步驟為:
(1)外植體的選取:以大葉藻花枝為外植體供體，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)，用10%的過氧化氫溶液浸泡15-20min，滅菌海水沖洗3次后，剝?nèi)シ鹧姘ㄐ蛲獾陌~，得到無菌的花序；
(2)體細胞胚的誘導(dǎo)培養(yǎng):將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在16-20°C、黑暗條件下進行培養(yǎng)，每半月轉(zhuǎn)接一次。20d后可見到花序上有小突起產(chǎn)生，約30 d后可見這些小突起發(fā)育為體細胞胚，期間不經(jīng)歷愈傷組織階段。體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH=7，并添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖120g/L、NAA 2mg/L、瓊脂5 g/L、海鹽20 g/L。體細胞胚誘導(dǎo)率為16.82%。
[0016]實施例3:—種大葉藻體細胞胚的誘導(dǎo)方法，其實施步驟為:
(1)外植體的選取:以大葉藻花枝為外植體供體，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)，用10%的過氧化氫溶液浸泡15-20min，滅菌海水沖洗3次后，剝?nèi)シ鹧姘ㄐ蛲獾陌~，得到無菌的花序；
(2)體細胞胚的誘導(dǎo)培養(yǎng):將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于培養(yǎng)基中，在16-20°C、黑暗條件下進行培養(yǎng)，每半月轉(zhuǎn)接一次。23d后可見到花序上有小突起產(chǎn)生，約34 d后可見這些小突起發(fā)育為體細胞胚，期間不經(jīng)歷愈傷組織階段。體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH=7,并添加水解酪蛋白100mg/L、蔗糖30g/L、IAA 10mg/L、瓊脂5 g/L、海鹽30 g/L。體細胞胚誘導(dǎo)率為9.36%。
[0017]實施例4:一種大葉藻體細胞胚的誘導(dǎo)方法，其實施步驟為:
(1)外植體的選取:以大葉藻花枝為外植體供體，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)，用15%的過氧化氫溶液浸泡15-20min，滅菌海水沖洗3次后，剝?nèi)シ鹧姘ㄐ蛲獾陌~，得到無菌的花序；
(2)體細胞胚的誘導(dǎo)培養(yǎng):將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于培養(yǎng)基中，在16-20°C、黑暗條件下進行培養(yǎng)，每半月轉(zhuǎn)接一次。15d后可見到花序上有小突起產(chǎn)生，約
30d后可見這些小突起發(fā)育為體細胞胚，期間不經(jīng)歷愈傷組織階段。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH=7，并添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖30g/L、噻苯隆0.2 mg/L、瓊脂5 g/L、海鹽20 g/L。體細胞胚誘導(dǎo)率為20.34%。
[0018]實施例5:—種大葉藻體細胞胚的誘導(dǎo)方法，其實施步驟為:
(1)外植體的選取:以大葉藻花枝為外植體供體，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)，用15%的過氧化氫溶液浸泡15min，滅菌海水沖洗3次后，剝?nèi)シ鹧姘ㄐ蛲獾陌~，得到無菌的花序；
(2)體細胞胚的誘導(dǎo)培養(yǎng):將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于培養(yǎng)基中，在16-20°C、黑暗條件下進行培養(yǎng)，每半月轉(zhuǎn)接一次。21d后可見到花序上有小突起產(chǎn)生，約40 d后可見這些小突起發(fā)育為體細胞胚，期間不經(jīng)歷愈傷組織階段。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH=7，并添加水解酪蛋白1000 mg/L、蔗糖30/L、2，4-D 5mg/L、6_BA 0.5mg/L、瓊脂5 g/L、海鹽20 g/L。體細胞胚誘導(dǎo)率為13.15%。
[0019]實施例6:—種大葉藻體細胞胚的誘導(dǎo)方法，其實施步驟為:
(1)外植體的選取:以大葉藻花枝為外植體供體，以大葉藻花枝為外植體供體，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)，用15%的過氧化氫溶液浸泡15min，滅菌海水沖洗3次后，剝?nèi)シ鹧姘ㄐ蛲獾陌~，得到無菌的花序；
(2)體細胞胚的誘導(dǎo)培養(yǎng):將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于培養(yǎng)基中，在22°C、黑暗條件下進行培養(yǎng)，每半月轉(zhuǎn)接一次。19d后可見到花序上有小突起產(chǎn)生，約25d后可見這些小突起發(fā)育為體細胞胚，期間不經(jīng)歷愈傷組織階段。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH=7，并添加水解酪蛋白1000 mg/L、葡萄糖120/L、2，4-D 5mg/L、6_BA
0.5 mg/L、瓊脂5 g/L、海鹽20 g/L。體細胞胚誘導(dǎo)率為10.33%。
【主權(quán)項】
1.一種大葉藻體細胞胚的培養(yǎng)方法，其特征在于，是以大葉藻的花序誘導(dǎo)體細胞胚的外植體。2.如權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，步驟如下: 1)外植體的選取:以大葉藻花枝為外植體供體，取其健康幼嫩佛焰苞花序，經(jīng)表面除雜、清洗后在超凈工作臺內(nèi)進行消毒處理，剝?nèi)シ鹧姘ㄐ蛲獾陌~，得到無菌的花序； 2)體細胞胚的誘導(dǎo)培養(yǎng):將無菌花序切成3-5mm長的外植體片段，接種于培養(yǎng)基中，在15-25°C、黑暗或弱光條件下進行培養(yǎng)；約15-25d后可見到花序上組織萌動，產(chǎn)生小突起，逐漸發(fā)育為體細胞胚，期間不經(jīng)歷愈傷組織階段；胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以MS、N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加水解酪蛋白100-1000mg/L、蔗糖或葡萄糖30_120g/L、植物生長素(或生長素和細胞分裂素)、瓊脂5 g/L、海鹽20-35 g/L，培養(yǎng)基pH=6-8。3.如權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于，優(yōu)選培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖60g/L、2，4-D 5 mg/L、瓊脂5 g/L、海鹽20 g/L,pH=7。4.如權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于，優(yōu)選培養(yǎng)條件為16°C下暗培養(yǎng)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種大葉藻體細胞胚的誘導(dǎo)方法，是以大葉藻的佛焰苞花序為外植體，將經(jīng)表面消毒處理的花序切為3-5mm長的片段，接種到體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在15-25℃、黑暗或弱光照條件進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每半月轉(zhuǎn)接一次，培養(yǎng)15-25d以后可見到花序上組織萌動，產(chǎn)生小突起，逐漸發(fā)育為體細胞胚，期間不經(jīng)歷愈傷組織階段。體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS、N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、并添加有機添加物、碳源、植物激素（生長素、或生長素與細胞分裂素）和海鹽的固體培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法可不經(jīng)歷愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，在短時間內(nèi)從花序組織上直接誘導(dǎo)出大葉藻體細胞胚，為大葉藻無菌組培苗再生和組培快速繁殖體系的建立提供了重要的技術(shù)支撐，也為海草組織培養(yǎng)的成功奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105393912
【申請?zhí)枴緾N201410462339
【發(fā)明人】鄭鳳英, 劉雪芹, 金艷梅, 張偉, 韓曉弟, 李樂樂
【申請人】山東大學(xué)（威海）
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2014年9月12日