專利名稱：：一種基于熒光通用引物的多重定量rt-pcr基因表達(dá)譜分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及涉及生物技術(shù)基因表達(dá)分析領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法。
背景技術(shù)：
：隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和相關(guān)檢測儀器的發(fā)展，基因表達(dá)譜分析也迅速發(fā)展起來?；虮磉_(dá)譜分析在分析基因功能，確定轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，闡明信號傳導(dǎo)或代謝通路，研究表達(dá)水平多態(tài)性等方面中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，并為分子藥物、疾病診斷和治療領(lǐng)域提供了幫助。人類復(fù)雜性狀疾病的研究和相關(guān)基因的定位是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。糖尿病、癌癥、早老性癡呆和精神分裂癥等疾病的遺傳機(jī)理和相關(guān)效應(yīng)基因仍不為人知。通過全基因組轉(zhuǎn)錄圖譜來查找候選基因(candidategenes)是復(fù)雜性疾病研究的第一步，也對進(jìn)一步理解人類復(fù)雜性疾病和分子藥物的研發(fā)提供了幫助。轉(zhuǎn)錄圖譜也被用于癌癥診斷和療效比較等臨床分析中?；虮磉_(dá)譜可以用于腫瘤分類，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)大約30個基因的表達(dá)情況可用來預(yù)測腫瘤對化學(xué)治療藥劑的生物反應(yīng)狀況。全基因組表達(dá)芯片(Genome-widemicroarrays)能成功的從各種反應(yīng)條件下篩選出差異表達(dá)的基因，這些基因也被作為候選基因進(jìn)行假設(shè)驗證和功能分析。芯片技術(shù)的優(yōu)勢是通量大，一次實驗所能檢測的基因量很大，樣本量也較多，但同時也存在著明顯的劣勢就是芯片的定量準(zhǔn)確度較低，并且實驗成本很高，只能在經(jīng)濟(jì)實力雄厚的實驗室推廣?；虮磉_(dá)分析中最常用的技術(shù)就是實時逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(real-timeqPCR)，它具有Northernblots等技術(shù)所不具有的定量分析能力，因此被廣泛的用于基因表達(dá)定量分析中。Real-timeqPCR技術(shù)被證明具有穩(wěn)定性好、靈敏度高和7個數(shù)量級的定量線性等優(yōu)勢，但同時它也具有檢測通量小、樣本處理費(fèi)時費(fèi)力成本高等缺點(diǎn)。有研究表明人類細(xì)胞大約還含有3萬個基因，每個細(xì)胞平均有大約1萬個基因參加表達(dá)，而10到50個基因表達(dá)和一種特定的疾病相關(guān)，10到50個基因和一個特定的通路和藥物反應(yīng)相關(guān)?？紤]到多基因性狀(multigenictraits)受到基因-環(huán)境的相互作用影響，發(fā)現(xiàn)它們的生物學(xué)基礎(chǔ)需要在不同的環(huán)境條件下處理大量的樣本，需要針對對適量的基因在適量的個體或樣本中進(jìn)行分析，因此一種中通量的基因表達(dá)分析方法亟待開發(fā)。這種基因表達(dá)譜檢測平臺能解決基因表達(dá)中高通量與低成本的瓶頸，一種對于定量的、高通量的、經(jīng)濟(jì)的基因表達(dá)分析簡單最佳的多重解決方案。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種定量通量高(10-30個基因/反應(yīng))、成本低、樣本需要量低、檢測靈敏性高的多基因表達(dá)分析方法。本發(fā)明針對11個目的基因和3個看家基因設(shè)計了熒光通用引物和嵌合特異引物。通用引物的長度為20bp，上游通用引物5'端用Fam熒光標(biāo)記，通用引物對小鼠基因組特異。嵌合特異引物長度為38bp，3，端為特異引物序列段(18bp)，5，端為通用引物序列段(20bp)。設(shè)計的特異引物段要求理論退火溫度均為55t:，并且有相似的GC含量。擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在100400bp間，相鄰產(chǎn)物長度差為57bp。本發(fā)明的方法有兩種優(yōu)化方案1.單序列熒光通用引物方案；設(shè)計單序列熒光通用引物，使通用引物的上下游序列采用同一序列。這樣可以減少通用引物的引物二聚體對擴(kuò)增反應(yīng)影響，提高通用引物的擴(kuò)增效率。2丄游嵌合特異引物降落式(Touchdown)PCR結(jié)合熒光通用引物補(bǔ)加方案。在PCR反應(yīng)過程前期加入一個上游嵌合特異引物的降落式(Touchdown)PCR過程，使各個目的基因的上游嵌合特異引物能最佳退火，同時通用引物的補(bǔ)加也能克服擴(kuò)增反應(yīng)初期的通用引物二聚體影響，提高了反應(yīng)效率。本發(fā)明提供的基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法，其特征在于包括下列步驟(1)通用引物及上下游嵌合特異引物的引物序列設(shè)計通用引物的長度為20bp，上游通用引物5'端用Fam熒光標(biāo)記，通用引物對小鼠基因組無非特異性匹配。針對11個目的基因和3個看家基因設(shè)計嵌合特異引物長度為38bp，3'端為特異引物序列段(18bp)，5，端為通用引物序列段(20bp)(2)多重RT-PCR反應(yīng)過程a逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)階段，利用下游嵌合特異引物(chimericreverseprimer，3，端為一段基因特異序列，5'端為一段通用引物序列)逆轉(zhuǎn)錄合成目的基因的cDNA第一鏈；bPCR反應(yīng)過程，前3個循環(huán)，上游嵌合特異引物將通用引物序列加到目的基因DNA片段的兩端；PCR反應(yīng)的余下循環(huán)，高濃度的熒光通用引物取代上游嵌合特異引物完成整個PCR反應(yīng)過程；c根據(jù)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物長度的不同，用ABI377測序儀凝膠電泳予以分析檢測。步驟1中所述的通用引物設(shè)計上采用上下游同一序列作為通用引物序列。步驟2中所述的PCR反應(yīng)過程，前期加入一個上游嵌合特異引物的降落式(Touchdown)PCR過程，為11個循環(huán)。本發(fā)明結(jié)合了終點(diǎn)PCR法(end-pointPCR)和熒光檢測法(fluorescentdetection),將多對嵌合特異引物的PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粚νㄓ靡锏腜CR反應(yīng)大大降低了PCR反應(yīng)的復(fù)雜性，并且所有待擴(kuò)目的基因片段也在一對通用引物的作用下被等效率擴(kuò)增、比例的放大，從而實現(xiàn)多重定量檢測。本發(fā)明適用于10-30個基因/反應(yīng)的研究特定藥物代謝途徑或信號傳導(dǎo)通路等特定候選基因表達(dá)分析，是一種對于定量的、高通量的、經(jīng)濟(jì)的基因表達(dá)分析簡單最佳的多重解決方案。圖l為本發(fā)明的原理示意圖，圖中以一個目的基因模板表示(A)為利用下游嵌合特異引物的逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；(B)為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成的目的基因cDNA單鏈；(C)為PCR反應(yīng)的前三個循環(huán)，由上游嵌合特異引物引導(dǎo)，將通用引物序列加到cDNA模板兩端；(D)為PCR反應(yīng)余下循環(huán)，由通用熒光引物取代嵌合引物完成擴(kuò)增；(E)為熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物通過ABIPrism377型核酸分析儀予以分析檢測。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例11.通用引物及上下游嵌合特異引物的引物序列設(shè)計試驗步驟(l)通用引物的設(shè)計根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的水稻序列信息，設(shè)計了兩條20bp長的序列作為通用引物。設(shè)計原則是保證該引物在小鼠基因組上進(jìn)行PCR反應(yīng)無產(chǎn)物條帶，避免通用引物帶來非特異產(chǎn)物。通用引物的理論退火溫度控制在55°C。上游通用引物5'端用Fam熒光標(biāo)記。通用引物序列為Fam-cgggctacgctatctacgac(上游)與cgggcagtaagtaccgttgt(下游)。(2)上下游嵌合特異引物的設(shè)計根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫的11個小鼠目的基因和3個看家基因的cDNA序列信息，設(shè)計了14對18bp長的序列作為嵌合特異引物3，端的特異引物序列段。設(shè)計的特異引物段要求理論退火溫度均為55。C，并且有相似的GC含量，設(shè)計完后在5'端加上通用弓I物序列。擴(kuò)增產(chǎn)物的長度控制在100400bp間，相鄰產(chǎn)物長度差為57bp。目的基因和看家基因的嵌合特異引物的序列為:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(3)所有引物盡量選擇在mRNA特異的序列上設(shè)計，并經(jīng)Blast和Oligomaster軟件分析減少非特異擴(kuò)增和引物二聚體對反應(yīng)的影響。2.樣本RNA的制備試驗步驟(1)總RNA抽提采用TRIzol法。微量分光光度儀(U-008OD,HITACHI)控制抽提RNA的OD26固o在1.7~2.0間，濃度調(diào)整到1嗎/pL。(2)用DNaseI(Invitrogen)消化TRIzol抽提的總RNA中混有的少量DNA污染。DNaseI消化反應(yīng)體系為RNA1^L、10xReactionBuffer1|_iL、DNaseI(1U/pL)1pL，補(bǔ)水至10pL。反應(yīng)過程為20°C15min，然后加1EDTA(25mM)，65°C10min使DnaseI失活。反應(yīng)后的RNA濃度是100ng;L。3.多重RT-PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測分析試驗步驟(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為5xReactionBuffer4pL、MgCl2(25mM)4.8pL、dNTPMix(2mM)ljxL、ImProm-IIReverseTranscriptase(Promega)lpL、下游嵌合引物(總濃度10pM)2pL、RNAtemplate(100ng/pL)2~3|iL，補(bǔ)水至20pL。反應(yīng)過程為25。C5min，42。C60min，70。C15min。(2)PCR反應(yīng)體系為PCRBuffer10xlpL、MgCl2(25mM)0.6pL、dNTPMix(2mM)1pL、5xQ-Solution2nL、DNAPolymerase(Qiagen)(5U/pL)0.1|jL、cDNAtemplate(1015ng/^iL)1pL、上游嵌合特異引物對(總濃度10pM)0.5pL、通用上下游引物對(10pM)0單，補(bǔ)水至10pL。反應(yīng)過程為95°C15min;94°C30s，55°C90s，72°C60s，35cycles;72°ClOmin。(3)各取PCR反應(yīng)產(chǎn)物1[iL、DNA分子標(biāo)準(zhǔn)1pL、3x上樣緩沖液1混勻。上述混合物經(jīng)95。C變性3min，迅速置于冰浴2min，立即上377測序儀(AppliedBiosystemsInc.)檢測，電泳條件為電壓3KV，電泳時間2.5h。電泳結(jié)果經(jīng)GeneScan和GeneMapperID軟件分析獲得產(chǎn)物大小、峰高、峰面積等數(shù)據(jù)。產(chǎn)物大小由DNA分子標(biāo)準(zhǔn)得出，峰高用來預(yù)判目的基因的表達(dá)強(qiáng)度，峰面積(即PCR產(chǎn)物條帶熒光強(qiáng)度)用于計算目的基因的相對表達(dá)量，公式如下目的基因相對表達(dá)量=目的基因峰面積—看家基因峰面積的幾何平均數(shù)實施例22品系15天齡小鼠睪丸組織的性發(fā)育起始候選基因的表達(dá)分析——上游嵌合特異引9物降落式(Touchdown)PCR結(jié)合熒光通用引物補(bǔ)加優(yōu)化方法試驗步驟(1)解剖小鼠取睪丸組織，TRIzolReagent(Invitrogen)抽提組織的總RNA。用DNaseI消化TRIzol抽提的總RNA中混有的少量DNA污染。(2)下游特異引物逆轉(zhuǎn)錄合成目的基因的cDNA單鏈模板。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為5xReactionBuffer4pL、MgCI2(25mM)4.8pL、dNTPMix(2mM)lfJL、ImProm-IIReverseTranscriptase(Promega)lpL、下游嵌合引物(總濃度lOpM)2pL、RNAtemplate(100ng/^iL)2~3^L，補(bǔ)水至20pL。反應(yīng)過程為25。C5min，42。C60min，70。C15min。(3)上游嵌合特異引物降落式(Touchdown)PCR結(jié)合熒光通用引物補(bǔ)加擴(kuò)增。PCR反應(yīng)分為兩個階段進(jìn)行，第一個階段為前11個循環(huán)的TouchdownPCR循環(huán)，退火溫度為60°C~50°C，每一個循環(huán)退火溫度降低1°C。第二個階段為通用引物對補(bǔ)加后的30個循環(huán)的PCR擴(kuò)增，退火溫度為55。C。反應(yīng)體系為PCRBuffer1Ox1^1、MgCl2(25mM)0.6pl、dNTPMix(2mM)lpl、5xQ-Solution2^il、DNAPolymerase(5units4tl)0.1^1、cDNA模板(10~15ng4d)l|al、上游嵌合特異引物對(總濃度10pM)0.5^1、通用上下游引物對(10pM)0.5^1，補(bǔ)水至10^1。反應(yīng)過程為95。C15min;94°C30s，退火90s，72°C60s，35cycles;72。C10min。(4)ABI377測序儀檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物。上樣樣本體系為PCR反應(yīng)產(chǎn)物1^1(視濃度大小可稀釋)、DNA分子標(biāo)準(zhǔn)(Rox熒光標(biāo)記，分子片段大小為79bp、105bp、131bp、151bp、201bp、254bp、306bp)1^1、3x藍(lán)色葡聚糖上樣緩沖液1^1。配完上樣體系經(jīng)變性后(95°C3min后迅速置于冰浴放置5min)上377測序儀檢測分析結(jié)果，電泳條件為電壓3KV，電泳時間2.5h。電泳結(jié)果經(jīng)GeneSc肌和GeneMapperID軟件分析得到片段大小、各個目的產(chǎn)物的峰高值及峰面積值等有關(guān)數(shù)據(jù)。產(chǎn)物大小由DNA分子標(biāo)準(zhǔn)得出，峰高用來預(yù)判目的基因的表達(dá)強(qiáng)度，峰面積(即PCR產(chǎn)物條帶熒光強(qiáng)度)用于計算目的基因的相對表達(dá)量，公式如下目的基因相對表達(dá)量=目的基因峰面積+看家基因峰面積的幾何平均數(shù)(5)計算目的基因的相對表達(dá)量，篩選2品系小鼠睪丸組織間差異表達(dá)的基因。權(quán)利要求1.一種基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法，其特征在于包括下列步驟(1)通用引物及上下游嵌合特異引物的引物序列設(shè)計通用引物的長度為20bp，上游通用引物5’端用Fam熒光標(biāo)記，嵌合特異引物長度為38bp，3’端為特異引物序列段，5’端為通用引物序列段；(2)多重RT-PCR反應(yīng)過程a逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)階段，下游嵌合特異引物逆轉(zhuǎn)錄合成目的基因的cDNA第一鏈；bPCR反應(yīng)過程，前3個循環(huán)，上游嵌合特異引物將通用引物序列加到目的基因DNA片段的兩端；PCR反應(yīng)的余下循環(huán)，高濃度的熒光通用引物取代上游嵌合特異引物完成整個PCR反應(yīng)過程；(3)測序儀凝膠電泳予以分析檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法，其特征在于步驟(1)中設(shè)計擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在100400bp間，相鄰產(chǎn)物長度差為57bp。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法，其特征在于步驟(1)中所述的通用引物為上下游同一序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法，其特征在于步驟(2)中所述的PCR反應(yīng)過程，前期加入一個上游嵌合特異引物的降落式PCR過程，為11個循環(huán)。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法，其特征在于所述的通用引物根據(jù)水稻序列設(shè)計，引物序列為FWD,5，-cgggctacgctatctacgac-3',REV,5，-cgggcagtaagtaccgttgt-3，。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法，其特征在于所述的嵌合特異引物根據(jù)11個小鼠目的基因和3個看家基因的cDNA序列信息設(shè)計，引物序列為ph傷FWD:c卿ctecgctefctecgacCGCAAAGGAAGACCGAGAREV:cgrgrgrcagteasffaccfif的n"GGACCTGCTGTCTTCTGG產(chǎn)物長度98bpPlaclFWD:c卿cfacgcfafcfacgacATCCGCATCAAGGCTGTCREV:cgrgfgrcagteagfaccg收fGATGAGCCCTTGGAAGCA產(chǎn)物長度114bpTmem32FWD:c卿ctecgcfafctecgacCCCACGAGCATGAACACAREV:cgggcagrteagfaccgr的fAGGCGGGGTTCCTATCAA產(chǎn)物長度122bpUsp26FWD:cgggctecgctete/acgacATGCCCAGACACAGCACAREV:cggrgcagteagteccg的fTGACACCGAACCATTCCA產(chǎn)物長度138bpDdx26bFWD:cgggctecgctetetecgacACGTGGCATTGAGGGAAAREV:cfifg^cagteagteccg^gfTCATGGAGGCGGACGTAT產(chǎn)物長度145bpPPIAFWD:c卿ctecgctetefacgacACGCCACTGTCGCTTTTCREV:cggrgrcasffaasrfaccsfffgfTGCAAACAGCTCGAAGGA產(chǎn)物長度152bpmospdlFWD:cggfgcfacgctetefacgacTTCCGAGGAGCCAGTGTTREV:cgggcagffaafifteccgffgffTGGCACTGGATCCCACTT產(chǎn)物長度164bpHsbst2FWD:c卿cfecgrfafctecgacTTCGGCCAGGTTTGTACCREV:cgggrcafifteagteccgrffgfAGGTGACGGCCAAAAGTG產(chǎn)物長度178bpGm773FWD:cgggcfacgcfafcfacgacAACCACATCACGGCAGGTREV:cgggrcagteagteccg^gfTCCAGGAAAGCCATTTGC產(chǎn)物長度187bpMbnl3FWD:cgggrcfacgcfafcfacgracTGGGCGTGGAGACAGTTTREV:cgggcagfteasfteccg的K3GCCTGACTTTTGCCAGA產(chǎn)物長度197bpGapdhFWD:cgggfCfacgcfafcfacgacCAATGTGTCCGTCGTGGAREV:cgggcagteagrfaccgtfg/GGCATCGAAGGTGGAAGA產(chǎn)物長度218bpFhllFWD:cgrgrgfcfacgctefcfacsracCAGGTGCAAAGGGTGCTTREV:cgfsrsfcagfaagteccsr收n"GGCCTTGTTGCACTTCA產(chǎn)物長度249bpCxxlb/CxxlaFWD:cgsfSfctecgctetetecsfacATGGCGAGATGGACAAGCREV:cggrgcagtaagteccg的fCGAACACCCGC丌CATCT產(chǎn)物長度256bpBeta-actinFWD:cgrgsfcfacgctefcfacsracCAACTGGGACGACATGgAREV:cgrgrgfcagrteagfaccgr的rcCATCACAATGCCTGTGG產(chǎn)物長度270bp7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法，其特征在于步驟(2)中所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為5xReactionBuffer4nL、4.8濃度為25mM的MgCl2、lpL濃度為2mM的dNTPMix、l^L濃度為lJ/nL的ImProm-IIReverseTranscriptase,下游嵌合引物2pL總濃度10pM、23^L濃度為lOOng/pL的RNAtemplate,補(bǔ)水至20^L，反應(yīng)過程為25。C5min，42。C60min，7(TC15min。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法，其特征在于步驟(2)中所述的PCR反應(yīng)過程反應(yīng)體系為PCRBuffer10xlpL、0.6pL濃度為25mM的MgCl2、1pL濃度為2mM的dNTPMix、5xQ-Solution2^L、0.1濃度為5U/pLDNAPolymerase、1nL濃度為1015ng4iL的cDNAtemplate、上游嵌合特異引物對0.5總濃度10pM、0.5pL通用上下游引物對10^M，補(bǔ)水至10^L，反應(yīng)過程為95。C15min;94°C30s,55°C90s，72°C60s，35cycles;72°C10min。9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法，其特征在于:所述降落式PCR反應(yīng)過程退火溫度為6(TC5(TC，每一個循環(huán)退火溫度降低1°C。全文摘要本發(fā)明涉及基于熒光通用引物的多重定量RT-PCR基因表達(dá)譜分析方法，包括下列步驟(1)通用引物及上下游嵌合特異引物的引物序列設(shè)計，通用引物的長度為20bp，上游通用引物5’端用Fam熒光標(biāo)記，嵌合特異引物長度為38bp，3’端為特異引物序列段，5’端為通用引物序列段；(2)多重RT-PCR反應(yīng)過程；(3)測序儀凝膠電泳予以分析檢測。本發(fā)明適用于10-30個基因/反應(yīng)的研究特定藥物代謝途徑或信號傳導(dǎo)通路等特定候選基因表達(dá)分析，是一種對于定量的、高通量的、經(jīng)濟(jì)的基因表達(dá)分析簡單最佳的多重解決方案。文檔編號C12Q1/68GK101463389SQ200810207238公開日2009年6月24日申請日期2008年12月18日優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日發(fā)明者周宇荀,凱李,王勤熙,肖君華,趙麗亞申請人:東華大學(xué)