專利名稱：與肝細(xì)胞癌相關(guān)的乙型肝炎病毒基因組標(biāo)志物的制作方法
與肝細(xì)胞癌相關(guān)的乙型肝炎病毒基因組標(biāo)志物發(fā)明背景在世界范圍內(nèi)，有超過(guò)3億人感染乙肝病毒(HBV)。對(duì)那些具有高度 病毒復(fù)制水平的個(gè)體來(lái)說(shuō)，由慢性活動(dòng)型肝炎發(fā)展為肝硬化，肝衰竭和 肝細(xì)胞癌(HCC)是常見的。慢性HBV感染超過(guò)10至20年的自然進(jìn)程導(dǎo)致20%至50%的患者出 現(xiàn)肝硬化，并已證明HBV感染能夠發(fā)展為肝細(xì)胞癌。目前沒(méi)有關(guān)于確定 究竟何種乙肝病毒亞型最易誘發(fā)肝細(xì)胞癌的任何研究，因此至今認(rèn)為所 有的乙肝病毒都具有相同的肝細(xì)胞癌形成危險(xiǎn)。值得注意的是，從初次診斷算起，診斷患有肝細(xì)胞癌的患者存活期 i"又有0.9至12.8個(gè)月(Takahashi et al,, American Journal of Gastroenterology 88:240-243 (1993))。采用化療的方法對(duì)肝細(xì)胞癌進(jìn)行治療的收效甚微，由 于在肝中腫瘤的廣泛擴(kuò)散(Trinchet et al. ， Presse Medicine 23:831-833 (1994))，僅有10%的患者可從手術(shù)中獲益。因原發(fā)肝細(xì)胞癌的侵入特性， 手術(shù)治療中唯 一 可行的選擇是肝移植(Pichlmayr et al., Hepatology 20:33S-40S(1994))。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了確定感染乙型肝炎病毒(HBV)個(gè)體發(fā)展成為肝細(xì)胞癌 (HCC)遺傳素因的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括(a) 確定分離自所述個(gè)體的HBV基因組中對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l中核 苷酸第31, 53， 312, 799, 961, 1165, 1499, 1613， 1762, 1764， 1899, 2170, 2441， 2525和/或2712位的核苷酸；及(b) 將確定的核苦酸和HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸進(jìn)行比較，其中 所述HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸包括31C， 53C， 312C, 799G, 961G, 1165T, 1499G， 1613A, 1762T, 1764A, 1899A, 2170C, 2170G, 2441C, 2525C, 2712C, 2712A和/或2712G。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括(a) 確定分離自所述個(gè)體的B基因型HBV基因組中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l中核苷酸第1165， 1762, 1764, 2525或2712位的核香酸；及(b) 將確定的核苷酸和HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸進(jìn)行比較，其中 HCC遺傳素因相關(guān)的核芬酸包括1165T, 1762T, 1764A, 2525C, 2712C, 2712A或2712G。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括(a) 確定分離自個(gè)體的B基因型HBV基因組中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l 中核苷酸第1165， 1762， 1764, 2525和2712位的核苷酸；及(b) 將確定的核苷酸和HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸進(jìn)行比較，其中 在B基因型中與HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸包括1762T和1764A和2712A;或 1762T和1764A和2712C;或 1762T和1764A和2712G;或 1762T和1764A和2712T和2525C;或 1762A和1764G和1165T。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括確定來(lái)自所述個(gè)體HBV的基因型。在一些實(shí)施方案中，所述確定步驟包括對(duì)側(cè)翼連接有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l中核香酸第1165， 1762, 1764， 2525和2712位的核苦酸的HBV 基因組進(jìn)行核香酸測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，所述確定步驟包括對(duì)至少HBV基因組的部分進(jìn) 行擴(kuò)增，以產(chǎn)生一種或更多種包括有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l中核苷酸第 1165， 1762， 1764, 2525和2712位核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案 中，所述方法包括將所述一種或更多種擴(kuò)增產(chǎn)物與一種或更多種能與 HCC相關(guān)核苷酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴(kuò)增產(chǎn)物在HCC相關(guān)核 苷酸位置含有互補(bǔ)核苷酸的條件下，所述探針與所述擴(kuò)增產(chǎn)物才能進(jìn)行 雜交，所述相關(guān)核苷酸為1762T和1764A和2712A;或1762T和1764A和2712C;或1762T和1764A和2712G;或51762T和1764A和2712T和2525C;或 1762A和1764G和1165T。在一些實(shí)施方案中，所述雜交是通過(guò)線性探針進(jìn)行的。 在一些實(shí)施方案中，所述方法包括(a) 確定分離自所述個(gè)體的C基因型HBV基因組中對(duì)應(yīng)于核苷酸第 31, 53, 312, 799， 961, 1499， 1613, 1899， 2170或2441位的核苦酸; 及(b) 對(duì)確定的核苷酸和HCC遺傳素因相關(guān)的核苦酸進(jìn)行比較，其中 該HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸包括31C， 53C， 312C, 799G, 961G, 1499G, 1613A， 1899A， 2170C, 2170G或2441C。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括a)確定來(lái)自所述個(gè)體C基因型HBV的亞型，其中Cl亞型包括核苦酸2733A, 1856C， 1009T和2892T,C2亞型包括核苦酸2733C， 1856T， 1009T和2892T，和C3亞型包括核苷酸2733C, 1856C， 1009C和2892T;bl)如果HBV的基因型為Cl，則確定對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1中核苷酸第31， 53和1499位的核苷酸；或b2)如果HBV的基因型為C2,則確定對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1中核苷酸第799， 2441和2170位的核苷酸；及b3)如果HBV的基因型為C3,則確定對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1中核苷酸第312， 961, 1613, 1899位的核苷酸；及c)將確定的核苷酸和HCC遺傳素因相關(guān)位置上的核香酸進(jìn)行比較，其中在Cl亞型中與HCC遺傳素因相關(guān)的核苦酸包括 31C;和/或 53C;和/或 1499G;及在C2亞型中與HCC遺傳素因相關(guān)的核苦酸包括 2170C;和/或 2170G;和/或 2441C;和/或799G;及在C3亞型中與HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸包括312C;和/或961G;和/或1613A;和/或1899A。在一些實(shí)施方案中，所述確定步驟包括對(duì)側(cè)翼連接有對(duì)應(yīng)于SEQID NO:l中核苷酸第31， 53和1499位的核苷酸的HBV基因組進(jìn)行核苷酸 測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，所述確定步驟包括對(duì)側(cè)翼連接有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l中核苷酸第799, 2441和2170位的核苷酸的HBV基因組進(jìn)行核苷 酸測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，所述確定步驟包括對(duì)至少HBV基因組的部 分進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生一種或更多種包含有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l中核苦酸 第31， 53和1499位的核香酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述確 定步驟包括對(duì)側(cè)翼連接有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l中核苷酸第312,961,1613 和1899位的核苦酸的HBV基因組進(jìn)行核苷酸測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，所述確定步驟包括對(duì)至少HBV基因組的部分進(jìn) 行擴(kuò)增，以產(chǎn)生一種或更多種包含有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l中核苷酸第 799， 2441和2170位的核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述確定 步驟包括對(duì)至少HBV基因組的部分進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生一種或更多種包含 有對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1中核苦酸第312， 961， 1613和1899位的核苷酸 擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將所述一種或更多種擴(kuò)增產(chǎn)物與 一種或更多種能與HCC相關(guān)核苷酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴(kuò)增 產(chǎn)物在HCC相關(guān)核苷酸位置含有互補(bǔ)核苷酸的條件下，所述探針與所述 擴(kuò)增產(chǎn)物才能進(jìn)行雜交，所述相關(guān)核香酸為31C;和/或53 C;和/或1499G。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將所述一種或更多種擴(kuò)增產(chǎn)物與 一種或更多種能與HCC相關(guān)核苷酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴(kuò)增產(chǎn)物在HCC相關(guān)核苷酸位置含有互補(bǔ)核苷酸的條件下，所述多種探針與 所述擴(kuò)增產(chǎn)物才能進(jìn)行雜交，所述相關(guān)核苦酸為2170G;和/或2441C;和/或799G。在一些實(shí)施方案中，所述雜交是通過(guò)線性分析法進(jìn)行的。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將所述一種或更多種擴(kuò)增產(chǎn)物與 一種或更多種能與HCC相關(guān)核普酸雜交的探針相接觸，只有在所述擴(kuò)增 產(chǎn)物在HCC相關(guān)核苦酸位置含有互補(bǔ)核苷酸的條件下，所述多種探針與 所述擴(kuò)增產(chǎn)物才能進(jìn)行雜交，所述相關(guān)核香酸為312C;和/或961G;和/或1613A;和./或1899A。在一些實(shí)施方案中，所述雜交是通過(guò)線性分析法進(jìn)行的。 在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括確定所述個(gè)體HBV的基因型。 在一些實(shí)施方案中，所述方法包括確定HBV的基因型，其中B基因型包括2733C、 1856C、 1009T和 2892T,其中Cl基因型包括2733A、 1856C、 1099T和2892T， C2基因 型包括2733C、 1856T、 1009T和2892T， C3基因型包括2733C、 1856C、 1009C和2892T;如果HBV的基因型為B,則確定HBV基因組上對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l 中核苷酸第1165， 1762, 1764, 2525和2712位的核香酸；和/或如果HBV的基因型為C1,則確定HBV基因組上對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l 中核苦酸第31和/或53和/或1499位的核苦酸；和/或如果HBV的基因型為C2，則確定HBV基因組上對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1 中核苷酸第2170和/或2441和/或799位的核苷酸；和/或如果HBV的基因型為C3,則確定HBV基因組上對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1 中核苦酸第312和/或961和/或1613和/或1899位的核苦酸；和/或?qū)⒋_定的核苷酸和HCC遺傳素因相關(guān)的核苦酸進(jìn)行比較，其中在B基因型中與HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸包括1762T和1764A和2712A;或1762T和1764A和2712C;或1762T和1764A和2712G;或1762T和1764A和2712T和2525C;或1762A和1764G和1165T;其中在Cl基因型中與HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸包括 31C;和/或 53C;和/或 1499G;和其中在C2基因型中與HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸包括2170C;和/或2170G;和/或2441C;和/或799G;其中在C3基因型中與HCC遺傳素因相關(guān)的核苦酸包括312C;和/或961G;和/或1613A;和/或1899A;由此確定所述個(gè)體發(fā)展成為HCC的遺傳素因。本發(fā)明還提供了確定與肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)展有關(guān)的HBV分離物的試 劑盒。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括一種或更多種探針，當(dāng)其與HBV基因組接觸時(shí)，如果所述基因組包 括至少一種下列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l中核苦酸位置的核苦酸時(shí)選擇性地 與所述基因組雜交，所述核苦酸有31C, 53C， 312C, 799G, 961G， 1165T, 1499G, 1613A, 1762T， 1762A, 1764A, 1764G, 1899A， 2441C， 2170C, 2170G, 2712A, 2712C, 2712G或2525C。在一些實(shí)施方案中，所述探針與固體支持物相連。 在一些實(shí)施方案中，所述探針選擇性地雜交于1762T和1764A和2712A;和/或 1762T和1764A和2712C;和/或； 1762T和1764A和2712G;和/或 1762T和1764A和2712T和2525C;和/或 1762A和1764G和1165T。在一些實(shí)施方案中，所述探針選擇性地雜交于 31C;和 53C;和 1499G。在一些實(shí)施方案中，所述探針選擇性地雜交于2170C;和/或2170G;和/或2441C;和/或799G。在一些實(shí)施方案中，所述探針選擇性地雜交于312C;和/或961G;和/或1613A;和/或1899A。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括用于擴(kuò)增至少HBV基因組的 部分的引物。本發(fā)明還提供了計(jì)算機(jī)可讀的介質(zhì)，該介質(zhì)用于鑒定HBV序列是否 有可能導(dǎo)致HCC發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，所述計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括a) 接收信息的編碼，該信息描述對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l中核苷酸第31, 53, 312, 799， 961， 1165, 1499, 1613, 1762， 1764, 1899, 2170, 2441, 2525或2712位的核苦酸;b) 將在a)中接收的核苷酸和HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸進(jìn)行比較 的編碼；及c)提供確定導(dǎo)致HCC的HBV遺傳素因的編碼，其中與HCC遺傳素因相關(guān)的核苷酸包括31C, 53C, 312C, 799G， 961G, 1165T, 1499G， 1613A, 1762T， 1762A, 1764A, 1899A, 2170C, 2170G, 2441C, 2525C 、 2712C, 2712A或2712G。定義當(dāng)存在所述特定核苷酸(在特定位置)時(shí)，當(dāng)所述探針與所述基因組雜 交時(shí)，探針與包含特定核苷酸的病毒基因組"選擇性地雜交"，但在特定 位置上的核苷酸是不同的核苷酸或缺失時(shí)則不發(fā)生雜交。只有特定的靶 DNA中有互補(bǔ)核苷酸時(shí)，允許探針和特定DNA分子發(fā)生雜交的條件通 常是"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"。"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"是這樣一種條件，在該條件下探針通常在核酸的 復(fù)雜的混合物中與其靶標(biāo)子序列雜交，而不與其他序列雜交，或至少不 與在其特定位置不是一種特定核苷酸而是其它核苷酸的其他序列雜交。 嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴的且在不同情況下情況各異。在較高溫度下進(jìn)行較 長(zhǎng)序列的特異性雜交。關(guān)于核酸雜交的廣泛指導(dǎo)參見Tijssen, 7fec/m^M^"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)。 一般地，在給定離子強(qiáng)度、pH下對(duì)特異序列嚴(yán)謹(jǐn)條件的 選擇通常比熱熔溫度(Tm)低5。C至10。C。 Tm是指在該溫度下(給定離子強(qiáng) 度、pH和核酸濃度)，50%與靶序列互補(bǔ)的探針和靶序列的雜交達(dá)到平衡 (當(dāng)靶序列過(guò)量時(shí)，在Tm,平衡時(shí)有50%的探針被結(jié)合)的溫度。對(duì)于 Southern雜交的嚴(yán)謹(jǐn)條件一般是在pH 7.0-9.3之間，鹽濃度J氐于約1.0 M 鈉離子，通常約為0.01-1.0 M鈉離子濃度(或其他鹽)，以及對(duì)短探針(例 如10-50個(gè)核苷酸)該溫度為至少約30。C，對(duì)長(zhǎng)探針(例如超過(guò)50個(gè)核芬 酸)該溫度至少約為60。C的雜交條件。通過(guò)加入諸如曱酰胺的去穩(wěn)定劑也 能實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)條件。對(duì)選擇性雜交而言，陽(yáng)性信號(hào)至少為背景的兩倍，也 可為背景雜交的10倍，該背景雜交是在所述目的位置處與另外具有不同 核苷酸的核酸序列的雜交。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的示例如下50%曱酰胺、5x SSC、 1%SDS、 42。C孵育,或者是5xSSC、 1% SDS、 65。C將育,用0.2xSSC、 0.1% SDS、在65。C漂洗，該漂洗可進(jìn)行5分鐘，15分鐘，30分 鐘，60分鐘，120分鐘或更長(zhǎng)的時(shí)間。參考序列(例如SEQ ID N0:1)的特定核苦酸"對(duì)應(yīng)位置處的HBV基 因組中核苷酸的確定"是指對(duì)分離到的HBV基因組上等同于參考序列所 述特定位置處的位置進(jìn)行確定。本發(fā)明確定的變體不限于預(yù)測(cè)SEQ ID N0:1變體遺傳素因的序列，還能應(yīng)用于任何攜帶有特定對(duì)應(yīng)核苷酸的 HBV4朱。所以，當(dāng)HBV分離物的基因組與SEQIDN0:1不同時(shí)(例如發(fā) 生核苷酸的改變或核苷酸的添加或缺失)，與HCC發(fā)生有關(guān)的特定核苷酸 有可能與其在SEQIDNO:l上的位置不完全一致。例如，由于在HBV林 基因組較前位置有一個(gè)核苷酸的插入，對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1上31C位的 核苷酸位置在該特異HBV抹中可能發(fā)生在32位的核芬酸位置上。盡管 如此，通過(guò)對(duì)兩個(gè)序列的比對(duì)，能很容易地說(shuō)明HBV抹上的32位的核 苷酸位置對(duì)應(yīng)于SEQ IDN0:1上的31位的核苷酸位置。如本發(fā)明所述， 使用諸如BLAST的比對(duì)算法能在HBV分離物的基因組中確定對(duì)應(yīng)的核 苷酸。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1所示為用于擴(kuò)增HBV基因組區(qū)域的引物位置及產(chǎn)生的相對(duì)于 HBV基因組的擴(kuò)增片段的位置，在附圖底部用直線表示該HBV基因組。圖2A和圖2B所示為示例性的B基因型HBV的分離物的基因組(SEQ IDNO:l)，其包括與HCC發(fā)生相關(guān)的標(biāo)記出的核苷酸。圖3A和圖3B所示為示例性的Cl基因型HBV分離物的基因組(SEQ IDNO:2)，其包括與HCC發(fā)生相關(guān)的標(biāo)記出的核苷酸。圖4A和圖4B所示為示例性的C2基因型HBV分離物的基因組(SEQ IDN0:3)，其包括與HCC發(fā)生相關(guān)的標(biāo)記出的核苷酸。具體實(shí)施方案 I.引言本發(fā)明基于這樣一種發(fā)現(xiàn)，在感染了 HBV的個(gè)體中，HBV的特定序 列變異與肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生相關(guān)。特別地，HBV基因組中以下核苷酸的存在與HCC的發(fā)生相關(guān)31C, 53C, 312C， 799G, 961G, 1165T， 1499G, 1613A, 1762T, 1764A, 1899A, 2170C, 2170G, 2441C, 2525C, 2712C, 2712A或2712G。據(jù)此，本發(fā)明提供了通過(guò)確定感染患者的HBV 變體的核酸序列來(lái)確定感染了 HBV的患者是否具有HCC的遺傳素因。 該方法提供包括檢測(cè)任何與HCC相關(guān)的特異性變體的試劑的試劑盒，以 及應(yīng)用本發(fā)明方法的計(jì)算機(jī)可讀形式。II.確定與HCC相關(guān)的HBV變體可采用多種方法來(lái)確定對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l上、核苷酸的第31, 53， 312, 799， 961， 1165， 1499， 1613, 1762， 1764， 1899, 2170, 2441， 2525和/或2721位和/或本發(fā)明所述其它位置的核香酸。在一些實(shí)施方案中，采用核苷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)HBV基因組特定位置的 核苷酸進(jìn)行確定。并非是對(duì)本發(fā)明的限制，核苷酸測(cè)序的例子包括鏈末 端測(cè)序。參見例如Sanger et al. Prac. Mz/. Jc^Z. 6^4 74:5463-5467 (1977》Sambrook et al" Mo/ecw/ar C7ow/wg， ^丄aZ orato/^y Mawwa/ (2nd ed. 1989); Kriegler, Gewe 7>wis/er awe/五xp/^57'亂' 爿ZaZ orafor_y M2麗a/ (1990);及Ci/AreW尸ratoco/s Mo/ecw/ar 5Zo/ogy (Ausubel et al., eds., 1994))?？稍贖BV基因組或其片段擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。也可以通過(guò)在PCR 過(guò)程中向擴(kuò)增子中選^^性地?fù)饺肟古鸹怂崦傅暮塑账嵋约皩?duì)擴(kuò)增子進(jìn) 行核酸酶消化以產(chǎn)生按大小排列的模板片段對(duì)PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增子進(jìn)行直 接測(cè)序(Porter et al., iVwc/ek^c!Ws i esewc/i 25(8):1611-1617 (1997))?；蛘撸?也能采用如
發(fā)明者安杰蘭·巴托洛梅烏斯, 徐國(guó)榮, 李健康, 梁廣錫, 梁慧儀, 沈祖堯, 莫樹錦, 陳力元 申請(qǐng)人:香港中文大學(xué);醫(yī)院管理局