瓜蔓枯病菌熒光pcr檢測方法及所用引物和探針的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及瓜蔓枯病菌熒光PCR檢測方法及所用引物和探針。
【背景技術】
[0002] 瓜蔓枯病病狀：主要為害多種瓜蔓，同時也為害葉片和果實。蔓發(fā)病初期節(jié)部產生 油浸狀褪色裂紋，并分泌出膠脂。病情嚴重時，蔓上裂紋部位出現(xiàn)爆裂，主蔓基部裂開口還 會流出灰、紅色膠狀液體，俗稱"爆血管";側蔓裂開后，產生白色油狀物。部分植株出現(xiàn)生長 發(fā)育緩慢或停止生長；重者全株死亡，蔓干燥后呈赤褐色。
[0003] 瓜蔓枯病菌長距離傳播主要依靠感病的植株、病殘體以及受侵染的種子等植物性 材料。瓜蔓枯病菌在瓜的整個生育期地上各部均可受害，以葉片、瓜蔓受害最為嚴重，但主 要危害莖基部。目前國內未見報道有關檢測該病菌的熒光PCR特異性引物和探針。目前瓜 蔓枯病菌的檢驗方法主要是常規(guī)種子帶菌檢驗。這種方法經驗性較強，主要表現(xiàn)在：（1)瓜 蔓枯病菌和其他近似病原菌在形態(tài)上較難區(qū)分；（2)瓜蔓枯病菌的有性態(tài)只存在于病殘體 上，很難誘發(fā)。因此建立對瓜蔓枯病菌快速、準確的檢測方法至關重要。
[0004] 所涉及的參考文獻如下：
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【發(fā)明內容】

[0016] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種瓜蔓枯病菌熒光PCR檢測方法及所用引物 和探針，采用本發(fā)明方法檢測瓜蔓枯病菌具有特異性、穩(wěn)定性和靈敏性都非常好的特點。
[0017] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種用于瓜蔓枯病菌熒光PCR檢測方法的引 物和探針；
[0018] 本發(fā)明從GenBank查詢所有瓜蔓枯病菌的beta-tubulin相關序列，設計瓜蔓枯病 的特異性引物和TaqMan探針，具體如下：
[0019] 引物：
[0020] Db-5 :5, -CGTAAGTAGACCTCCACCAC-3，
[0021] Db-7 :5, -CGAAGTGCCATTGTAGACA-3,；
[0022] TaqMan 探針：
[0023] Db-P :5' FAM-TCACTTCTCAACAACAGCGGCTT-3' TAMRA。
[0024] 備注說明：產物大小140bp。
[0025] 本發(fā)明還同時提供了利用上述特異性引物和TaqMan探針進行的瓜蔓枯病的實時 熒光PCR方法，包括以下步驟：
[0026] 1)、提取待測植物材料（包括種子等）的DNA ;
[0027] 2)、PCR 反應：
[0028] 采用 25 μ L 反應體系：10 X Buffer 2. 5 μ L，25mmol/L Mg2+2 μ L，2. 5mmol/L dNTP 0· 5yL，5U/yL TaqMan 聚合酶 0· 2yL，上下游引物（10ymol/L)各 0· 5yL，TaqMan 探針 (10 μ mol/L) (λ 5 μ L，模板DNA :0· 5-2 μ L，最終用三蒸水補足至25 μ L。
[0029] 反應程序為：95°C 3min ; (95°C 15s，58. 4°C lmin，40 個循環(huán)），反應中止。
[0030] Mg2+具體為 MgCl2;
[0031] 3)、能檢測到熒光（Ct值小于40)為陽性，否則為陰性。
[0032] 備注說明：
[0033] 在發(fā)明過程中，所使用的熒光PCR儀中溫度梯度所用PCR為Eppendorf熒光PCR 儀。確定退火溫度后所用的熒光PCR儀為ABI公司7300。
[0034] 本發(fā)明在發(fā)明過程中：使用瓜蔓枯病菌ATCC201923樣品DNA進行體系參數優(yōu)化。 實時熒光PCR進行兩步反應，對復性-延伸溫度進行了優(yōu)化，分別進行了 57°C~64°C 12個 不同溫度的測試；Mg2+濃度從Ommol/L到4mmol/L (指在25 μ L反應體系中的濃度，即，本發(fā) 明最終設定的為2mmol/L)共9個均勻遞增的濃度梯度。
[0035] ITS序列由于真菌種類的不同而經常發(fā)生變異，它彌補了核糖體DNA上其他區(qū)域 序列（18S、5. 8S和28S)的保守性強、進化速度慢、分化水平低的不足，表現(xiàn)出極大的序列多 態(tài)性。因而，在核糖體DNA各區(qū)域序列中，ITS區(qū)域序列顯得更為有效，可用于種水平上的 分類鑒定。
[0036] 真菌的分子鑒定最常用的是rDNA上的18S、5.8S和28S及其ITS基因序列，由于 ITS的序列分析能反映出屬間、種間以及菌株間的序列差異，而且ITS序列片段較小、容易 分析，已經被廣泛應用于真菌屬內不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研宄中，但是在瓜蔓枯 病菌的序列比對中該區(qū)段很難找到突變位點設計探針。
[0037] 本發(fā)明選擇瓜蔓枯病菌的beta-tubulin基因設計引物探針序列，通過對瓜上其 他病害和瓜蔓枯病菌的檢測研宄，結果表明該方法特異性、穩(wěn)定性和靈敏性都非常好。
【附圖說明】
[0038] 下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0039] 圖1是不同退火溫度Tm值對實時熒光PCR檢測體系的影響（FiglThe influence of different temperature melt on the Real-Time PCR system)；
[0040] I ：57. 1°C ；2 ：57. 3 °C ；3 ：57. 8°C ；4 ：58. 4°C ；5 ：59. 4°C ；6 ：60. 2°C ；7 ：61. 2°C ；8 ： 62. 2°C ;9 :63°C ;10 :63. 6°C ;11 :64°C ;12 :64. 1°C ;13 :空白對照。
[0041] 圖2是不同Mg2+濃度對實時熒光PCR檢測體系的影響（Fig2The influence of different Mg2+concentration on the Real-Time PCR system)；
[0042] I :0 μ I ;2 :0· 5 μ I ;3 :1 μ I ;4 :1. 5 μ I ;5 :2 μ I ;6 :2. 5 μ I ;7 :3 μ I ;8 :3. 5 μ I ; 9 ：4 μ l〇
[0043] 圖3是不同DNA濃度對實時熒光PCR檢測體系的影響（Fig3The influence of different DNA concentration on the Real-Time PCR system)；
[0044] I :8. 9ng(原液）；2 :89(^8(10-1) ;3 :89pg(l(T2) ;4 :8. 9pg(l(T3) ;5 :890fg(l(T4); 6 :89fg(l(T5) ;7 :8. 9fg(l(T6) ;8 :890ag(l(T7) ;9 :0。
[0045] 圖4是實時焚光PCR產物電泳檢測結果（Fig4 :Agarose gel electroph