一種基于初次卵裂時間和囊胚基因表達水平篩選檢測山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于初次卵裂時間和囊胚基因表達 水平篩選檢測山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 克?。w細胞核移植）技術(shù)能將體細胞在體外去分化，發(fā)育成具有全能性的胚胎， 這在臨床上有巨大的應用前景。然而，SCNT技術(shù)過程復雜、影響因素多，通過SCNT技術(shù)獲 得出生個體的效率也非常低，嚴重制約轉(zhuǎn)基因大家畜的研究與應用。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏有效的 胚胎評估體系，不能篩選出優(yōu)質(zhì)的移植胚胎是影響SCNT效率低下的主要原因之一。因此， 尋找一種更為客觀、全面的評估胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能的方法，篩選優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植至關(guān) 重要。
[0003]當前胚胎的評估手段主要是直觀的形態(tài)學觀察，依據(jù)胚胎卵裂球數(shù)目、碎片程度 及均等性可以評估胚胎質(zhì)量。雖然形態(tài)學方法無創(chuàng)、方便、快速，但缺乏統(tǒng)一標準，并且不能 準確反映胚胎的功能狀態(tài)，觀察者間的主觀性使卵子與胚胎發(fā)育的關(guān)聯(lián)顯示出差異性。另 外，形態(tài)正常的胚胎也可能存在遺傳或表觀遺傳缺陷。前期有研究表明：胚胎培養(yǎng)過程中， 早期卵裂胚胎相對于晚期卵裂的胚胎更容易發(fā)育到囊胚階段。Edward等研究發(fā)現(xiàn)受精卵卵 裂時間與懷孕率有關(guān)，Van Montfoort等發(fā)現(xiàn)，早卵裂胚胎的懷孕率（46% )高于晚卵裂胚 胎（18% )，早卵裂胚胎組的流產(chǎn)率（20% )低于晚卵裂胚胎的流產(chǎn)率（48% )。此外，牛的 早期卵裂胚胎發(fā)育到囊胚的幾率明顯高于晚期卵裂胚胎，并且囊胚細胞數(shù)較多，細胞凋亡 數(shù)較低的比例。研究表明，初次卵裂時間可以作為豬克隆胚胎發(fā)育潛能的重要標識，選擇早 裂的胚胎進行移植，有助于提高克隆效率。山羊作為重要的家畜，不僅可以為市場提供豐富 的肉、毛、絨、皮和乳等畜產(chǎn)品，而且具有重要的科研價值。然而，關(guān)于山羊克隆胚胎卵裂時 間和發(fā)育潛能的研究較少，因此，本試驗初步探索不同初次卵裂時間對后續(xù)山羊克隆胚胎 發(fā)育能力的影響。
[0004]盡管胚胎的初次卵裂時間是衡量胚胎質(zhì)量和后續(xù)發(fā)育能力的重要指標之一，然而 具體的內(nèi)在基因變化尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)早期卵裂胚胎多數(shù)來自于胞漿和核同步性較好的 優(yōu)質(zhì)卵母細胞，較好的代謝儲備，使得它們能較早的有絲分裂。有研究認為，排出第一極體 時間較早的卵母細胞，孤雌激活后發(fā)育到囊胚的比例高，進一步說明初次卵裂時間不僅與 胚胎后期發(fā)育潛能有關(guān)而且與卵母細胞質(zhì)量有很大關(guān)系。以上結(jié)論驗證了初次卵裂是由積 累的母源胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄物來調(diào)控的觀點。然而，在受精后胚胎基因組會發(fā)生激活，進而引發(fā) 了胚胎核內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活，胚胎后續(xù)的發(fā)育便開始依賴于新合成的mRNA和蛋白質(zhì)。此外，在胚 胎重構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)，卵母細胞質(zhì)量會影響重構(gòu)胚的后續(xù)發(fā)育能力，優(yōu)化卵母細胞體外成 熟的條件能夠提高所構(gòu)建的重構(gòu)胚胎的質(zhì)量。優(yōu)化卵母細胞體外成熟的條件以及篩選檢測 山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因的方法為現(xiàn)有技術(shù)亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高山羊卵母細胞的成熟率的方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于初次卵裂時間和囊胚基因表達水平篩選檢 測山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] -種提高山羊卵母細胞的成熟率的方法，處理卵巢組織并挑選卵母細胞，在體外 成熟培養(yǎng)液中進行體外成熟培養(yǎng)18~30h，所述的體外成熟培養(yǎng)液中添加有1~10 yg/mL 的促卵泡素FSH和1~10 yg/mL促黃體生成素LH。
[0009] 作為一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述體外成熟培養(yǎng)液中添加有10 y g/mL的FSH和10 y g/ mL LH〇
[0010] 所述的體外成熟培養(yǎng)液中還添加有1 yg/mL17 -E2。
[0011] 進一步優(yōu)選的，所述體外成熟培養(yǎng)液的配方為：
[0012] 1 ~10 y g/mL FSH+1 ~10 y g/mL LH+1 y g/mL 17 0 -E2+10 % 胎牛血清的 TCM 199 ；
[0013]最優(yōu)選為：10 y g/mL FSH+10 y g/mL LH+1 y g/mL 17 0 -E2+10 % 胎牛血清的 TCM199 ；
[0014] 進一步優(yōu)選的，所述體外成熟培養(yǎng)的時間為24h。
[0015] 所述卵巢組織的處理方法為切剖法或抽吸法。
[0016] -種基于初次卵裂時間和囊胚基因表達水平篩選檢測山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān) 基因的方法，包括以下步驟：
[0017] (1)采用供體細胞和來源于山羊卵巢組織的卵母細胞構(gòu)建重組胚并激活后卵裂、 發(fā)育至囊胚，并于第24h和48h檢查卵裂率，收集0~24h和24~48h內(nèi)卵裂的胚胎分別 作為早卵裂胚胎組和晚卵裂胚胎組繼續(xù)培養(yǎng)；第7. 5d收集各組囊胚；所述的卵母細胞為采 用上述的方法進行體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞；
[0018] (2)提取步驟⑴中所收集的兩組囊胚的RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;
[0019] (3)以步驟⑵合成的cDNA為模板以下序列為引物進行熒光定量PCR擴增目的基 因GAPDH、PGC-1 a、NRF-1、BCL2和BAX :
[0020] 擴增GAPDH引物對：F:CGACTTCAACAGCGACACTCAC
[0021] R:CCCTGTTGCTGTAGCCGAATTC
[0022] 擴增 PGC-1 a 引物對：F: CACCCACAACTCCTCCTCAT
[0023] R:CCTTCCTTTCCTCGTGTC
[0024]擴增NRF-1引物對：F:AGGCTGGGGCAAAGAAAG
[0025] R:CCAACCTGGATAAGCGAGAC
[0026]擴增BCL2引物對：F:ATGTGTGTGGAGAGCGTCA
[0027] R:AGAGACAGCCAGGAGAAATC
[0028]擴增BAX引物對：F:GCATCCACCAAGAAGCTGAG
[0029]R:CCGCCACTCGGAAAAAGAC;
[0030](4)用SPSS 18. 0軟件中的單因素方差分析兩組實驗結(jié)果的差異顯著性，兩組實 驗結(jié)果中差異顯著的目的基因即為評估山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因。
[0031] 步驟⑷所述的評估山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因為線粒體相關(guān)基因PGC-1 a和 NRF-l〇
[0032] 步驟⑵中提取所述RNA的過程為：將胚胎轉(zhuǎn)移至收集管內(nèi)，向管內(nèi)加入裂解液， 并向裂解液中添加carrier RNA，渦旋后加入70%的酒精，充分混勻，將混合液轉(zhuǎn)移到收集 管和柱子上，離心棄液體，再加入Buffer RW1，離心棄液體；加入DNase I工作液到柱子膜 上，靜置10~20min，加入Buffer RW1，離心后丟棄液體和收集管，加入Buffer RPE，離心棄 液體；然后加入80 %酒精，離心棄液體和收集管后，把柱子放在新的收集管上，打開蓋子全 速離心5min，將柱子放在新的收集管上，垂直加入RNase-free水到柱子膜上，全速離心獲 取 RNA〇
[0033] 研究發(fā)現(xiàn)在胚胎重構(gòu)中，卵母細胞質(zhì)量會影響重構(gòu)胚的后續(xù)發(fā)育能力，因此，本發(fā) 明首先通過比較卵母細胞不同采集方法、培養(yǎng)液成分及體外培養(yǎng)時間等，優(yōu)化了卵母細胞 體外成熟的條件，然后進一步構(gòu)建重構(gòu)胚胎，探討不同初次卵裂時間的山羊克隆胚胎發(fā)育 至囊胚的潛能及基因的表達水平變化情況，嘗試從基因的角度探討山羊克隆胚胎初次卵裂 時間與其發(fā)育潛能的關(guān)系，為提高山羊克隆的效率提供理論參考。
[0034] 轉(zhuǎn)錄組學主要是從mRNA水平研究基因的轉(zhuǎn)錄表達，而mRNA的表達水平能反應細 胞的表型和功能。在胚胎發(fā)育過程中，線粒體不僅為胚胎發(fā)育提供能量，還能調(diào)節(jié)胚胎生存 的微環(huán)境，表明線粒體對胚胎的發(fā)育有重要作用，本試驗想進一步在胚胎水平上研究線粒 體相關(guān)基因與胚胎發(fā)育潛能是否存在相關(guān)性。
[0035] 綜上所述，本試驗結(jié)合胚胎的初次卵裂時間和卵裂時胚胎的狀態(tài)，試圖分析線粒 體相關(guān)基因PGC-1 a和NFR-1與胚胎發(fā)育潛能是否存在相關(guān)性，為尋找預測山羊轉(zhuǎn)基因克 隆胚胎發(fā)育潛能的研究提供了參考，也有助于篩選出優(yōu)質(zhì)的移植胚胎和提高轉(zhuǎn)基因克隆的 效率。
[0036] 本發(fā)明的有益效果：
[0037] 本發(fā)明優(yōu)化了卵母細胞體外成熟的條件，然后進一步構(gòu)建重構(gòu)胚胎，探討不同初 次卵裂時間的山羊克隆胚胎發(fā)育至囊胚的潛能及基因的表達水平變化情況，嘗試從基因的 角度探討山羊克隆胚