鼠疫耶爾森氏菌熒光定量引物、檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，尤其涉及鼠疫耶爾森氏菌熒光定量引物、檢測(cè)方法及試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌引起的一種廣泛流行于人類和嚙齒動(dòng)物的自然疫源性 疾病，主要以蜱、蚤等傳播媒介為主。目前自然界中已有數(shù)百種動(dòng)物被證實(shí)可以感染鼠疫。 由于生態(tài)環(huán)境的因素及傳播方式的多樣化，鼠疫在自然界動(dòng)物中廣泛流行，如鼠類、兔類、 旱獺等。鼠疫耶爾森氏菌傳播往往先在鼠類中流行，導(dǎo)致大批鼠類死亡，當(dāng)病鼠死亡后，蜱 將寄生宿主轉(zhuǎn)向人類，并通過(guò)吸血的方式把鼠疫傳給人類，從而造成人間鼠疫。20世紀(jì)90 年代以來(lái)，鼠疫在全球范圍內(nèi)明顯回升，人間病例迅速增多。
[0003] 鼠疫的傳統(tǒng)檢測(cè)方法為"四步檢測(cè)法"，此方法雖然能夠檢測(cè)鼠疫的流行狀態(tài)，但 是耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，不能夠給予及時(shí)準(zhǔn)確的指導(dǎo)意見(jiàn)。因此，快速準(zhǔn)確的檢測(cè)鼠疫耶爾森 氏菌具有重要意義。
[0004] 隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，熒光PCR的應(yīng)用大大縮減的檢測(cè)的時(shí)間和精力。實(shí) 時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近年來(lái)應(yīng)用比較廣泛的檢測(cè)技術(shù)。具有快速 便捷、特異性高、敏感性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。主要包括SYBRGreenI隨機(jī)摻入法和TaqMan 探針?lè)▋煞N檢測(cè)方法。該技術(shù)把PCR、分子雜交和光化學(xué)等優(yōu)點(diǎn)合為了一體，擁有基因擴(kuò)增 的敏感性，分子雜交的特異性和光化學(xué)的精確性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近年來(lái)發(fā)展較快、應(yīng) 用較多的檢測(cè)技術(shù)，具有操作便捷、高特異性、高敏感性等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 因此，建立鼠疫耶爾森氏菌的檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)鼠疫耶爾森氏菌的快速、準(zhǔn)確 檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供鼠疫耶爾森氏菌熒光定量引物、檢 測(cè)方法及試劑盒，本發(fā)明提供的引物具有良好的重復(fù)性、靈敏性和特異性。本發(fā)明提供的方 法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)鼠疫耶爾森氏菌的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。
[0007] 本發(fā)明提供了鼠疫耶爾森氏菌熒光定量檢測(cè)引物組，包括如SEQIDN0:1所示核 苷酸序列的上游引物和如SEQIDN0:2所示核苷酸序列的下游引物。
[0008] 本發(fā)明還提供了如SEQIDN0:3所示核苷酸序列的鼠疫耶爾森氏菌熒光定量檢測(cè) 探針。
[0009] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，探針的3'端連接有FAM熒光標(biāo)記基團(tuán)。
[0010] 本發(fā)明根據(jù)鼠疫耶爾森氏菌的保守序列設(shè)計(jì)合成對(duì)應(yīng)鼠疫耶爾森菌熒光定量引 物，根據(jù)此菌與GenBank所公布的序列進(jìn)行比對(duì)，所設(shè)計(jì)的引物和探針完全匹配。因此，本 發(fā)明提供的探針和引物用于鼠疫耶爾森氏菌的熒光定量檢測(cè)具有良好的特異性、重復(fù)性和 靈敏性。其能檢測(cè)出的最低拷貝數(shù)為1. 66XIO2Copies/yL。
[0011] 本發(fā)明還提供了鼠疫耶爾森氏菌的檢測(cè)方法包括：以如SEQIDNO: 1所示核苷酸 序列的上游引物、如SEQIDN0:2所示核苷酸序列的下游引物擴(kuò)增擴(kuò)增待測(cè)樣品DNA，以如SEQIDN0:3所示核苷酸序列的探針檢測(cè)，經(jīng)熒光定量PCR獲得熒光信號(hào)。
[0012] 根據(jù)熒光信號(hào)值及擴(kuò)增曲線獲得樣品中是否含有鼠疫耶爾森氏菌，具體為：熒光 信號(hào)Ct值< 28. 0,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)無(wú)效；
[0013] 無(wú)熒光信號(hào)Ct值或無(wú)擴(kuò)增曲線，待測(cè)樣品為陰性，不含鼠疫耶爾森氏菌；
[0014] 熒光信號(hào)Ct值<30.0,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，待測(cè)樣品為陽(yáng)性，含有鼠疫耶爾 森氏囷。
[0015] 待測(cè)樣品DNA對(duì)待測(cè)樣品組織提取獲得。
[0016] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，DNA的提取方法為：
[0017] 步驟1 :將動(dòng)物組織在液氮中粉碎后，粉末組織放于I. 5rnl離心管中；
[0018] 步驟2 :加入180yL緩沖液ATL，然后加入20yL蛋白酶K，于56°C溫育1~3小 時(shí)，每隔20min取出輕輕旋禍，觀察直到組織完全溶解；
[0019] 步驟3 :取出離心管短暫離心，然后加入200yL的緩沖液AL，短暫禍旋15s，37°C 溫育IOmin;
[0020] 步驟4 :短暫離心后加入200yL無(wú)水乙醇，輕輕禍旋15s，短暫離心；
[0021] 步驟5 :將上述樣品加入到QIAampMinispincolumn收集管中，8000rpm離心 Imin，棄濾液；
[0022] 步驟6 :加入500yL緩沖液AWl，8000rmp離心Imin，棄濾液；
[0023] 步驟7 :加入500yL緩沖液AW2,全速離心2min，棄濾液；
[0024] 步驟8 :更換柱子的收集管，全速離心Imin;
[0025] 步驟9 :將柱子放置到新的I. 5ml離心管上，加入100y1緩沖液AE，室溫下放置 lmin，8000rmp，離心Imin0
[0026] 提取待測(cè)樣品所用緩沖液ATL、緩沖液AU緩沖液AW1、緩沖液AW2、緩沖液AE、 QIAampMinispincolumn收集管來(lái)自DNA提取試劑盒，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0027] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，熒光定量PCR的反應(yīng)體系為：
[0028]
[0029] 本發(fā)明提供的熒光定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增能夠獲得良好的擴(kuò)增曲線，提高實(shí) 驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
[0030] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，real-timePCR檢測(cè)的程序?yàn)椋?br>[0031]
[0032] 本發(fā)明提供的熒光定量PCR引物退火溫度為65°C或62°C，以此溫度檢測(cè)，能夠提 尚實(shí)驗(yàn)的特異性。
[0033] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，SEQIDNO: 1所示核苷酸序列的上游引物的濃度為IOpmol/ L;SEQIDN0:2所示核苷酸序列的上游引物的濃度為10pmol/L;SEQIDN0:3所示核苷酸 序列的探針的濃度為l〇pmol/L。
[0034] 本發(fā)明還提供了鼠疫耶爾森氏菌的檢測(cè)試劑盒，包括：SEQIDN0:1所示核苷酸序 列的上游引物、SEQIDN0:2所示核苷酸序列的下游引物，和SEQIDN0:3所示核苷酸序列 的探針。
[0035] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，試劑盒還包括dNTP、Taq酶、PCR反應(yīng)緩沖液。
[0036] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，還包括ddH20、96孔板和光學(xué)反應(yīng)蓋膜。
[0037] 本發(fā)明以鼠疫耶爾森氏菌的保守序列作為檢測(cè)靶目標(biāo)，提供用于鼠疫耶爾森氏菌 的熒光定量檢測(cè)的探針和引物，以該引物和探針對(duì)鼠疫耶爾森氏菌進(jìn)行檢測(cè)，能夠具有良 好的特異性、重復(fù)性和靈敏性。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，以本發(fā)明提供的引物和探針對(duì)鼠疫耶 爾森氏菌進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確性可達(dá)100 %，對(duì)其他病毒未見(jiàn)非特異性的擴(kuò)增，特異性良好。通過(guò) 對(duì)不同拷貝的鼠疫耶爾森氏菌標(biāo)準(zhǔn)品系時(shí)候進(jìn)行檢測(cè)，該引物和探針對(duì)鼠疫耶爾森氏菌能 檢測(cè)出的最低拷貝數(shù)為1.66X102coPies/yL，具有良好的靈敏性。在標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線、 標(biāo)準(zhǔn)曲線中，不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品間相關(guān)系數(shù)（R2)為1，擴(kuò)增效率E= 101%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率 為-3. 278,截距為44. 332,回歸方程為Ct= -3. 2781gN+44. 332。表明本發(fā)明提供的引物和 探針具有良好的擴(kuò)增效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1示按照實(shí)施例1的反應(yīng)體系及條件分別對(duì)不同菌進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 本發(fā)明提供了鼠疫耶爾森氏菌熒光定量引物、檢測(cè)方法及試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng) 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用 已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì) 本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0040] 本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購(gòu)得。
[0041] 鼠疫耶爾森氏菌標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為：
[0042] 首先，將鼠疫耶爾森氏菌EV株（由吉林鼠疫防控中心饋贈(zèng)）涂在LB固體培養(yǎng)基 上，從固體平板培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落，接種于IOOmL的液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行170r/min， 37°C培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)后，取1~4mL的菌液，12000rpm離心2min，棄去上清液；觀察其中 沉淀量，如沉淀過(guò)小，需多富集幾次，將沉淀混合收集在一起，提取DNA。
[0043] 將提取的鼠疫耶爾森氏菌基因組DNA作為模板，通